科研丨成中医: 白术挥发油通过调节肠道菌群和肠道菌群代谢缓解急性溃疡性结肠炎(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

白术(Atractylodes macrocephala Koidz.，AM)是一种具有较强抗结肠炎活性的功能性食品。AM挥发油(AVO)是AM的主要活性成分。然而，目前还没有研究表明AVO对溃疡性结肠炎(UC)的改善作用，其生物活性机制也尚不清楚。本研究从肠道微生物群的角度探讨了AVO是否对急性结肠炎小鼠具有改善作用及其机制。用硫酸葡聚糖钠诱导C57BL/6小鼠急性UC，并用AVO治疗。对体重、结肠长度、结肠组织病理学等进行评估。使用16S rRNA测序分析肠道微生物群组成，并进行了粪便代谢组学分析。结果表明，AVO可以减轻结肠炎小鼠的出血性腹泻、结肠损伤和结肠炎症。此外，AVO减少了潜在的有害细菌(Turicibacter、Parastertella和Erysipelatoclosstridium)，并富集了潜在的有益细菌(Enterorhabdus、Parvibacter和Akkermansia)。代谢组学分析发现，AVO通过调节参与102个KEGG途径的56种肠道微生物代谢产物来改变肠道微生物群代谢。在这些KEGG途径中，许多代谢途径在维持肠道内稳态方面发挥着重要作用，如氨基酸代谢(尤其是色氨酸代谢)、胆汁酸代谢和视黄醇代谢。综上所述，本研究表明，AVO有望成为治疗溃疡性结肠炎的新型益生元，调节肠道微生物群的组成和代谢可能是其药理机制。  

论文ID

原名：Atractylodes macrocephala Koidz. volatile oil relieves acute ulcerative colitis via regulating gut microbiota and gut microbiota metabolism

译名：白术挥发油通过调节肠道菌群和肠道菌群代谢缓解急性溃疡性结肠炎

期刊：Frontiers in Immunology

IF：8.786

发表时间：2023.5

通讯作者：彭成，冯五文

通讯作者单位：成都中医药大学药学院

DOI号：10.3389/fimmu.2023.1127785

实验设计

结果

1 白术挥发油成分

如表1和图1所示，通过GC-MS分析，在AVO中成功鉴定出19种成分。主要成分为苍术酮(78.82%)、3-亚丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮(4.74%)、(Z)-3-butylidene-4, 5-dihydroisob (2.72%)、桉油烯醇(1.80%)、(Z)-丁烯基苯酞(1.69%)和3-丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮(1.17%)。这6种化合物占AVO的90.94%，其中苍术酮是AVO的代表成分。

图1. 白术挥发油( Atractylodes macrocephala  Koidz. volatile oil，AVO)的GC-MS特征图谱。

表1. AVO的特征成分。

2 白术挥发油对结肠炎小鼠的影响

为了评估AVO对UC的疗效，我们记录了UC小鼠在DSS攻毒和AVO治疗期间的表型。在本研究中，DSS攻毒导致体重显著减轻，AVO治疗阻止了DSS引起的体重减轻，尽管没有统计学意义(图2B)。此外，与C组相比，我们在M组小鼠中观察到明显的出血性腹泻，AVO治疗显著缓解了出血性腹泻(图2C、D)。通过解剖学分析，我们发现DSS刺激后小鼠的结肠长度缩短，AVO治疗显著缓解了DSS诱导的结肠缩短(图2E)。此外，我们在小鼠结肠组织中检测到免疫相关细胞因子。如图3A–D所示，M组小鼠抗炎细胞因子IL-2和IL-4的含量降低，促炎细胞因子IL-17和INF-γ的含量升高。但AVO治疗后IL-2和IL-4的含量增加。H＆E染色结果显示，与C组相比，DSS攻毒导致明显的结肠组织损伤，主要表现为隐窝结构破坏、结肠黏膜破坏和炎症浸润增加。然而，在AVO治疗小鼠中观察到肠道组织损伤明显减轻(图3E)。

图2. AVO对UC小鼠的疗效。

(A)动物分组及处理方法。(B) DSS攻毒和AVO治疗后各组体重变化情况。(C) DSS攻毒和AVO治疗后各组直肠出血评分。(D) DSS攻毒和AVO处理后各组粪便粘度评分。(E) DSS攻毒和AVO治疗后各组结肠长度。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，ns表示P>0.05。

