科研丨复旦大学(IF:20.6): 克罗恩病患者粪便DNA和RNA病毒组的生态失调(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

克罗恩病(CD)的发病机制与患者肠道微生物组生态失调有关。然而，对CD中由噬菌体和真核病毒组成的病毒组知之甚少。本研究分析了与CD发病机制有关的粪便病毒组、病毒功能和病毒-细菌关联。对非CD家庭对照、CD活动期和缓解期患者的粪便样本进行了宏基因组和宏病毒组学研究，并采用新的病毒鉴定和数据分析流程。结果发现，患者的细菌组和DNA/RNA病毒组都发生改变，并与疾病状态相关。在CD患者中，DNA和RNA病毒组的多样性降低，异质性极高。在病毒组中观察到CD特异性生态失调，特别是CD中显著的DNA真核Torque Teno Virus(TTV)、疾病相关的Faecalibacterium phage和Escherichia phage以及RNA番茄饮食相关病毒，而一些不同的原核病毒在健康受试者中更为丰富。与缓解期相比，活动期患者粪便中与炎症相关的真核TTV和原核葡萄球菌噬菌体占优势地位，并与并发症和多种治疗方法具有相关性。多种病毒功能，特别是病毒DNA复制、整合和修饰以及真核TTV相关衣壳蛋白在CD中显著富集。此外，CD组中病毒-细菌相互作用的特化程度更高，细菌组和病毒组组合可以更好地区分CD患者和健康对照。综上所述，本研究展示了CD患者肠道微生物组中病毒组成变化的全貌，并强调了病毒组生物标志物在CD发病机制和CD风险和疾病状态的准确诊断中具有巨大潜力。  

论文ID

原名：Dysbiosis of the stool DNA and RNA virome in Crohn’s disease

译名：克罗恩病患者粪便DNA和RNA病毒组的生态失调

期刊：Journal of Medical Virology

IF：20.693

发表时间：2023.2

通讯作者：马延磊

通讯作者单位：复旦大学上海医学院

DOI号：10.1002/jmv.28573  

实验设计

结果

1. 改进病毒组鉴定和数据分析流程

本研究共纳入28例符合条件的受试者，包括14例CD患者和14例健康对照(通常是患者的配偶或伴侣)。其中8个样本在CD活动期收集，6个样本在CD缓解期收集。研究对象的详细临床数据包括Montreal分类、疾病程度、药物使用情况、并发症和血清指标(附表1)。在本研究中，通过宏病毒组学和宏基因组学方法分析了每个微生物组样本中的DNA/RNA病毒和细菌(图1A)，然后作者结合参考数据库方法和新方法，开发了一个更完善的病毒组鉴定和数据分析工作流程(图1B)。简而言之，该流程通过使用Blast与病毒参考数据库(Virus-NT)进行比对，鉴定确认的和疑似的病毒重叠群(contigs)。该新方法包括两个步骤：首先，使用Blast或Hmmersearch将测序数据与三个病毒数据库(Virus-NT、virus-NR、病毒蛋白质家族的HMMs模型)进行比对，获得候选病毒重叠群；然后，将这些候选病毒重叠群分别与NT和NR数据库比对，去除假阳性病毒重叠群。下述分析中使用的病毒数据集包括了以往研究已确认的病毒和新方法分析得到的病毒。最后，作者从改进的病毒组鉴定流程中确定了符合质量要求的8658个DNA病毒重叠群和3282个RNA病毒重叠群；相比之下，新方法确定了5293个DNA病毒重叠群和2259个RNA病毒重叠群(图1C)。这一结果表明，将参考数据库方法与新方法相结合，扩大了病毒组的发现范围，并首次用于更准确地表征CD患者和健康对照中的病毒组。

