大鼠、神经调节素和根治性前列腺切除术：概念概述

Novacescu D, Nesiu A, Bardan R, Latcu SC, Dema VF, Croitor A, Raica M, Cut TG, Walter J, Cumpanas AA. Rats, Neuregulins and Radical Prostatectomy: A Conceptual Overview. J Clin Med. 2023 Mar 13;12(6):2208. doi: 10.3390/jcm12062208. PMID: 36983210; PMCID: PMC10051646.

在早期发现的当代，前列腺癌（PC）的初始治疗大多是治愈性的，死亡率已显着降低。此外，初始 PC 诊断的平均年龄有所下降。尽管技术进步，但根治性前列腺切除术（RP）后勃起功能（EF）恢复的可能性在过去十年中没有显着变化。由于术中海绵状神经 （CN） 病变和年轻患者的手术几乎不可避免，RP 后勃起功能障碍 （ED） 现已开始影响这些年轻患者。为了解决这一普遍的局限性，大量的CN病变动物模型研究分析了使用全身/局部治疗在RP后EF恢复。最有希望的是，神经调节素（NRGs）在神经退行性疾病和周围神经损伤模型中都显示出神经营养作用。最近，与以前的治疗对应物相比，神经胶质生长因子2（GGF2）在CN损伤大鼠模型中显示出优越的剂量依赖性神经保护/恢复作用。尽管可能产生影响，但这些初步发现仍然有限且调查不足。为了帮助临床医生，我们的论文回顾了RP ED后的发病机制和目前可用的治疗工具。为了刺激进一步的实验，提供了标准化的制备方案和CN损伤大鼠模型应用的深入分析。最后，我们报告了NRG，如GGF2，及其潜在的革命性临床应用，希望确定相关的未来研究方向。

1. 简介

前列腺癌（PC）是全球男性中第二常见的恶性肿瘤（仅次于肺癌），发病率不断增加。前列腺癌目前占男性癌症死亡总数的~3.8%，是全球第五大死因[1]。泌尿系统恶性肿瘤的重要进展[2，3，4]，特别是PC，包括诊断技术的改进和对发病机制的基本科学理解，以及用于筛查/早期发现和风险分层/治疗决策的临床工具的稳步发展。此外，PC诊断还有卓越且高度特异性的临床方法，包括前列腺特异性抗原（PSA）筛查，多参数磁共振成像（mpMRI），PSA亚型和微核糖核酸（microRNA）。这些方法极大地促进了早期发现[5]。随后，死亡率显著降低，特别是在发达国家（10年西欧~1.100/000万人[2018]），这些新兴的临床工具被更快地整合。肿瘤学结局的改善是由于初始诊断时器官受限性疾病更多，并允许立即治愈性治疗，即根治性手术或放疗[1]。不幸的是，在手术治疗相关发病率方面只取得了适度的改善。术后功能并发症仍然相当常见，并且仍然严重影响PC幸存者的生活质量[6]。

对于预期寿命至少为10年的中高风险前列腺癌患者，RP是最广泛推荐的根治性治疗方法[8]。尽管手术技术和术后管理取得了进步，但近十年来，术后EF恢复的可能性没有显著变化[9]。同时，随着我们进入当前PC治疗性治疗管理的主要时代，PC初始诊断的平均年龄下降，而整体预期寿命稳步增加。因此，由于术中海绵状神经 （CN） 丛病变导致的 RP 相关并发症现已开始影响更年轻的患者。因此，目前，特别是当肿瘤局部区域扩展允许使用保留神经的RP技术时，术后功能恢复已成为最重要的手术目标。由于固有的盆腔区域解剖结构易感，即使由最有经验的外科医生手，无论采用何种手术技术或方法，RP期间通常也会发生一定程度的CN损伤[10]。需要额外的策略来改善RP后的EF结局，因为当代治疗方式（即康复方案）只能提供更快的EF恢复，而不是更好的整体恢复率[11]。目前正在进行积极的研究，旨在更好地理解并希望确定CN病变相关病理学的治愈性治疗方法。即便如此，就目前而言，对显著改善RP ED后临床管理的普遍需求仍未得到解决，需要进一步分析。

为了进一步追求开发新型治疗和/或预防性临床工具的总体科学目标，旨在重塑神经元损伤相关泌尿系统病理学的持续低效格局[12]，特别是RP相关发病率，已经开发并在各种实验环境中使用了多种动物模型。尽管不完美，但许多动物物种和人类之间的生理相似性允许复制和分析影响人类的疾病发病机制所涉及的某些关键生物过程。此外，这些模型可以更容易和侵入性地操纵，即转基因，暴露于新的实验分子，和/或接受广泛的外科手术，促进在精确控制的环境中更及时，更合乎道德和更具成本效益地探索特定干预措施及其后续效果。此外，实验动物模型研究设计通常提供有据可查的标准化方法学方案，这意味着这些研究提供了高水平的可重复性，提高了结果的可靠性和可重复性[13]。