图3. AVO对UC小鼠的疗效。

(A-D)结肠组织中IL-2、IL-4、INF-γ和IL-17的水平。(E) UC小鼠结肠组织H＆E染色结果。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，ns表示P>0.05。  

3 白术挥发油和DSS对肠道微生物群组成的影响

为了确定AVO对UC的生物活性是否与调节GM密切相关，我们测定并分析了小鼠粪便样本中的GM组成。DSS攻毒和AVO治疗后GM组成的变化如图4和图S1所示。Pan和Core曲线分别显示了所有样本中包含的总OTU和共享OTU的数量。随着样本数量的增加，曲线变平坦表明测序的样本量基本达到标准(图S1A、B)。OTU聚类后，所有粪便样本共聚类453个OTU，所有组共聚类294个OTU。在这些OTU中，分别有50、10和19个OTU单独聚集在C组、M组和AVO组中(图4A)。Ace和Chao指数表明，DSS攻毒导致GM丰富度显著降低(图4B、C)。然而，AVO对DSS诱导的GM丰富度降低没有显著影响。此外，分层聚类和三维主坐标分析(PCoA)图显示，DSS攻毒导致GM整体组成的显著变化(图4D，E)。由于M组和AVO组没有明显分离，这表明特定微生物的变化(而不是GM整体结构的变化)与AVO的疗效有关。所有样本中检测到的微生物主要属于厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和Patescibacteria(图4F)。与C组相比，DSS攻毒导致疣微菌门减少，变形菌门增加。与UC小鼠相比，口服AVO后疣微菌门增加，变形菌们减少(图4G)。

除了分析整体结构外，我们还在属水平上深入研究了GM的变化。DSS干预后，5个属Parasterutella、Erysipelatocstridium、Turicibacter、Defluvitalaceae_UCG-011和Family_XIII_AD3011_group富集，3个属Enterorhamdus、Akkermansia和Parvibacter减少。与M组相比，AVO治疗后，Parasterutella、Erysipelatocstridium、Defluvitaleaceae_UCG-011、Turicibacter和Family_XIII_AD3011_group减少，Enterorhamdus、Akkermansia和Parvibacter增加(图5A)。此外，线性判别分析效应大小(LEfSe)分析确定了可能对组间差异有很大贡献的优势微生物(图5B)，Turicibacter、Family_XIII_AD3011_group、Parastutterella、Sphingobacterium、Marvinbryantia、Lachnospiraceaein、Erysipelatoclosstridium和Enterobacteriaceae具有较高的LDA评分，并且是可能导致M组中GM组成改变的关键细菌类型。此外，在AVO组中，Faecalibaculum、Bacteroides、Akkermansia、Coriobacteriaceae_UCG-002、Lachnospiracae_NK4A136_group、Gastranaerophilales、Candidatus_Soleaferrea、GCA-900066575、Eubacterum_brachy_group和Lachnosspiracae_UCG-006的LDA得分较高。结果表明，这些微生物在很大程度上导致了AVO组和其他组之间GM组成的差异。

图4. AVO和DSS对UC小鼠GM整体结构的影响。

(A)三组之间的维恩图。(B) Ace指数。(C) Chao指数。(D)所有粪便样本的分层聚类。(E) 3D PCoA显示了三组之间的相似性和差异性。(F)三组之间的直方图。(G)三组细菌在门水平上的差异。*P≤0.05，**P≤0.01，ns表示P>0.05。

图5. AVO治疗和DSS刺激后属水平GM的变化。

(A)差异细菌。(B)线性判别分析效应大小(LEfSe)。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，ns表示P>0.05。  

4 白术挥发油和DSS对肠道微生物群代谢的修饰作用

除了GM组成外，GM代谢可能与肠道内稳态和AVO对UC的治疗作用有关，因此我们对小鼠粪便样本进行了代谢组学分析。从PCA得分图(图6A、B、图S2A-D)可以看出，三组在正离子模式和负离子模式下相互分离。这些结果表明，DSS和AVO显著影响GM代谢。这些变量符合方法中描述的标准，如火山图所示，这些变量有助于两组之间的分离(图6C-F)。

