【醉仁心胸】静脉注射达比加群替代肝素用于体外循环中的抗凝：一项验证性动物试验

编译：罗毅；审校：董榕

上海交通大学医学院附属瑞金医院

北部院区麻醉科

摘要

背景：

尽管目前肝素成功地用于心肺转流（CPB）期间的血液抗凝，然而，由于存在肝素相关性血小板减少等风险，仍希望能找到替代的抗凝药物。体外实验表明，达比加群可为模拟心肺转流的模型提供充分的抗凝作用。本试验的目的是验证达比加群可为实验动物（兔）的体外循环提供足够的抗凝作用。

方法：

使用非线性混合效应模型来估算达比加群在10只新西兰白兔中的双室药代动力学参数。根据药代动力学，在整个体外循环期间输注达比加群以维持其血浆浓度在90ug/ml。实验动物在胸骨切开后静脉注射达比加群（6只）或肝素（4只）用以抗凝，并在右心房和升主动脉插管以引流血液，体外循环持续120分钟。测量指标包括体外循环期间的活化凝血时间（ACT）、血栓弹力图R时间和血气分析。试验结束后处死试验动物，并切除脑和肾脏进行组织学检查，同时使用电子显微镜检查动脉滤器的剖面。  

结果：

在体外循环期间观察到的达比加群浓度高于目标浓度，CPB开始5分钟时达比加群浓度为137±40ug/ml，60分钟时为428±150ug/ml，120分钟时为295±35ug/ml。所有实验动物在完成2小时体外循环后均没有可见的血栓形成。两组血栓弹力图R时间均升高，在CPB 120分钟时到达10262±4198秒（达比加群组）和354±141秒（肝素组）。脑和肾脏的组织学检查均没有血栓形成或微结构损伤的证据。动脉滤器的电子显微镜检查显示几乎没有或仅有很少的纤维蛋白残留。两组实验动物的预后没有显著差异。

结论：

这项验证性研究表明，在兔体外循环模型中，达比加群可以提供类似于肝素的抗凝作用，预防血栓形成。  

背景  

自体外循环（CPB）开始应用以来，肝素便一直作为期间的抗凝药物使用。然而，肝素也有一些缺点，如导致内源性抗凝血酶不足，以及潜在的抗原风险。尽管只有1%的心脏手术患者在CPB后出现肝素相关的血小板减少，但多达50%的患者可能会产生抗肝素血小板因子4，而其升高与不良预后相关。尽管目前已有比伐卢定可替代肝素用于CPB，但由于其缺少拮抗药物，对活化凝血时间（ACT）不敏感以及出血和血栓形成风险高等原因，因此，仍有必要寻找更加安全有效的替代方案。

达比加群是一种直接的凝血酶抑制剂，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于血栓的预防和治疗，同时，其拮抗药物伊达鲁珠单抗也已被批准使用。因此，达比加群可能作为CPB期间有效的抗凝药物，尤其是对于存在肝素应用禁忌的患者。之前的研究表明，达比加群可为体外CPB模型提供充分的抗凝。而为了进一步验证达比加群在活体动物体外循环中的应用，来自美国罗彻斯特大学的研究者们设计并进行了该实验，结果发表于2023年5月的《Anesthesiology》1。

方法  

实验动物  

实验使用35只成年雄性新西兰白兔，体重在4.0-5.1kg（平均4.7kg）。所有实验动物均饲养于无病原体的环境中，保持12小时光照-黑暗的循环，并保证随时可用的食物和饮水。

达比加群溶液  

1mg达比加群溶解于60ul 0.075M盐酸中，并在溶液中加入0.2ml 20%二甲基乙酰胺。按以上公式，4kg的实验兔接受15mg/kg达比加群，需要将60mg达比加群溶解于3.6ml 0.075M盐酸中，并加入12ml 20%二甲基乙酰胺，共输注15.6ml液体。

药代动力学和药效学测定  

在10只实验兔的耳中央动脉和耳缘静脉置管，通过耳缘静脉注射15mg/kg达比加群，并用3ml生理盐水冲管。分别在注射前（基线），注射后5分钟，15分钟，30分钟和60分钟，通过动脉抽取2ml血液，之后将实验兔放回饲养笼，并于注射后120分钟，180分钟，300分钟和420分钟分别抽取血液。每只实验兔总计抽取18ml血液，并观察注射后24小时的不良反应。之后饲养实验兔1年至Chandler循环或体外循环实验。