图1

改进的病毒组鉴定和数据分析工作流程。(A)实验流程。(B)改进的新型病毒鉴定和数据处理工作流程。(C)通过参考数据库和新方法获得的DNA/RNA病毒重叠群的比较。CD，克罗恩病；VLP，病毒样颗粒；DB，数据库；FP，假阳性；Pfam，蛋白家族。  

2. CD患者病毒多样性受到影响

从富集的粪便病毒样颗粒中共获得了28532250±11194909和32380809±11743548条质量合格的双端测序读长(reads)，用于DNA和RNA病毒组分析(附表2和附表3)。经过组装和注释，根据重叠群计算出RPKM值，用于差异表达分析(附表4)。在本研究中，CD患者的DNA和RNA病毒组的α多样性中值均下降(附图1A-B，附表5)，但Shannon或Chao1多样性指数变化均不显著。值得注意的是，在各组受试者中，CD队列离散程度最高，表明患者之间的异质性非常高。此外，作者还研究了病毒α多样性与疾病状态的关系(图2A-B)，虽然CD活动期时DNA和RNA病毒组都有所增加，但并无显著性差异。

为了展示样本之间的病毒组差异，研究人员使用主成分分析(PCA)计算β多样性。结果显示，CD患者与健康对照组的DNA病毒组出现了明显分离(PCA1和PCA2：8.4%和7.5%，附图1C)。相比之下，两组之间的RNA病毒组没有显著性差异(附图1D)。此外，作者还观察到CD的疾病状态(缓解或发作)之间的病毒组β多样性不同，但没有显著性差异，这可能是由于样本量小(图2C-D)。此外，Bray-Curtis差异分析结果显示，CD患者(尤其是缓解期患者)的DNA和RNA病毒群落差异高于健康对照组(图2E-F和附图1E-F)，这一结果支持之前观察到的患者之间的高度异质性。综上所述，CD患者的病毒组，尤其是DNA病毒群落，与健康对照相比具有独特的多样性和微生物距离。

图2

 CD患者的病毒多样性受到影响。(A-B) CD活动期患者、CD缓解期患者和健康对照组的粪便中，基于(A) Shannon多样性和(B) Chao1丰富度指数的DNA和RNA病毒组α多样性比较。(C-D) CD活动期患者、CD缓解期患者和健康对照组的粪便DNA和RNA病毒群落结构差异的主成分分析(PCA)。PERMANOVA检验显著性。(E-F)比较CD活动期患者、CD缓解期患者和健康对照组的组内粪便DNA和RNA病毒群落的Bray-Curtis差异。统计学显著性由t检验(A-B组)或Wilcoxon-Mann检验(C-F组)确定(P<0.05)。

3. CD特异性真核TTV病毒组特征

根据RPKM值，作者分析了噬菌体和真核生物病毒的比例(附图2A)。就DNA病毒组而言，两组中真核病毒的流行率都有所增加。在RNA病毒组中，所有注释的RNA病毒都是真核病毒，这反映现有数据库中已知的RNA噬菌体较少。基于LEfSe，作者确定了组间差异的DNA病毒标记，并发现真核病毒在CD患者中占优势地位(图3A)。在科水平上，真核指环病毒科(Anelloviridae)是在CD中检测到的优势病毒，而丝状噬菌体科(Inoviridae)是在健康对照组中发现的优势病毒(图3B)。在属水平上，患者组中富集了Alphatorquevirus、Betatorquevirus和Gammatorquevirus(都属于指环病毒科)，而对照组中富集了丝状噬菌体科的属Amigovirus和Ilzatvirus(都是噬菌体)(图3C)。与这些发现一致的是，相对于对照组的粪便，CD患者粪便中属于指环病毒科的33种不同细环病毒(Torque teno virus，TTV)、以及噬菌体Faecalibacterium phage FP Brigi、Escherichia phage D6/sp.、Escherichia virus P2 4B2/4E6b和Streptomyces phage RosaAsantewaa的丰度更高，而噬菌体Microviridae sp.、Bacteriophage sp.、Inoviridae sp.和Roseburia phage Jekyll的丰度较低(图3A)。综上，这些结果表明CD患者中DNA病毒组有一种特殊的生态失调特征，特别是CD粪便中TTV和与疾病相关的噬菌体占优势地位，而在健康受试者中一些稳定和多样的原核病毒更为丰富，表明CD中宿主与真核病毒之间的相互作用增加。