图6. DSS和AVO调节GM代谢。

(A)正离子模式下所有样本的PCA得分图。(B)负离子模式下所有样本的PCA得分图。(C)火山图反映了正离子模式下C组和M组之间的这些变量。(D)火山图反映了正离子模式下AVO组和M组之间的这些变量。(E)火山图反映了负离子模式下C组和M组之间的这些变量。(F)火山图反映了负离子模式下AVO组和M组之间的这些变量。

对所有鉴定的代谢物进行KEGG富集分析，发现这些代谢物参与多种KEGG途径，包括色氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、鞘脂信号通路、嘧啶代谢和嘌呤代谢(图7A)。随后，我们对所有鉴定的代谢产物进行了分析，最终确定了56种符合统计分析要求的GM代谢产物(表S2)。根据KEGG数据库，56种代谢产物中有39种代谢产物参与代谢途径；这些代谢产物中的14种代谢产物参与次级代谢产物的生物合成；这些代谢产物中的8种代谢产物与ABC转运蛋白有关；这些代谢产物中有6种代谢产物参与胆汁分泌；这些代谢产物中的6种代谢产物参与色氨酸代谢。此外，这些代谢产物还参与了其他97种KEGG途径。对56种代谢产物进行了富集分析，结果显示抗坏血酸和aldarate代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢是受影响最大的5种代谢途径(图7B)。此外，与C组相比，DSS刺激降低了脱氧胞苷、阿魏酰腐胺、D-生物素等28种代谢产物，并增加了皮五醇、蔗糖、肌酸等10种代谢产物。与M组相比，AVO治疗降低了L-肉碱、花葵素、3-吲哚乙酸等9种代谢物，增加了D-尿胆素、枯茗醛、苯乙酰甘氨酸等10种代谢产物(图8)。这些结果表明AVO改变了UC小鼠的GM代谢。

图7. GM代谢物的KEGG富集分析。

(A)所有鉴定代谢物的KEGG富集分析气泡图。(B) 56种GM代谢物的KEGG富集分析气泡图。

图8. 三组间56种GM代谢物的丰度变化(与M组相比具有显著性)。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。  

讨论

UC发病率在全球范围内不断上升，给UC患者带来了巨大的经济压力和痛苦。为了获得UC的治疗方法，已经开发了各种化学诱导的结肠炎模型。在这些结肠炎模型中，DSS诱导的结肠炎模型由于其简单性和可重复性而被广泛使用。只需调整DSS的给药浓度和频率，我们就能够构建各种急性或慢性结肠炎模型。此外，DSS诱导的结肠炎模型被广泛用于研究GM和影响GM的因素在UC发生和治疗中的作用。考虑到这些优势，我们选择DSS诱导的结肠炎模型作为UC实验动物模型。在本研究中，与C组相比，我们观察到DSS攻毒小鼠的体重显著减轻、出血性腹泻和肠道组织损伤，这些症状与人类UC患者相似。此外，免疫反应失调是UC的发病机制之一，结肠组织炎症也是UC患者和动物的常见特征。因此，我们评估了免疫相关细胞因子的变化。先前的研究表明，被破坏的IL-2基因有助于发展类似于人类UC的炎症性肠病，IL-2和IL-4被定义为与UC的发生呈负相关的抗炎细胞因子。此外，INF-γ和IL-17这两种促炎细胞因子与UC呈正相关，并且在许多UC动物和患者中观察到INF-γ与IL-17异常升高。本研究的结果是，结肠炎小鼠结肠组织中IL-2和IL-4的浓度较低，INF-γ和IL-17的水平较高。基于这些事实，我们相信我们已经成功构建了UC动物模型，后续的AVO药效学研究具有科学意义。与M组相比，AVO治疗减轻了出血性腹泻和结肠组织损伤，并提高了IL-2和IL-4的浓度。这些结果表明，AVO具有抗结肠炎活性，为我们进一步探索AVO减轻UC的潜在机制提供了合理的前提。