已经发表了大量利用CN病变动物模型的研究，分析了全身和局部治疗方式的使用来帮助EF恢复。最有希望的是，神经调节素（NRGs）已经证明了它们的神经营养作用，无论是对中枢神经系统退行性疾病，还是在周围神经损伤的背景下。最近，一项开创性研究利用成熟且普遍首选的CN病变大鼠模型提供了一致的实验数据，支持使用神经调节素-1β3 II型，即神经胶质生长因子2（GGF2），作为一种新的全身治疗方式，与先前分析的治疗对应物相比，具有远优于剂量依赖性神经保护和神经恢复作用[14].然而，这些初步发现虽然可能产生影响，但仍然有限且不一致，因为关于GGF2剂量和姿势的方案仍然不标准化，即损伤前联合静脉给药和手术时局部给药。

本文的总体目标是在为RP ED后管理制定综合和临床上有效的预防/恢复策略的繁琐过程中提供进一步的帮助。最初，作者建立了有关RP ED后发病机制的当代科学背景，同时还回顾了临床医生目前可用的疾病特异性治疗策略。随后，分析了CN病变动物模型中有关新兴治疗剂及其报告的反应率的当前可用实验数据。此外，为了澄清目前可用的CN病变动物模型制备方案之间挥之不去的方法学不一致，提供了对最常用且通常首选的CN病变大鼠模型的深入分析。为了方法上的同质性，制定了综合标准化的手术准备方案，作为进一步研究设计的参考。最后，综述了NRGs近年来极具前景的神经保护和/或神经再生作用，试图进一步探索新的相关未来研究方向及其潜在的临床应用。

2. 根治性前列腺切除术相关发病机制

RP的肿瘤学目标是实现前列腺癌组织的完全切除，以治愈PC患者。外科手术包括切除整个前列腺，其囊完好无损，以及精囊和远端输精管，然后进行膀胱 - 尿道吻合术。此外，对于高危病例，可能还需要行双侧髂闭孔盆腔淋巴结切除术。手术方法已经有了很大的发展，从开放会阴/耻骨后入路到更新的腹腔镜和机器人辅助技术。重要的是，手术复杂性的增加、相关的重建手术挑战以及骨盆区域固有的解剖学特性极大地促进了重大术后并发症的发生。因此，该手术的总体目标不仅是根治性肿瘤切除术，而且是最大限度地保持患者的生活质量[15]。

从本质上讲，在术后晚期，RP 后发生的并发症主要有两种类型，即梗阻性，即吻合口狭窄、尿道狭窄、尿道狭窄;和功能性，即阳痿和尿失禁。关于梗阻性并发症，有多种内镜治疗方式可供选择，并提供合理的成功率。令人困惑的是，关于RP后功能并发症，尽管近年来主要由于RP手术策略的技术和概念进步，尿失禁的发生率稳步下降，但RP后ED的患病率仍然不成比例[16]。RP ED后通常是由于局部自主神经支配几乎不可避免的术中损伤而发生的，尤其是在背外侧前列腺夹层期间。这种损伤可能是机械性诱发的（神经分裂、挤压或拉伸），也可能继发于热损伤、缺血和/或局部炎症反应[14]，随后出现损伤神经纤维的瓦勒氏变性和神经调节组织氧合失调。这些并发症更难治疗，到目前为止，还没有制定具体的治愈性治疗方案。

相反，生物标志物和现代多模态成像的不断增加[17]确实极大地促进了PC诊断、临床分期和风险分层以及RP手术计划。具体而言，mpMRI和靶向活检彻底改变了PC的诊断和管理。MpMRI结合了解剖成像技术（T2加权成像）和功能成像技术（动态对比增强MRI、弥散加权MRI和磁共振波谱），可提供卓越的成像能力，能够准确识别前列腺中的可疑区域，从而减少不必要的活检并增加对具有临床意义的PC的检出[18].与传统的系统活检相比，在mpMRI引导下，靶向活检更能准确检测PC病变，且有临床意义的疾病检出率更高[19，20，21]。此外，mpMRI可以通过提供有关前列腺内癌症位置和范围的详细解剖信息，并准确预测前列腺外延伸，精囊浸润和淋巴结转移的位置和程度，在机器人RP期间帮助外科医生，这些都是在计划保留神经技术（即，在， 筋膜间或筋膜外神经保留）[22，23，24]。

2.1. 易感解剖学注意事项

在人类男性中，下下胃丛，也称为盆丛，代表盆腔的中央神经支配枢纽。下胃丛构成一个复杂的神经网络，位于膀胱底部附近，直肠前方，由于腰交感神经节的交感神经纤维和骶脊髓的副交感神经纤维的收敛和混合而出现，它们为主盆腔内脏提供自主神经支配，即 膀胱、直肠和男性生殖器官——精囊、输精管、前列腺和阴茎。此外，该神经丛还有助于会阴和肛门的感觉神经支配[25]。