本研究还基于LEfSe鉴定了CD组和健康对照组之间的差异RNA病毒组标志物，但在科和属水平上未观察到组间的显著差异。值得注意的是，感染番茄的Beihai tombus-like virus 15是CD组粪便中的优势病毒，而CD组粪便中Picobirnavirus sp.的丰度比对照组低(图3D)。综上所述，CD组粪便Beihai tombus-like virus 15丰度更高，可能表明番茄相关饮食对CD有不利影响。同时，小双节段双链RNA病毒Picobirnavirus在CD中丰度较低，这是一种在健康宿主中经常检测到的病毒，这与CD患者的RNA病毒组中出现的肠道生态失调的结果一致。

据目前所知，人类肠道中存在着多样性极高的病毒暗物质，它们无法与数据库中已知的序列比对。为了探究病毒组可鉴定部分组成的变化是否能反映病毒组的整体情况，作者分析了两组DNA病毒组组成中物种水平(基于RPKM值)和重叠群(contigs)水平的差异。作者量化了所有研究对象中核心病毒物种、常见病毒物种和独特病毒物种或重叠群(分别对应>50%、20% ~ 50%和<20%的个体共有的病毒物种或重叠群)的比例(附图2C和2D)。值得注意的是，虽然常见重叠群和独特重叠群的比例显著高于其物种水平，但健康组和CD组之间并没有显著差异(附图2B)。然后，作者分别评估了这些病毒物种和重叠群的丰度，发现虽然在重叠群水平核心重叠群的比例较低，但健康人群和CD患者中常见和独特的重叠群表现出明显的差异性肠道病毒组聚类(附图2E和2F)。综上所述，许多未注释的序列和病毒亚种尚未在物种水平上得到鉴定，这凸显了病毒暗物质的存在及其对样本异质性的影响。

图3

CD-特异性真核TTV病毒组特征。(A) LEfSe(LDA≥2)分析CD组和健康对照组之间差异丰富的DNA病毒的线性判别分析得分直方图(f:科，g:属，s:种)。(B-D)在DNA病毒科(B)、属(C)和RNA病毒种(D)水平比较CD组和健康组粪便病毒的相对丰度。

4. 不同CD疾病状态患者具有不同的粪便病毒组

改变肠道菌群的组成以促进肠道内稳态被认为是一种有望加速炎症性肠病(IBD)组织恢复和延长缓解期的方法。为了确定CD的疾病状态是否与肠道病毒组的组成相关，作者在CD活动期患者和CD缓解期患者之间进行了LEfSe分析(图4A)。活动期和缓解期患者的RNA病毒组无显著差异。然而，在DNA病毒组中，与缓解期相比，在活动期患者中发现13种来自指环病毒科的TTV以及3种Staphylococcus phage增加，表明真核TTV和原核Staphylococcus phage在CD患者中具有炎症特异性。相反，在缓解期有4种噬菌体(包括Bacteriophage sp.、Propionibacterium phage、Streptococcus phage和Escherichia virus)的丰度增加。鉴于这些发现，作者还注意到，与缓解期患者和健康对照组相比，活动期患者中指环病毒科的比例较高(附图3A)，因此，未来需要大样本量研究，在CD患者中验证活动期特异性的病毒组。此外，尽管这些患者的肠道DNA病毒组之间的异质性很高，但不同CD疾病状态之间存在显著差异(图4B)。这些结果表明，在CD活动期和缓解期之间，病毒组的组成发生了独特的变化。