GM在宿主内稳态，尤其是肠道内稳态中发挥着重要作用。为了探讨AVO对UC的生物活性是否与调节GM密切相关，我们检测了DSS攻毒和AVO治疗后GM的变化。多项研究发现，在UC动物和患者中的GM也有一些类似的变化，包括微生物丰富度和多样性降低、GM整体结构失调以及特定微生物富集或抑制。同样，在本研究中，结肠炎小鼠的GM丰富度降低，GM整体结构发生改变，Ace和Chao指数降低、分层聚类分离和3D PCoA图分离证明了这一点。尽管AVO并没有缓解DSS引起的GM丰富度的降低，但观察到了增加的趋势。此外，AVO并没有逆转失调的GM整体结构。如群落直方图所示，厚壁菌门和拟杆菌门是两个最大的微生物群落。此外，与C组小鼠相比，DSS干扰降低了疣微菌门，增加了变形菌们。AVO治疗逆转了DSS对疣微菌门和变形菌门菌群的影响。尽管疣微菌门和变形菌门的变化反映了AVO与DSS之间的密切关系，但疣微菌门和变形菌门的比例仅占所有检测到的微生物的一小部分。还需要更多的研究来发现其他可能与AVO抗结肠炎活性有关的微生物。综上所述，这些结果表明，DSS可能通过改变GM的整体结构来诱导UC，而GM的改变可能是AVO抗结肠炎活性的原因。

作者还深入研究了属水平上GM的变化，并希望筛选出可能对AVO疗效负责的特定微生物。在许多UC患者中观察到Turicibacter增加，并且Turicibactor与炎症呈正相。在本研究中，DSS攻毒后Turicibacter显著增加，口服AVO降低了DSS增加的Turicibacter。此外，在许多UC动物中发现了Parasutterella和Erysipelatoclostridium增加，在我们的实验中也发现了类似的结果。这些结果表明，Parasutterella和Erysipelatoclostridium与UC的发生呈正相关。然而，在AVO干预后，DSS刺激诱导的Parasutterella和Erysipelatoclostridium增加显著减少。此外，LEfSe结果显示，Turicibacter、Parasterutella和Erysipelatocstridium是M组小鼠的优势菌种。这些结果表明，AVO可以抑制潜在有害细菌(Turicibacter、Parasterutella和Erysipelatoclosstridium)的生长，从而改善UC。

Enterorhabdus与促炎细胞因子的浓度呈负相关，在UC小鼠中也观察到Enterorhabdus的减少。这些事实表明，Enterorhabdus在肠道内稳态中发挥着积极作用。在本研究中，DSS攻毒小鼠显示出Enterorhabdus减少，这与其他研究一致。然而，与M组相比，AVO治疗显著富集了Enterorhabdus。Akkermansia是一种抑制肠道粘液层的微生物。由于Akkermansia可以增加粘蛋白的数量并减少结肠炎症，Akkermania被认为对维持肠道屏障稳态有积极作用。在当前研究中，DSS干预后Akkermansia显著减少，与M组小鼠相比，口服AVO可以显著丰富Akkermancia。Parvibacter可以通过增强粘蛋白的分泌和抑制炎症细胞因子来增加肠道屏障功能。在本研究中，DSS攻毒UC小鼠的Parvibacter减少，AVO治疗显著富集了Parvibacter。LEfSe分析显示，Enterorhabdus和Parvibacter是C组小鼠的优势菌种，Akkermansia是AVO组小鼠的优势菌种。这些结果表明，AVO可能会丰富这些潜在的有益细菌(Enterorhabdus、Parvibacter和Akkermansia)，从而改善UC。

大量研究人员强调了GM代谢产物对肠道稳态的重要性。因此，除了GM组成外，AVO对UC的生物活性可能与调节GM代谢有关。在本研究中，主成分分析得分图显示DSS和AVO显著影响粪便样本的代谢产物，最终确定了参与102个KEGG通路的56种改变的GM代谢产物。组间差异比较分析显示，DSS攻毒后，28种代谢产物减少，10种代谢产物增加。此外，与M组相比，AVO治疗减少了9种代谢产物，增加了10种代谢产物。这些结果表明，AVO对UC的改善可能与调节GM代谢密切相关。

为了找出可能与AVO抗结肠炎作用有关的代谢途径，我们对改变的代谢途径与UC之间的关系进行了深入讨论。我们在研究中观察到氨基酸代谢的显著变化。这些改变的氨基酸代谢途径包括色氨酸代谢、酪氨酸代谢、赖氨酸降解、甘氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢。在这些代谢途径中，色氨酸代谢对肠道稳态的重要性一直受到许多研究人员的重视。膳食来源的色氨酸可以通过GM代谢为各种色氨酸微生物衍生物。这些微生物衍生物可以激活AHR以维持肠道稳态。在本研究中，与C组相比，5-hydroxy-N-formylkynurenine和色氨醇的丰度降低，3-吲哚乙酸和3-羟基邻氨基苯甲酸的丰度增加。与M组相比，AVO降低了4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸和3-吲哚乙酸的水平(图8)。