下下胃丛的解剖关系复杂，累及盆腔区域内的多个结构（图1).下下胃丛的一些关键解剖关系包括靠近膀胱底部和膀胱后下壁、直肠前侧以及靠近主要血管（主动脉和髂内动脉）[25]。总体而言，下下胃丛的解剖关系很复杂，涉及盆腔区域内的多个结构。了解这些关系对于诊断和治疗各种盆腔疾病非常重要。

图1

人类男性盆腔解剖学，矢状视图。插图改编自亚瑟·伯内特[26]。

CN是一对副交感神经，起源于下下胃丛（或盆腔丛），沿着前列腺的外侧延伸，进入阴茎底部的海绵体（图2它们负责调节进入勃起组织的血流，并在性唤起和勃起的生理机制中起着至关重要的作用。更具体地说，CN由小的有髓鞘和无髓鞘神经纤维组成，负责调节血管内的顶平滑肌张力，从而能够增加流向海绵体的血流量，导致勃起[27]。因此，对CN的广泛损害将导致ED。因此，CN的解剖结构对于正常的性功能至关重要，其正常功能对于维持性健康至关重要。

图2

人类男性骨盆解剖结构的比较图，斜视图：（a）基本生理布局;（b）双侧保留神经的根治性前列腺切除术后。插图改编自Arthur L. Burnett[26]。

一般而言，无论是前列腺、膀胱还是结直肠恶性肿瘤，盆腔手术通常会导致ED的高发病率，这是由于CNs（阴茎的主要自主神经支配）的创伤[14]。尽管最近在手术技术（保留神经的操作）和设备（机器人辅助方法）方面均取得了进展，但这些类型的神经系统病变仍然普遍存在，几乎不可避免，在双侧保留CN的手术后，只有不到40%的患者恢复EF，足以进行[14，28，29] (图2然而，无论采用何种手术技术和/或方法，RP后ED的发生率仍然很高，是一个严重的问题，特别是在年轻患者中[30]。因此，在早期发现的时代，前列腺癌的初始治疗大多是治愈性的，诊断年龄下降，而预期寿命稳步增加。术后功能恢复已成为进行RP时最重要的手术目标。

2.2. 保留神经根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的病理生理学

在生理学环境中，盆腔丛是勃起神经支配的起源。CN包含副交感神经纤维和交感神经纤维，近端神经节区包含有髓鞘和无髓鞘纤维。这种构象逐渐在远端发生变化，有髓鞘纤维较少，直到进入胳膊点，其中CN几乎完全由无髓鞘轴突组成。因此，无髓鞘轴突是CN纤维的一部分，为神经支配提供神经递质，其中最重要的是NO[14，31，32]。性刺激在这些纤维水平上产生NO释放，然后通过放松顶动脉和小动脉平滑肌纤维诱导流向勃起组织的含氧血流量增加[33]。增加的血流量产生作用于内皮的膨胀力，导致内皮细胞持续释放一氧化氮合酶（eNOS）。这种机制对于前勃起以及长期维持身体健康至关重要[34]。即使由最有经验的外科医生治疗，无论采用何种手术技术或方法，RP期间也会发生一定程度的CN损伤[35]。这种神经损伤可由手术期间回缩损伤、电灼损伤、神经血管系统破坏或压迫创伤后局部炎症猖獗引起[36]。这种手术创伤是副交感神经功能受损的致病因素，表现为ED[37]。

术后神经损伤会诱发组织缺氧，进而导致NO产生减少，从而形成恶性循环，同时减少抗纤维化保护介质的产生[30]，导致纤维结缔组织积聚伴平滑肌凋亡（图3).这些不可逆的纤维化变化会降低组织弹性，使难以扩张[35]。因此，CN的急性术中病变在海绵体内启动了结构和代谢修饰的慢性，不可逆的恶性循环。

图3

阴茎的比较轴向解剖切片，说明了海绵体内纤维化结缔组织堆积的进行过程。插图改编自米连科维奇等[38]。

除了血管闭塞性疾病外，胶原蛋白的沉积可能是由于平滑肌（不是内皮）的细胞凋亡，特别是在膜下区域，导致海绵体静脉闭塞机制功能障碍。这些机制是随后大量体静脉渗漏的病因学基础[39]，因此增加了ED的继发性静脉成分（图4).因此，虽然偶尔使用勃起药物治疗可能会导致短暂勃起，尤其是手术后早期，但勃起所涉及的正常生理过程的潜在长期恶化已经在进行中[39]。

图4

根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的病理生理学。pO2= 氧气分压;改编自穆尔霍尔等人[40]。

