10+！转录特征检测胰腺癌的同源重组缺陷~

导语

据报道，具有同源重组缺陷 (HRD) 的胰腺癌 (PC) 受益于多聚 ADP 核糖聚合酶 (PARP) 抑制剂。然而，从转录水平准确识别 PC 患者的 HRD 状态仍然是一个巨大的挑战。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者基于相对表达排序 (REO) 的算法，使用来自癌症基因组图谱 (TCGA) 的 PC 转录配置文件开发了包括 24 个基因对 (24-GPS) 的 HRD 签名，使用转录特征在个体水平上检测胰腺癌中的同源重组缺陷。文章发表在《Molecular Therapy-nucleic ACIds》上，影响因子为：10.183，文章题目为：A transcriptional signature detects homologous recombination deficiency in pancreatic cancer at the individual level。

数据介绍

PC 患者的基因表达谱下载自GEO，cBioportal和ICGC。来自 TCGA 的 PC 样本被用作训练队列来发现 HRD 签名。ICGC-AU 中的样本，GSE17891 和 GSE57495 数据集用于验证签名。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析 

01 PC中HRD签名的开发  

为了表征 PC 的 HRD 状态，本研究基于 TCGA 队列 (n = 147) 中 DNA 损伤反应 (DDR) 基因的基因表达谱，通过一致性聚类获得了四个簇。集群 3 (C3) 包括 33 个样本，显示出最差的总生存期 (OS) 和最高的 HRD 分数（图 1A 和 1B）。与非C3组(C1、C2、C4)相比，C3组在上述HRD相关特征上得分更高图1C)。这些结果表明C3具有明显的HRD特征，因此被认为是发现HRD特征的类HRD群。

图 1

使用基于 REO 的算法，确定了 156,399 个显著逆转基因对，并将具有最高频率差 (FD) 值的 1,000 个基因对纳入以下分析。本研究通过执行LASSO模型发现了由 24 个基因对 (24-GPS) 组成的特征。24-GPS 中 65% 的截止值是最佳阈值，因为 HRD 评分差异最大，并且 HRD 样组和非 HRD 样组之间其他 HRD 相关特征的差异更大（图1D)。结果，147 个 PC 样本被分为 37 个 HRD (25.2%) 和 110 个非 HRD (74.8%)，曲线下面积 (AUC) 为 0.98（图 1E）。生存分析显示，与非 HRD 样本相比，HRD 组的 OS 明显更差（图 1F）。根据其他文献的 HRD 评分截止值，157 例低 HRD 评分病例和5 例高 HRD 评分病例在 OS 方面没有差异（图 1G）。与 24-GPS 识别的 25.2% HRD 样本相比，高 HRD 分数 (3.1%) 的比例远低于 HRD 频率 （图 1H）。

02   在独立数据集上验证24-GPS  

对于ICGC-AU队列，根据 24-GPS 分类为 HRD 亚组的 17 名患者的 OS 显著低于非 HRD 组中的 78 名患者（图 2A），HRD 子组显示更高的 HRDetect 分数（图 2B）。然而，根据之前 ICGC-AU 中建立的 HRDetect 评分截止值，在具有高 HRDetect 评分和低 HRDetect 评分的 PC 患者之间，OS 没有显著差异（图 2C)。在数据集 GSE57495 和 GSE17891 中，HRD 病例显示出比非 HRD 病例更差的 OS（图 2D 和 2E）。此外，RAD51 缺陷是同源重组 (HR) 功能障碍最具体的细胞标志之一， 在 HRD 组中发现 RAD51 缺陷病例的比例明显高于非 HRD 组（图 2F）。来自 TCGA、ICGC-AU 和 GSE17891 数据集的前 1,000 个DEG的一致性分析表明，两个 DEG 列表之间的一致性比率超过 98.03%（图 2G）。总共从三个数据集中检测到 80 个重叠的 DEG（图 2H）。

