右美托咪定预处理通过抑制铁死亡减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤

胡俊凯1,2 王碧颖1,2 李林桂1,2 张冕1,2 陈歆予1,2 孟晓文1,2 嵇富海1,2　　

1苏州大学附属第一医院麻醉科，苏州 215006；2苏州大学麻醉研究所，苏州 215006

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(04):340-345.

基金项目 

国家自然科学基金（82072130）；

江苏省“333”高层次人才培养工程（BRA2020089）；

江苏省自然科学基金（BK20191171）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究旨在探究右美托咪定（Dex）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）时铁死亡的影响及相关分子机制。

1、材料与方法

1.1、实验动物及分组

健康雄性SPF级C57BL/6小鼠42只，6~8周龄，体重23~25 g，动物房饲养温度25 ℃~27 ℃，相对湿度50％~70％，12 h光照维持，昼夜循环，实验动物均进行1周适应性饲养。

按随机数字表法将42只小鼠分成3组（每组14只）：假手术组（Sham组）、缺血再灌注损伤组（IR组）、右美托咪定预处理组（Dex+IR组）。Sham组左冠状动脉前降支（LAD）只穿线，不结扎；IR组LAD结扎30 min，随后再灌注24 h；Dex+IR组缺血前30 min腹腔注射Dex25 μg/kg，手术方法同IR组。

1.2、建立MIRI模型

参照文献建立小鼠MIRI模型。建模前，小鼠禁食8 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉小鼠，仰卧位固定，手术部位脱毛，碘伏棉签消毒，切开小鼠颈前区皮肤，逐层分离筋膜、肌肉，充分暴露气管后插管，连接呼吸机，采用MedLab生物医学信号处理采集系统连续监测术中小鼠ECG变化。于心前区左侧第4肋间剪开肋间隙皮肤，分离皮下组织，暴露胸腔和心脏，使用6‑0带线缝合针在LAD中段部位左侧穿过心肌层。随后将细聚乙烯管置于心脏表面，与LAD平行后使用活结结扎，结扎部位下方心肌呈现苍白区域，ECG显示ST段抬高即造模成功。结扎30 min后剪开线结ECG显示ST段呈现明显回落，且心尖部位恢复红润，即为再灌注成功。之后关闭胸腔、缝合切口，待小鼠恢复自主呼吸后拔管。

1.3、伊文蓝及2，3，5‑三苯基氯化四氮唑（TTC）双染色

小鼠再灌注24 h后将LAD重新结扎，打开腹腔并剪开膈肌，游离并显露下腔静脉，经下腔静脉注射2%伊文蓝0.2 ml，3 min后将心脏取出，预冷的生理盐水漂洗心脏组织，置于−80 ℃冰箱10 min，在冰盒上沿心脏长轴切片，将组织切片浸泡于1%TTC溶液中，37 ℃避光孵育15 min，PBS溶液漂洗后于4%多聚甲醛溶液中固定30 min。扫描心脏切片，蓝色区域为正常区域，非蓝色区域（包括红色和白色）为缺血危险区（AAR），其中红色区域为缺血未梗死区，白色区域为心肌梗死区，Image J软件测量分析。心肌缺血面积为AAR占左心室的百分比，心肌梗死面积为心肌梗死区占AAR的百分比。

1.4、H‑E染色

将心脏组织置于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋心肌组织，将固态石蜡进行切片（4~6 μm）。脱蜡后将切片放入乙醇中浸泡进行水化，PBS溶液漂洗后苏木精染色5 min，于1%的盐酸乙醇中去除多余的苏木精染料，1%氨水返蓝，伊红染色3 min，组织切片梯度脱水至透明，中性树脂封片，干燥72 h，于普通光学显微镜下对心肌组织进行观察。

1.5透射电镜观察心肌组织线粒体超微结构

心肌组织切成1 mm3大小，置于预冷的电镜固定液中2 h，PBS溶液漂洗后将组织块置于1%锇酸中，室温避光条件下固定2 h。固定完成后依次使用乙醇、丙酮脱水，将组织块包埋于环氧树脂中，放于烤箱聚合48 h。树脂块于超薄切片机进行切片，枸橼酸铅溶液染色。干燥后在透射电镜下观察线粒体形态。