总之，RP 后 ED 是由干扰促进海绵体氧合的神经系统机制引起的，导致纤维化。通过神经调节机制及时重建组织氧合至关重要。目前可用的RP后ED管理方案都具有重建组织氧合的相同原理，但不能解决因果问题，即CN损伤，仅解决后期术后环境的后果，使得临床应用，例如CN病变的标准化围手术期全身预防，是一个非常理想的结果。

3. 根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的当前治疗选择

尽管ED有多种治疗方式（磷酸二酯酶5抑制剂、真空勃起装置、尿道内前列腺素E1类似物栓剂治疗和TriMix海绵体内注射（罂粟碱、酚妥拉明和PGE1（假体植入术）），但RPED后序贯治疗管理的适当且未经反驳验证的临床指南尚未标准化[30].Moskovic等人先前已经制定了康复方案[39]，试图将治疗方法系统化并限制海绵体纤维化，将PDE-5抑制剂作为RP后ED的一线治疗，真空勃起装置、PGE1类似物的局部输送系统和海绵体内注射作为PDE-5抑制剂无应答者的替代药物。在该模型中，假体植入是最终的解决方案，仅适用于那些在39年评估期后对最大保守治疗持续无效的难治性患者[<>]。尽管如此，功能结果不大，术后ED仍然是RP后发病的主要原因。

RP 后患者易患 ED 的机制的复杂性表明，在没有术中 CN 损伤的因果预防策略的情况下，需要多点干预来预防这些患者发生 ED。最重要的是，已经指出组织氧合可能会降低慢性炎症和海绵体纤维化的患病率[41]，但有趣的是，CN损伤动物模型中的高压氧治疗尚未被证明可以显着逆转或最小化这一过程，这表明涉及多种机制[41].其次，组织纤维化和炎症的细胞因子介质是药物治疗的靶标，旨在保持海绵体组织的完整性。保留勃起的概念以尽量减少损害长期勃起功能的因素为前提，尽管这种策略并不代表治愈性病因治疗，仅用于限制损害，而不是完全防止其发生。因此，目前针对上述机制（连续CN损伤）的治疗策略仍无法为患者提供最佳功能结局[39]。

Capogrosso等人于2019年发表的一篇文献综述得出结论，尽管RP治疗患者的手术技术和术后管理取得了进步，但在过去十年中，在单个高容量中心，术后EF恢复的可能性没有显著变化[9]。需要额外的策略来改善RP后的EF结局，因为康复只能提供更快的EF恢复，而不是更好的整体恢复率。关于CN病变相关病理学的积极研究正在进行中，因为对改进ED治疗策略的迫切需求仍未得到解决。

最近，利用CN病变大鼠模型，在实验环境中研究了一种新的治疗方法，通过建立基于围手术期神经调节素的GGF2全身治疗的标准化方案，以预防性、神经保护的方式解决这些CN病变[14]。希望术前给予GGF2将进一步证明其神经营养作用，使临床上显着的CN病变更难发生，同时也再次确认GGF2在术后环境中的神经恢复特性，更清楚地量化所涉及的分子机制。因此，预防性干预将专门针对病因（随后的瓦勒变性神经损伤），而不是连续的代谢效应，甚至在疾病发生之前治愈疾病。

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4. 海绵状神经病变大鼠模型

Quinlan等人于1989年首次描述了CN病变的大鼠模型[42]，在接下来的几十年中，已经发表了大量研究[43，44，45]，利用该动物模型作为分析各种治疗原理效果的手段，旨在缓解ED，自主神经病变后，即通常参考RP的临床背景， 在受控的实验环境中通过该动物模型进行复制。

4.1. 海绵状神经病变大鼠模型的优点和局限性

上述CN病变大鼠模型代表了在人类中复制RP ED后临床背景的最普遍使用和通常首选的动物模型，因为它比其他现有模型具有多种优势。首先，也是最重要的，这个特定模型的解剖结构本质上有利于CN制备，控制损伤和介入治疗实验。更具体地说，在雄性大鼠中，CN可以在盆腔内双侧分离，作为形态上不同的个体神经，而不是人类所见的自主神经丛。这种单一的神经解剖结构有助于识别、解剖和操作[42]。此外，神经传导可以通过体内插管和随后的体内勃起压力记录轻松客观地量化。因此，CN损伤相关的传导缺陷以及恢复性干预的功能效果也可以通过比较分析体内压（ICP）值相对于平均动脉压（MAP）的改变来客观地评估，分别通过CN的标准化电刺激，在损伤诱导和治疗干预之前和之后。最后，大鼠模型的成本效益构成了同样重要的实际优势[46]。