胆汁酸(BAs)是由宿主分泌进入肠道后被GM代谢的一系列代谢物。研究表明，BA参与维持肠上皮紧密连接的完整性，促进粘液层的形成，并协调肠道免疫稳态。此外，在许多UC患者和动物中发现了失调的BAs谱，最近有人提出将调节BAs代谢作为生物活性成分治疗UC的机制。本研究观察到UC小鼠中胆酸和脱氧胆酸的丰度降低。然而，AVO治疗有效地逆转了DSS对胆酸和脱氧胆酸丰度的影响(图8)。此外，初级胆汁酸以胆盐的形式随胆汁一起分泌到肠道中(41)。在本研究中，56种GM代谢产物中有7种与胆汁分泌KEGG途径有关，包括L-肉碱、脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸、血栓素B2、谷胱甘肽、胆酸、脱氧胆酸(图8)。

除了色氨酸代谢和BAs代谢外，近年来越来越多的研究表明，视黄醇(维生素A)的微生物代谢产物在肠道免疫稳态中发挥着重要作用。视黄酸是视黄醇的微生物代谢产物之一，可以通过各种机制维持肠道稳态，如维持可抑制肠道内INF-γ产生的嗜酸性粒细胞的数量、调节保护性CD8+ T细胞，以及调节免疫球蛋白A的产生等。在这项研究中，我们观察到全反式-13,14-二氢视黄醇(一种视黄醇代谢为视黄酸的中间体)在M组小鼠中减少(图8)。

在本研究中，我们观察到UC小鼠和AVO口服给药小鼠的GM代谢发生了改变(PCA评分图证明了这一点)。更重要的是，差异代谢产物分析和KEGG富集分析的结果表明，在这些改变的代谢途径中，许多代谢途径在维持肠道稳态方面发挥着重要作用。尽管本研究没有证明AVO的抗结肠炎作用是调节GM代谢的结果，但仍然提示AVO的抗结肠炎作用与调节GM代谢有关。本研究还表明，几种代谢途径可能与AVO的抗结肠炎作用有关，包括氨基酸代谢(尤其是色氨酸代谢)、BA代谢和视黄醇代谢。然而，在我们的研究基础上，还需要进一步研究AVO是否通过调节这些代谢途径发挥其抗结肠炎活性。

AVO的成分特征表明，AVO的主要成分是苍术酮(78.82%)。苍术酮是一种倍半萜氧化物衍生物，存在于AM精油中，也存在于其他植物的精油中，如Siparuna muritate、Nectandra salicina(樟科)、苍术(Atractylodes lancea)、Siparuna guianensis。苍术酮具有许多有吸引力的药理作用，包括抗炎作用。最近的一项研究表明，苍术酮通过改变胃溃疡大鼠的GM组成(增加Mucispirillum、Parabacteroides、Bacteroides和减少Bifidobacterium)和各种GM代谢产物(色氨酸和BAs)来改善胃溃疡。这些结果表明，苍术酮可能是AVO的主要生物活性成分，具有调节GM组成和代谢的能力，但还需要进一步的研究来验证苍术酮治疗是否可以通过调节GM改善结肠炎。

结论

本文首先研究了AVO是否对UC有治疗作用及其潜在机制。研究结果表明，AVO可以有效缓解UC小鼠的出血性腹泻、结肠组织损伤和结肠炎症。粪便样本的GM组成分析表明，AVO抑制了潜在有害细菌(Turicibacter、Parasuterella和Erysipelatoclosstridium)的生长，并富集了潜在有益细菌(Enterorhabdus、Parvibacter和Akkermansia)。粪便代谢组学研究表明，AVO可以通过调节参与102个KEGG途径的56种代谢产物来改变GM代谢。在这些KEGG途径中，许多代谢途径与肠道内稳态密切相关，如氨基酸代谢(尤其是色氨酸代谢)、BAs代谢、视黄醇代谢等。综上所述，本研究表明，AVO可能是一种新型益生元，通过调节GM和GM代谢来治疗UC(图9)。

图9. AVO治疗对DSS诱导的UC小鼠的影响总结图。