1.6心肌组织中Fe2+、丙二醛（MDA）测定

取心肌组织放入液氮中速冻，分析天平上称重，根据重量（g）和体积（ml）=1∶9的比例加入预冷的生理盐水进行匀浆，4 ℃、2 500 r/min离心10 min（离心半径8.6 cm），取上清液检测Fe2+和MDA含量。

1.7Western blot法检测ACSL4和GPX4蛋白水平

取−80 ℃冰箱保存的心肌组织，于分析天平上称重，每10 mg组织加入100 μl蛋白裂解液和1 μl蛋白酶抑制剂，研磨成组织蛋白匀浆。BCA法测定总蛋白浓度，生理盐水配平各管样品，加入SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液（5X）混匀，金属水浴锅煮沸10 min，使蛋白样品充分变性。取等量的蛋白样品进行电泳，经转印、封闭后分别加入ACSL4（1∶1 000）、GPX4、β‑tubulin一抗，4 ℃摇床孵育过夜；第2天回收一抗，TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min。之后再相应加入山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（1∶3 000）为二抗，室温下置于摇床上孵育2 h后洗膜，将条带置于发光液中浸泡，采用天能全自动凝胶成像分析仪曝光显影。Image J软件测定蛋白条带的灰度值。以目的蛋白（ACSL4、GPX4）的灰度值除以内参蛋白β‑tubulin的灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

2、结果

2.1、心肌缺血面积和心肌梗死面积比较

与Sham组比较，IR组、Dex+IR组心肌缺血面积及心肌梗死面积均增加（P<0.05）。与IR组比较，Dex+IR组心肌梗死面积减少（P<0.05），心肌缺血面积差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2、心肌组织H‑E染色结果比较

H‑E染色结果显示，Sham组小鼠心肌纤维排列整齐，组织结构完整，界限清晰；IR组心肌组织结构紊乱，心肌纤维明显断裂，伴有大量炎症细胞浸润；Dex+IR组心肌纤维断裂较IR组明显减少，组织结构尚完整，排列相对整齐。见图2。

2.3、心肌组织超微结构比较

透射电镜扫描结果显示，Sham组心肌组织线粒体排布清楚，结构完整，线粒体嵴清晰可见；IR组心肌组织线粒体变圆缩小，线粒体嵴断裂、减少甚至消失；而给予Dex预处理后，Dex+IR组线粒体损伤较IR组减轻，但仍有线粒体嵴断裂。见图3。

2.4、Fe2+和MDA含量比较

与Sham组比较，IR组Fe2+和MDA含量升高（P<0.05），Dex+IR组MDA含量差异无统计学意义（P>0.05）、Fe2+含量升高（P<0.05）。与IR组比较，Dex+IR组Fe2+和MDA含量降低（P<0.05）。见图4。

2.5、ACSL4和GPX4蛋白水平比较

与Sham组比较，IR组ACSL4蛋白水平升高（P<0.05）、GPX4蛋白水平降低（P<0.05），Dex+I/R组ACSL4、GPX4蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。与IR组比较，Dex+IR组ACSL4蛋白水平降低（P<0.05）、GPX4蛋白水平升高（P<0.05）。见图5。

3、讨论

本研究观察到IR组小鼠心肌梗死面积增加，组织病理损伤显著，心肌纤维断裂，Fe2+、MDA含量升高，电镜下线粒体呈现特征性变化，极度变圆缩小，线粒体嵴断裂甚至消失，这些迹象表明MIRI诱导心肌细胞发生铁死亡，而Dex预处理能显著逆转这一现象，Dex+IR组心肌梗死面积减少，Fe2+及MDA含量明显降低，线粒体损伤显著减轻。

在本研究中，与Sham组比较，IR组小鼠心肌组织中ACSL4高表达而GPX4低表达，而Dex预处理可以负向调控ACSL4表达抑制脂质过氧化，正向促进GPX4表达提高机体抗氧化能力，改善铁死亡介导的MIRI。

本研究结果表明，Dex预处理在小鼠MIRI模型中同样发挥抗铁死亡效果，ACSL4诱导的脂质过氧化物蓄积有所改善，同时细胞内修复脂质氧化损伤的GPX4蛋白水平升高，从而减轻心肌组织损伤。

国际麻醉学与复苏杂志

International Journal of Anesthesiology and Resuscitation

主管：中华人民共和国国家卫生健康委员会

主办：中华医学会   徐州医科大学