相反，与前面讨论的相对于其他现有动物模型的优势相比，CN病变大鼠模型也存在许多实验限制。首先，绝大多数先前的报道都集中在这种特定的大鼠模型上，通常仅使用年轻健康的动物标本进行CN病变制备，而从概念角度来看，这种设计并不能准确反映PC发病率的临床现实[47]。在大多数情况下，PC通常仍见于老年男性，伴有重要的潜在微血管病合并症（即糖尿病、肥胖、酒精和烟草成瘾、慢性肾脏病、心血管和神经系统疾病），这需要一定程度的缺氧海绵体修饰[48]。因此，在这个老年PC人群中，RP CN损伤实际上将通过额外强调这些预先存在的海绵体修饰而产生累积效应，而在年轻，其他方面健康的患者中，RP将代表海绵体组织纤维化转化的初始主要首发事件。

值得注意的是，Sato等人（2001）在一篇开创性的论文中揭示了该模型的另一个固有局限性，该论文确定并表征了慢性环境中大鼠辅助神经纤维在慢性环境中CN损伤后的恢复作用[49]。中枢神经系统刺激，即使在双侧CN横断后，也显示出显著的反应率，ICP值持续升高。相比之下，在完全双侧盆腔神经横断（即包括辅助神经纤维）后，ICP反应被取消。这些烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸透波酶 （NADPH-d） 纤维也起源于主要盆腔神经节 （MPG） （图5），与CNs有互补作用，与阴茎的自主神经支配有关，对中枢神经系统刺激后的ICP反应贡献40%-50%[49]。这可能是在没有明显合并症的情况下，CN病变的大鼠在~6个月后会自发恢复勃起功能的原因之一[50]。另一个问题，特别是在慢性研究中，是所给予治疗的洗脱时间不足，这可能导致由于治疗的持续存在和效果而导致对EF恢复的误解。

图5

大鼠模型盆腔解剖学的侧视图。插图改编自昆兰等人[34]。

4.2. 海绵状神经大鼠模型的解剖学和标准制备方案

解剖解剖显示前列腺外侧的双侧神经节称为MPG（图5).该神经节接收来自盆腔和下胃神经的输入并支配盆腔内脏。来自盆腔主要神经节的大纤维沿着尿道流淌并支配海绵体CN[42]。

作为大鼠模型准备的实际考虑因素，术前评估手术策略和必要设备的可用性对于实验结果的准确性至关重要。通常首选的大鼠种类是Sprague Dawley大鼠，在急性CN损伤评估研究中通常为~12周龄[51]。吸入异氟醚麻醉，为了更好地控制模型的麻醉，以保持足够的血压，强烈建议使用。手术视野可视化需要低倍率手术显微镜或显微手术放大镜，以及带有足够电灼工具的显微手术套件。连接到相距 3 mm 的双虾电极的电刺激器似乎是正确刺激机械病变部位近端 CN 的理想设置。为了准确记录MAP和ICP变化，适当调整的压力传感器和记录设备对于功能响应结果的有效性至关重要[52]。

关键地形区域的实际解剖准备所涉及的手术策略是多方面的，必须事先进行彻底评估。为了实验设计的准确性，通常需要对CN进行双侧解剖以允许电刺激，以及颈动脉和海绵体插管分别用于MAP和ICP测量[52]。关于CN手术损伤的标准化，挤压病变模型在全身和局部术中治疗实验中通常更受欢迎，而不是更极端的切割病变模型，后者需要随后的微神经血管。

对于大鼠CN制剂，将动物置于全身麻醉下并以仰卧位置固定在试管架上。做一个3-4厘米的切口下中线切口，注意避开阴茎的深背静脉。膀胱位于腹壁分裂的肌肉下方，用Allis镊子抓住并通过解剖进行动员。对腹壁的任何粘连都是分开的。夹层向尾部推进，膀胱和前列腺横向动员，露出精囊和输精管。然后解剖输精管，并上部动员，以便可视化前列腺的背侧。然后清除输精管和前列腺背叶之间的区域，以暴露CN（图5).钝性夹层用于清除前列腺背侧的外阴层。靠近前列腺的是盆腔静脉，需要小心地将其推离腺体以避免出血。MPG 位于头颅，位于前列腺的外侧（图5).CN从MPG起源并沿着前列腺向尿道延伸。存在覆盖的血管，通常可以避免。初始刺激基线ICP后，进行神经病变[52，53，54]。

为了获得ICP测量值，阴茎被包皮环切，剥去皮肤，并与周围组织分离。球海绵状肌周围形成一个空间。自保持牵开器在此阶段很有用。阴茎的直径很小，因此准确放置针头以测量ICP至关重要。在其与耻骨下支的连接处，可以清楚地识别坐骨海绵体肌。这块肌肉需要用弯曲的镊子小心地从周围组织和下面的白被膜中分离出来，然后分开以露出白色的被毛。然后将 21 号针头通入体体以测量压力。由于体积小，只需要将针的斜面插入体内即可。为了确保准确放置，可以通过管路冲洗少量肝素化盐水。如果针头放置正确，应有轻微的肿胀[52，53，54]。