图 2

CTRP的药物基因组学数据、GDSC2的药物敏感性基因组学和 CRISPR/Cas9 数据被用于进一步测试由 24-GPS 识别的 HRD 细胞是否显示易受 PARP 抑制。对于在 CTRP 中用奥拉帕尼处理的 PC 细胞系，30 个 HRD 细胞系按 24-GPS 分类，并呈现出比八个非 HRD 细胞系更低的 AUC 评分（图 2I）。在 GDSC2 中发现了类似的结果，15 个 HRD 细胞系比 16 个非 HRD 细胞系对尼拉帕尼更敏感（图 2J）。在 CRISPR/Cas9 数据集中，敲除 PARP1/2 基因后，HRD 细胞系的存活率低于非 HRD 细胞系（图 2K 和 2 L )。

03   患有HRD的PC患者的多组学景观  

在 TCGA 数据集中进行了多组学数据的综合分析。如图 3A 所示，热图描绘了 10 个突变最多的基因、DDR 基因和具有不同突变频率的基因。其中HRD 的两个典型标记 BRCA1 和 BRCA2 基因仅在 HRD 样本中被发现发生突变。同时，还发现其他一些DDR基因仅在HRD组发生突变，如ATRX和FANCA。这些结果证明了 HRD PC 具有特定的基因突变谱。

除了体细胞突变谱外，本研究还比较了两个亚组之间的拷贝数畸变 (CNA) 配置文件。与非 HRD 病例相比，在 HRD 病例中观察到大量具有显著更高频率 CNA 的基因，DDR 基因的 CNA 事件分别占 1.6% 缺失 (DEL) 和 1.4% 扩增 (AMP)（图 3B）。值得注意的是，TP53、BRCA2 和 RAD51 基因在 HRD 组中具有较高的缺失频率，而观察到 ATR 基因的扩增频率较高（图 3C）。

图 3

使用 TCGA 队列中的甲基化谱，2,998 个基因在 HRD 和非 HRD 组之间显示出显著差异的甲基化，如图 3D 所示，其中 1,159 个与先前识别的 DEG 重叠。然后，本研究使用热图描绘了 HRD 和非 HRD 组在转录组和表观基因组水平上的差异（图 3E）。

最后，本研究鉴定了 30 种在 HRD 样本中与非 HRD 样本相比具有显著差异表达的蛋白质，与非 HRD 病例相比，HRD 显示出几种细胞周期蛋白（CHEK1、CCNB1、CCNE1 和 YWHAZ）的表达更高，而 ATM 蛋白的表达显著降低（图 3F）。30 种蛋白质的功能富集分析表明，多个 HRD 相关通路失调，如 PI3K-Akt 信号通路、P53 信号通路和细胞周期通路（图 3G）。

04   HRD PC显示抑制性免疫微环境  

接下来研究了 TCGA 队列中 HRD 和非 HRD 组之间由 ImmuneCellAI 预测的 24 种免疫细胞的浸润差异。结果显示 Tr1、MAIT 、Gamma delta 、CD4 T 、和 CD8 T 细胞在 HRD 组中显著较高，而 CD8-naive、效应记忆和单核细胞的浸润比例较低（图 4A）。免疫检查点抑制剂反应预测结果表明 HRD 病例可能对免疫治疗不敏感（图 4A）。接下来，本研究使用ESTIMATE方法估计恶性肿瘤中的基质细胞和免疫细胞，与非 HRD 组相比，HRD 组的免疫评分显著降低（图 4A）。总之，这些结果表明具有 HRD 的 PC 样品显示出较低的免疫细胞浸润。

图 4

最后，本研究比较了20个免疫检查点基因在HRD组和非HRD组之间的表达水平。结果发现，大多数免疫检查点基因在HRD组中显著下调，如CD274 (PD-L1)和CTLA4基因。与非HRD样品相比，HRD样品中只有CD276 (B7-H3)基因表达显著上调(图4 B)。T细胞受体(TCR)丰富度和TCR Shannon的比较显示，HRD组的TCR多样性显著低于非HRD组，表明这些病例的免疫反应较弱(图4C和4D)。