此外，作者使用冗余分析(RDA)评估了CD疾病状态与临床参数之间的关系(图4C)。在DNA病毒组中，与CD活动期(象限2)相关的参数包括多种治疗方法(口服/静脉糖皮质激素、抗生素、TNF抑制剂、生物制剂)、血清C反应蛋白(CRP)水平、肛周疾病和肠道手术史。血清白蛋白水平是唯一与CD缓解期相关的指标(象限4)。然而，在不同疾病状态的队列之间，RNA病毒组无显著离散性和临床相关性(附图3B)。这一结果支持CD活动期患者通常有严重的并发症和联合治疗史，这可能与CD活动期和缓解期患者之间肠道病毒组的部分差异有关。

图4

不同CD疾病状态之间粪便病毒组的差异。(A)通过LEfSe(LDA≥2)分析CD活动期和CD缓解期之间差异丰富的DNA病毒的线性判别分析得分直方图(f：科，g：属，s：种)。红色的病毒分类群名称表示TTV。(B)热图表示CD活动期、CD缓解期和健康对照组的差异病毒种类。根据RPKM值，用颜色表示病毒种类的丰度。(C)基于DNA病毒组，疾病状态与临床参数之间的关系的RDA图。红色标记的临床参数(第2象限)表示可能接近活动期患者，而蓝色(第4象限)表示可能接近缓解期患者。箭头的长度代表与RDA轴的相关程度。

5. CD患者粪便病毒组的功能谱

为了评估粪便病毒组的功能，作者基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)、基因组基因本体(GO)、蛋白质家族(Pfam)和UniProt数据库分析了病毒序列。其中，DNA修复和重组蛋白(KEGG)、分子结合(GO)、TTV-ORF1/2(Pfam蛋白)和细胞成分(UniprotKB)是主要的通路/功能(附图4A-D)，表明病毒在病毒-宿主生物学中发挥了积极作用。

然后作者比较了CD患者和健康对照之间的病毒预测功能。在KEGG、GO、Pfam和UniProtKB蛋白功能方面，尽管异质性极高，但CD患者和健康对照组之间的DNA病毒功能存在显著性差异(图5A)。在CD患者粪便中发现的几种DNA病毒功能比健康对照更丰富，包括DNA复制、N-甲基转移酶活性、DNA模板调节转录、翻译、核糖体、泛素、衣壳蛋白、ORF2和ORF2/4蛋白，所有这些都与病毒DNA复制、整合、修饰以及真核病毒衣壳蛋白功能有关(图5B)。在RNA病毒组中，CD患者中的一些蛋白水平功能(包括肽酶PA和非结构性多聚蛋白)增加(图5C)。总之，这些结果再次表明CD患者中富集的病毒组功能与病毒-宿主相互作用有关。

这些功能注释结果也表明，CD的发病机制与特定的真核TTV相关(图5D)。病毒ORF2的表达和特有的衣壳蛋白组分是TTV病毒直接作用于宿主肠道细胞的关键桥梁，这与CD相关的病毒功能衣壳蛋白、ORF1/2和ORF2/4蛋白的增加以及指环病毒科的相对丰度相一致。

图5

CD患者中病毒组的功能谱。(A)热图展示了CD患者和健康对照组中DNA病毒功能。基于KEGG、GO、Pfam和UniProt对病毒功能进行预测。(B-C) CD患者和健康对照之间差异富集的(B) DNA和(C) RNA病毒功能。(D)热图展示了CD患者和健康对照组之间差异病毒功能与前30个差异丰富DNA病毒物种之间的Spearman相关系数。红色标记的病毒分类单元名称表示TTV。采用Wilcoxon秩和检验进行差异检验。  