为了获得MAP测量值，在下颌骨和胸骨中间的颈部做一个横向切口。鸭嘴肌包含上颌下腺体。在这些腺体下方做一个切口，并在肌肉下小心地开发一个空间，以免引起浅静脉出血，如果需要，可以用烧灼控制。现在可以可视化颈部的带状肌肉。胸骨舌骨肌在气管上切开，并开发产生的空间以识别颈动脉的搏动鞘。动脉被尖锐地解剖，没有鞘。将迷走神经与动脉分离很重要，因为意外将其包含在以下结扎中会产生可怕的血流动力学后果。颈动脉向上绑住，然后轻轻拉伸。放置第二个扎带，用于固定管道。最后，将斗牛犬夹放在下部并进行动脉切开术。使用带有弯曲尖端的25g针头，将肝素化聚乙烯管引导到动脉中。先前的扎带用于将管子固定到位，并连接压力传感器以获得MAP[52，53，54]。

为了连接刺激电极，使用弯曲的镊子将电极引导到位。电极放置在海绵状神经与主要盆腔神经节的连接处，靠近病变部位。第一次刺激应显示没有传导，即压力升高，确认病变的疗效。为了标准化，已经开发了CN病变大鼠模型的电刺激方案。例如，欧洲性医学学会 （ESSM） 建议使用以下刺激器设置：脉冲持续时间 - 0.5–1 ms;频率—10–20 Hz;刺激持续时间 - 30-60 秒;电压—2.5–8 V.还建议在两次刺激之间至少保持5-10分钟的休息时间[47]。

收集刺激数据后，对动物实施安乐死。在此阶段，如果需要收集组织样本以进行进一步的形态病理学治疗反应评估，则可以去除背外侧前列腺组织以及MPG和相关CN，以及海绵体。形态学评估可能涉及使用常规染色技术，例如Masson三色染色来评估海绵体中的平滑肌/胶原比例[55]，以及免疫组织化学，以及各种可能的靶标。例如，抗nNOS抗体可用于量化海绵体中的神经元一氧化氮合酶含量[56，57]。此外，S100蛋白免疫染色可能有助于评估MPG中的雪旺细胞群[58]。

4.3. 海绵状神经病变大鼠模型在根治性前列腺切除术后勃起功能障碍实验研究中的先前应用

几十年来，在大量的CN病变大鼠模型实验研究中投入的持续和仍在进行的科学努力，提供了有关使用各种全身和局部治疗方式试图帮助EF恢复的重要数据。其中，西地那非已被证明在CN挤压损伤大鼠模型中使用时可以保存EF。这种治疗特性似乎主要通过增强平滑肌内容物和内皮功能的保存以及减少海绵状勃起组织细胞凋亡来实现[53]。

最近，Yamashita等人通过在RP诱导的CN病变的大鼠模型复制品中围手术期施用托珠单抗（抗大鼠IL-6抗体）来评估IL-6介导的炎症反应在RP后ED发展中的作用。调查报告CN损伤后MPG中急性期白细胞介素（IL）-6表达增加。相反，IL-6生物活性抑制在CN简单解剖后明显减弱ED（即，没有明显的损伤），这反映在ICP对刺激的反应率增加。因此，在急性期抑制过度炎症反应可能导致保留神经的RP后ED的改善[59]。同样，Albersen等人在上述大鼠模型中使用己酮可可碱（一种磷酸二酯酶抑制剂，可进一步下调涉及神经变性，细胞凋亡和纤维化的多种细胞因子途径）来改善EF恢复，增强神经再生，并在CN挤压损伤后保留海绵体微结构[60].此外，Mulhall等人的一项值得注意的研究在双侧CN挤压病变大鼠模型中使用了FK506（他克莫司），这是一种已知可预防轴突变性的免疫调节性免疫亲配体，并获得了CN损伤后EF保存的有希望的结果[61]。遗憾的是，在最近的一项随机、双盲、安慰剂对照随访人体试验中，尽管有支持性的实验数据，但他克莫司在RP后EF恢复方面未能证明其优于安慰剂[62]。

最后，在模拟RP的动物模型中研究了各种局部和全身神经调节剂，以保护或再生CN功能并促进勃起恢复，一些发现表明潜在的临床益处。这些药物包括其他免疫亲蛋白配体、神经营养因子、生长因子、雪旺细胞种子引导管、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、声波刺猬蛋白、非典型神经营养因子、神经导板、组织工程/干细胞治疗和基因治疗[63，64，65，66，67]。然而，临床上尚无针对CN神经保护或神经再生的治疗方法[66]。因此，目前仍在开展研究工作，以确定和制定在RP临床情况下有效保留CN功能的理想策略[14]。

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5. 神经调节素、GGF2及根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的未来治疗前景