实验室指标  

实验室指标包括血样本的R时间（血栓形成时间），活化凝血时间（ACT），血红蛋白浓度和达比加群浓度。

Chandler循环  

Chandler循环是对CPB在体外条件下的简易模拟。通过皮下注射15-30mg/kg盐酸氯胺酮和3mg/kg甲苯噻嗪对实验兔进行全身麻醉，为保证实验期间的麻醉深度，可按需静脉注射2-8mg/kg异丙酚。通过心脏穿刺将血液收集在含有35ml柠檬酸磷酸葡萄糖的250ml无菌袋中，并以2:1的比例将全血与PlasmaLyte-A混合以填充环路。之后使环路在37℃的水浴中以每分钟6转的速度运行，并分别加入2.5,5,10,20,40,60和80ug/ml达比加群，随后观察120分钟环路内液体的流动性。

达比加群药代动力学计算  

使用两室（中央室和外周室）药代动力学模型来拟合动物实验所获得的数据，该模型的参数包括总体清除率、室间清除率、中央室体积和外周室容积，并运用非线性混合效应模型来估计总体参数。

将所得参数代入Berkeley Madonna建模的软件中来模拟达比加群浓度和时间的关系，并分别计算达到60、90和120ug/ml稳态浓度所需的负荷剂量和维持浓度。

体外循环（CPB）  

20只实验兔用于体外循环，10只进行体外循环实验，另外10只作为供血者。进行体外循环的实验兔中，6只注射达比加群，4只作为对照组接受肝素抗凝。实验兔在CPB前皮下注射0.12mg/kg丁丙诺啡镇静，CPB期间皮下注射氯胺酮（15mg/kg）+右美托咪定（0.05-0.1mg/kg）或是氯胺酮（35-55mg/kg）+咪达唑仑（5mg/kg）。每只实验兔进行气管插管或是置入声门上通气装置并进行机械通气。麻醉维持采用1-3%异氟烷复合静脉注射异丙酚（0.2mg/kg/min）或是舒芬太尼-咪达唑仑混合液（0.3ml/kg/h，包含2.3ug/ml舒芬太尼和450ug/ml咪达唑仑）。麻醉期间，持续输注乳酸林格液和5%葡萄糖溶液（5-10ml/kg/h），并监测实验兔的心率、心律（心电图）、氧饱和（脉氧）、呼气末二氧化碳、动脉血压、体温（直肠）和生理反射。

在置入股动脉和颈外静脉导管后，通过胸骨中线切开胸骨，在主动脉和右心房放置荷包缝线后，30秒内静脉注射17mg/kg达比加群（6只）或400U/kg肝素（4只）用以抗凝。为了在CPB期间达比加群血浆浓度维持90ug/ml，达比加群组前40分钟静脉输注0.9mg/kg/min之后改为0.55mg/kg/min直至结束。之所以将达比加群浓度设定为90ug/ml，是由之前Chandler循环实验所得出的最低有效浓度。

CPB常规维持120分钟，在CPB开始后5,15,30,60,90和120分钟检测达比加群浓度，ACT，血栓弹力图，血气分析和电解质水平。CPB结束后，对实验动物实施安乐死，并摘取动物大脑和肾脏进行组织学检查，以确定是否有血栓或栓塞发生。同时，使用扫描电子显微镜检查动脉滤器上是否有纤维蛋白沉积。

结果  

达比加群的药理学  

达比加群的血浆浓度在注射后5分钟达到最大值56.8±6.6ug/ml，在第15分钟迅速下降至30.4±4.0ug/ml，此后浓度逐渐下降，至24小时检测不出（图1A）。为了解达比加群浓度下降是否依赖于活体组织，在Chandler循环中加入达比加群（80和40ug/ml）并维持循环，结果发现达比加群浓度在第1分钟，30分钟和60分钟基本保持不变，说明达比加群浓度的改变依赖于活体器官代谢。