05   24-GPS中的基因通过扰乱细胞周期通路正向调节HRD过程  

与非 HRD 组相比，24-GPS 中的 18 个基因在 HRD 组中显著上调，并显著富集于细胞周期通路 。从 Pathway Commons 数据库研究蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络中 18 个基因与 HRD 相关基因 (80 DEGs) 之间的相关性，本研究发现 76 个与 PPI 相互作用显著相关的基因对，并构建了作为 HRD 网络（图 5A ）。在 HRD 网络中，除两个负相关外，所有 PPI 交互均显著正相关。

图 5

作为转录因子 E2F 家族成员的 E2F1 在 HRD 网络中具有很高的表达度，并且发现它在 TCGA 队列中与非 HRD 样本相比在 HRD 样本中显著过表达。E2F1 的 22 个靶基因在 HRD 病例而非非 HRD 病例中显示与 E2F1 显著相关（图 5B）。具体来说，CHD4 和 NONO 基因是致癌基因，CTCF 和 E2F3 作为转录因子，这四个功能基因与 HRD 组中的 E2F1 显著负相关。其中，CHD4、CTCF、E2F3在非HRD组与E2F1呈弱负相关，与非 HRD 组相比，在 HRD 组中表达较低（图 5C）。然而，NONO 在非 HRD 组中的表达与 E2F1 呈正相关，与非 HRD 组相比，在 HRD 组中显著过表达（图 5C），表明 E2F1 在 HRD 期间上调其表达。

06   预测与PARP抑制剂的联合治疗  

由于 HRD 组细胞周期通路的失调在转录组和蛋白质组水平均有发现，并且考虑到 ATR 是细胞周期通路的成员，作者研究了 ATR 和 PARP 基因的共抑制作用。首先，本研究观察到与训练队列中的非 HRD 病例相比，HRD 病例中 ATR 表达更高的趋势（图 6A）。虽然没有意义，但具有 ATR 和 PARP 共低表达的 PC 样本显示出比其他 PC 样本更长的 OS（图 6B），其中低表达被定义为表达水平低于中值。此外，基于先前鉴定的 13 个 HRD 细胞系，ATR 表达高于其中值水平的 7 个细胞系被定义为 hiATR 样本，其余 6 个细胞系被归类为 loATR 组。比较分析发现，在敲除 PARP2 基因时，loATR 组的生存显著低于 hiATR 组（图 6C）。然而，在分别敲低 PARP1 或 PARP3 基因的细胞系中未发现上述差异（图 6C）。

图 6

为了发掘更可行的 PARP 抑制剂联合策略，本研究调查了另外 451 个源自 Lundberg 等人工作的细胞周期基因。其中，CDCA2 和 HJURP 基因，它们在 HRD 组中均显著上调。如图 6C 所示，CDCA2 或 HJURP 低表达的 PC 细胞的存活能力显著低于高表达的细胞（图 6D）。此外，与非 HRD 细胞相比，HRD 细胞中 HJURP 的表达显著更高，并且在 CDCA2 中也发现了类似的结果（图 6E） 。这些结果揭示了细胞周期通路和PARP基因共同抑制的潜力。

小编总结

本研究基于相对表达顺序(REO)算法，利用来自TCGA的PC转录谱，建立了包含24对基因(24- GPS)的HRD标记。24-GPS分类的HRD样本总体生存率较差。HRD样品显示出高度不稳定的基因组特征，并且在表观基因组和蛋白质组学水平上也显示出与HRD相关的改变。此外，24-GPS鉴定的HRD细胞系倾向于对PARP抑制剂敏感。与非HRD组相比，HRD组免疫评分和CD4/CD8 T细胞浸润比例较低。同时抑制 PARP 相关基因和 ATR 的 PC 肿瘤细胞显示出降低的存活能力。总之，24-GPS 可以在个体化水平上可靠地识别具有 HRD 状态的 PC 患者。

这项工作也存在一些局限性。缺乏 PC 与 PARP 抑制剂治疗的转录组学数据阻碍了对 24-GPS 的更直接验证。此外，由于对CDCA2和HJURP抑制剂的研究有限，本研究无法使用公开数据验证与PARP抑制剂的联合抑制效果。最后，考虑到这些发现是通过生物信息学分析获得的，值得进一步验证 24-GPS 的临床应用，并在细胞系和动物模型中验证 PARP 与细胞周期通路的联合抑制。

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