NRG是影响全身细胞存活、增殖、分化和器官发生的多效性生长因子。它们的作用是通过与经膜受体蛋白酪氨酸激酶ErbB家族的相互作用以及随后下游细胞内信号传导事件的激活介导的[68]。ErbB家族包括四种受体酪氨酸激酶，在结构上与表皮生长因子受体（EGFR）相关，即第一个发现的ErbB家族成员。在人类中，ErbB家族包括Her1（EGFR，ErbB1），Her2（Neu，ErbB2），Her3（ErbB3）和Her4（ErbB4）[69]。

换句话说，术语NRG是指结构相关的信号蛋白亚群，能够结合ErbB受体酪氨酸激酶（ErbB2-4），从而介导神经元[70，71，72]和非神经组织中的无数细胞功能，包括存活，增殖和分化[73，74，75].这些肽生长因子由几个不同的研究小组在二十多年前独立发现，最初分别被描述为neu分化因子（NDFs）、heregulins、神经胶质生长因子（GGFs）、乙酰胆碱受体诱导活性（ARIA）以及感觉和运动神经元衍生因子（SMDF）[76，77]。目前，已经确定所有这些NRG蛋白都由同一基因编码，即NRG-1[70，78]。事实上，到目前为止，已经鉴定出四种编码脊椎动物NRG的基因，即NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4。其中，NRG-1基因的特征最充分[79]。

先前已对整个人类NRG-1基因进行测序[79]。由于多种促子的使用和替代剪接，NRG-1表现出转录异质性，产生超过30种蛋白质亚型，其中包括上述NDF、heregulins、GGF、ARIA和SMDF[77，78，79，80]。NRG-2、NRG-3和NRG-4基因也会产生多个剪接变体。NRG蛋白中最重要的部分是EGF样结构域，其本身足以用于受体结合和细胞内信号通路的刺激[81]。因此，这种EGF样结构域对于NRG蛋白的生物活性既必要又充分。该结构域的替代剪接变体产生α/β转录本[82]。

此外，NRG-1亚型已根据其细胞外氨基末端结构域的变异性进一步分为六种不同的亚型。更具体地说，NRG-1转录本I，II，IV和V型具有免疫球蛋白样（IgG样）结构域，其之后可能具有富含糖基化的区域（I型）或GGF特异性kringle结构域（II型）。III型NRG-1转录本呈现典型的细胞外EGF结构域，但其独特之处在于包含富含半胱氨酸的结构域，该结构域在其N末端序列中循环回去。显然，除III型外，所有类型的NRG-1蛋白既有经膜形式，也有分泌形式，这取决于亚型最初是作为经膜蛋白还是非膜蛋白合成的[70，77，79]。这些构象差异可能被证明对于理解NRGs不同生物学效应背后的潜在代谢组学至关重要。

NRGs在中枢神经系统中的表达和新兴的神经营养、神经保护和神经调节作用已有详细记载[82]。多项实验研究，特别是针对中枢神经系统退行性疾病，如多发性硬化症或阿尔茨海默病，已经报道了相对有希望的结果[83]。然而，NRGs在外周神经损伤相关疾病中的作用目前仍未得到充分研究。

雪旺细胞是周围神经系统的主要神经胶质细胞，对神经元的存活和功能至关重要。它们参与沿轴突传导神经冲动、神经发育、神经元营养支持和神经再生[84]。长时间施旺细胞不接触轴突的主要原因是周围神经损伤后功能恢复非常差的原因，因为去神经支配的雪旺细胞因细胞凋亡或萎缩而死亡，并且不支持轴突生长[85]。NRG-1基因在周围神经系统发育过程中的轴突-神经胶质信号传导中起关键作用[70]。此外，这种生长因子在成年期因其神经保护和神经恢复特性而越来越得到认可，可以想象，这是通过介导轴突和雪旺细胞之间的信号，这是有效神经修复所必需的[70，73]。鉴于这些神经保护作用，NRG是保护CN和在RP后保留EF的有吸引力的候选者。

已知GGF2，即神经调节素-1β3 II型，NRG-1基因的可溶性全长剪接变体[70]，可促进轴突完整性。即便如此，据我们所知，目前只有一篇出版物在RP相关CN损伤的大鼠模型中调查了GGF2对双侧CN挤压伤（BCNCI）后EF的影响。2015年，Burnett等人发表了上述论文，证明GGF2全身治疗在CN损伤前开始，促进了大鼠EF的恢复，同时也保留了损伤CN中的无髓鞘神经纤维。鉴于这些结果，GGF2作为盆腔手术（包括RP）的神经保护疗法的进一步临床评估是强制性的，但仍未得到解决。在手术领域外远程递送GGF2的能力，以及在CN损伤前对实验模型进行预处理的能力，是潜在临床转化的关键优势[14]。