图1. 注射后血浆达比加群浓度、ACT和R时间的变化

注射达比加群后ACT和R时间迅速延长，第5分钟达到峰值，随后迅速下降，至24小时，与基线水平无明显差异（图1B，1C）。ACT和R时间延长均与达比加群浓度密切相关，相关系数分别为0.94和0.96。另外，实验期间血红蛋白浓度保持稳定，说明没有出现明显的脱水或失血等情况。Chandler循环的结果表明，80ug/ml达比加群可在120分钟内有效地防止血栓形成。

达比加群的药代动力学  

达比加群的药代动力学参数估算为总体清除率5.6（95% CI 4.6-6.5）ml/min/kg，室间清除率13.7（95% CI 12.3-14.9）ml/min/kg，中央室容积176（95% CI 158-202）ml/kg和外周室容积428（95% CI 372-525）ml/kg。

图2. CPB期间达比加群的血浆浓度。虚线为每只实验兔的具体数据，实线为平均值。

表1. CPB期间血气、电解质、R时间和ACT的数值

体外循环  

为确保在CPB期间有足够的抗凝效果，根据药理学结果需要达比加群浓度维持在90ug/ml以上。所有10只实验兔均完成2小时的体外循环，没有明显的血栓形成，期间血气分析和电解质均在可接受的范围内（表1）。达比加群组中，R时间显著延长，而ACT在CPB期间均超出测量范围。除一只实验动物外，其余均在负荷剂量的达比加群后达到或高于目标浓度（图2）。在CPB期间，所有实验兔均出现达比加群积聚，使血浆浓度显著高于目标浓度。肝素组中，R时间和ACT均延长，但程度明显较达比加群组轻。肝素组的平均用量为6673±795U，但ACT仍不足300秒。在CPB结束后，通过电子显微镜检查动脉滤器发现，达比加群组和肝素组均仅有极少的纤维蛋白沉积（图3）。实验兔大脑和肾脏的组织病理学检查也没有血栓形成或其他异常的表现。

图3. 电子显微镜下动脉滤器的表现    

结论  

达比加群可为活体实验动物的体外循环提供足够的抗凝作用。达比加群具有替代肝素成为体外循环期间抗凝药物的潜在能力。

点评：

目前，心脏手术体外循环期间的抗凝几乎全都使用肝素。然而，肝素也存在一些不良反应，例如潜在的抗原风险以及肝素相关性血小板减少等。对于存在肝素使用禁忌的患者，当前的指南推荐应用比伐卢定抗凝，但缺少相应的拮抗药物、对ACT不敏感以及增加出血或血栓的风险等缺点限制了其应用。同样作为直接凝血酶抑制剂的达比加群已在临床中广泛使用，而其拮抗剂伊达鲁珠单抗也已被FDA批准用于临床，因此，达比加群可能更加适合作为肝素的替代药物用于体外循环期间的抗凝。之前的体外实验表明，达比加群可为体外循环提供充分的抗凝作用，而该研究进一步证明，在活体动物的体外循环中，达比加群同样可提供足够的抗凝作用。   然而，该研究也存在一些不足。首先，该研究并未直接检测高浓度达比加群对组织器官是否存在毒性作用，接受体外循环的实验动物在实验结束后被直接处死，因此，无法得知高浓度达比加群是否对活体组织器官产生影响。其次，该研究没有使用伊达鲁珠单抗对达比加群进行拮抗，因此，无法得知高浓度达比加群是否可被完全快速地拮抗。另外，该研究中发现，达比加群浓度在体外循环期间存在明显的积累现象，这与之前体外实验的结果不符，可能说明麻醉、手术和体外循环对达比加群的代谢产生了明显影响。同时需要指出的是，达比加群用于体外循环的研究目前仍处于动物实验阶段，距离临床应用还需经历更多研究。未来，需要更多高浓度达比加群对器官功能的影响以及其拮抗作用的相关研究，使达比加群可以真正替代肝素成为心脏手术体外循环期间的抗凝药物。

翻译：罗毅 

审校：董榕  

参考文献：

1. Nadtochiy SM, Stefanos T, Angona RE, et al. Intravenous Dabigatran Provides Adequate Anticoagulation for Cardiopulmonary Bypass Using a Rabbit Model. Anesthesiology. 2023;138(5):523-532.  

（ 仅供医学专业人士参考）

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