如 中总结表1，Burnett等人建立了两个研究方案，用于BCNCI后的GGF2治疗反应评估。

方案1旨在复制重度CN病变，用锯齿状止血器诱导BCNCI，在恒定的“一键式”压力下诱导2min/侧[86]。然后根据GGF8给药姿势，在BCNCI之后，将该严重CN病变大鼠群随机分为10组（2-2个标本/组），即没有GGF0的载体;5.2毫克GGF5/公斤;和 2 毫克 GGF2/kg。第四组进行了假手术，并接受了车辆治疗。在方案3中，对于中度CN病变，使用精细止血器诱导BCNCI87分钟[10]。在BCNCI之后，根据相同的GGF12给药姿势，动物再次随机分为三组（2-2 /组）：没有GGF5的载体;2毫克GGF15/公斤;和 2 毫克 GGF10/kg。此外，第四组和第五组各有12-15个标本，分别为假手术+载体和假手术+ 2mg的GGF14 / kg。假手术是通过暴露CN但不操纵它们来完成的[<>]。

表1

根据CN损伤方案和所应用的治疗，CN病变大鼠模型群体的分布，如Burnett等人报道[14]。

在单独的窗口中打开

*—双侧CN挤压伤;**—神经胶质生长因子

2.GGF2和载体在BCNCI前24小时皮下给药，BCNCI后24小时，然后每周一次，直到研究期结束，BCNCI后5周。治疗以盲法进行。这些实验中使用的GGF2的时间和剂量都在既往研究使用的范围内[88，89]。载体含有 20 mM 乙酸钠、100 mM 硫酸钠、1% 甘露醇和 100 mM L-精氨酸 （pH 6.5）。治疗5周后，通过体内ICP对CN电刺激的反应、逆行氟金示踪和CN的电子显微镜检查来量化效果[14]。

关于体内ICP对CN电刺激的反应，结果表明，GGF2在重度和中度BCNCI后均改善EF，最大ICP恢复到方案50未受伤水平的~1%，几乎与方案2中的假手术动物水平相当。CN内的完整神经元最初通过逆行氟金标记进行评估以供参考。在严格的BCNCI和载体处理（方案1）之后，MPG中氟金标记的细胞数量减少了近80%。用0.5mg / kg和5mg / kg的GGF2治疗后，细胞计数分别显着增加~50%和70%，但与假手术组相比，它们仍然显着降低。此外，与假手术和GGF2处理的BCNCI组相比，CN的代表性电子显微镜图像显示BCNCI +载体组中的去神经支配雪旺细胞和更多退化的无髓鞘轴突。这些结果表明，GGF2在BCNI后保护神经纤维，同时保留CN中的无髓鞘神经纤维[14]。

尽管如此，关于GGF2对CN病变大鼠模型的影响，仍有一些问题尚未解决。GGF2的确切靶标以及CN损伤后保持CN传导和EF的固有代谢机制值得进一步研究。在周围神经损伤的背景下，体外研究表明NRG-1 II.型在雪旺细胞和巨噬细胞迁移中的作用，这意味着NRG-1在瓦勒氏变性的初始阶段具有潜在作用[90]。神经挤压损伤后GGF2诱导的雪旺细胞迁移归因于诱导α5β1整合素-ErbB2受体-FAK复合物形成[91]。除神经细胞外，多种其他细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和心肌细胞）也表达 ErbB 受体，并通过生长和分化对 NRG 做出反应。因此，GGF2可能作用于CN和海绵体内的不同细胞类型，以发挥其神经保护或神经再生作用。GGF2治疗后海绵体的完整性尚未得到充分评估，但可以通过神经元NOS表达和海绵体内平滑肌/胶原比例来定义。此外，MPG内以及海绵体内ErbB受体的免疫定位表明GGF2在保护神经支配方面的作用位点[14]。

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6. 结论

总体而言，当代PC死亡率与诊断时的平均年龄一起显着下降。相比之下，RP 后 EF 恢复的可能性在过去十年中保持不变。因此，由于术中几乎不可避免的CN病变，RP ED后现在已经开始影响更年轻的患者。为了解决RP相关的发病率，已经开发了几种CN病变动物模型，但由于其良好的解剖结构，低成本以及高度的标准化和可重复性，特别是大鼠模型仍然是普遍的首选。利用该大鼠模型，已经评估了对旨在促进RP后EF恢复的各种治疗原则的反应率。最近，NRGs在开发突破性临床应用方面显示出显着的潜力，在神经退行性疾病和周围神经损伤模型中都显示出神经营养作用。最重要的是，与先前研究的治疗对应物相比，GGF2最近在BCNCI大鼠模型中显示出优越的剂量依赖性神经保护/恢复作用。即便如此，这些初步结果仍然非常有限，关于GGF2组织靶标，分子病理学和代谢组学以及理想的给药途径和姿势学，挥之不去的问题仍未得到研究。这种巨大的潜力迫切需要进一步的科学承诺。

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