6. CD患者的粪便细菌组改变和病毒-细菌相互作用

然后，作者进一步评估了与健康对照组相比，CD患者粪便细菌组的变化。细菌α多样性Shannon指数和Chao1指数显著降低(附图5A)，表明CD患者的细菌多样性减少。β多样性PCA可以明显区分CD与健康对照的细菌。在科、属和种水平，CD患者中的粪便细菌组具有与对照组不同的结构(附图5C-E)。基于LEfSe，鉴定了用于区分健康对照和CD患者的多种差异细菌标志物(附图5F)。其中，在CD患者中，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、Enterocloster、肠杆菌属(Enterobacter)、Escherichia和大肠杆菌(种)的丰度量显著高于对照组，而Faecalibacterium、Roseburia和Faecalibacterium prausnitzii(种)的丰度则降低。

为了表征粪便细菌组和DNA病毒组之间的关联，作者评估了它们的多样性和组成的相关性。作者检测到病毒-细菌Shannon和Chao1多样性之间存在较低相关性，但在获得的spearman相关性中没有显著差异(图6A和B)。然后，作者评估了在CD患者和健康对照中存在显著性差异的细菌种类和DNA病毒种类之间的相关性。特别是，大多数丰度存在差异的TTV物种(33个中的20个)与细菌物种Enterobacter cloacae和Escherichia coli呈正相关，而与细菌物种Faecalibacterium prausnitzii呈负相关(图6C)。这与CD患者中Faecalibacterium prausnitzii的丰度降低相对应，同时Faecalibacterium prausnitzii和噬菌体之间的相关性增加。有趣的是，Procrustes分析也揭示了CD患者中细菌和病毒群落组成与健康之间的重要关联(图6D)。在RNA病毒组中，尽管Procrustes分析中得到的病毒-细菌关联有限(附图6A-B)，但Picobirnavirus sp.与丁酸产生菌Roseburia intestinalis呈正相关。此外，作者评估了不同疾病状态队列中的病毒-细菌关系。与缓解期相比，在CD活动期观察到病毒-细菌的相关性普遍减弱(附图6C-D)。作者还发现，活动期TTV、Bacteriophage sp.、Bacteroides phage B124-14和粪便细菌之间存在一些特别密切的相关性，而在缓解时它们显著减少。综上所述，这些结果表明，在CD发病机制和疾病状态中，病毒与细菌的相互作用发生了变化，特别是特定细菌和病毒的出现和消亡，进一步证明了病毒组研究对于理解与人类健康有关的整体微生物平衡的重要性。

图6

 CD患者中的细菌组改变和病毒-细菌相互作用。(A-B) DNA病毒组和细菌组计数的(A) Shannon多样性和(B) Chao1丰富度之间的Spearman相关性。(C)热图展示了CD患者与健康对照之间差异DNA病毒种类和差异细菌种类之间的Spearman相关系数。红色标记的病毒分类单元表示TTV。(D) Procrustes图展示了比较DNA病毒组和细菌组的PCoA分析结果。  

7. 病毒组组成有助于区分CD患者和健康对照

然后，作者采用随机森林分析探讨了DNA病毒组和细菌组标志物的诊断价值。在分类器中权重最高的前30个病毒组物种被选为最佳标记物(图7A)，其中4个贡献最大的病毒组物种中有3个是CD组与健康组相比增加的TTV物种，这突出了真核病毒组标志物的重要性。接下来，从细菌组数据集中筛选出最重要的20种细菌(图7B)。其中，粪球菌(Coprococcus)贡献最大，其次是Eubacterium ventriosum。值得注意的是，Roseburia ininalis、Roseburia inulinivorans和Faecalibacterium prausnitzii的CRISPR间隔序列与Faecalibacterium phage FP Brigit和Roseburia phage Jekyll一致。鉴于丁酸产生菌Faecalibacterium和Roseburia物种与健康肠道的关联，这些发现进一步证明了健康病毒组和健康细菌组之间的相互依赖性。最后，结合病毒组和细菌组标志物，并进行受试者工作特征曲线分析，以评估各模型的准确性(图7C和D)。病毒组和细菌组联合应用的曲线下面积(AUC)最大，为0.993，高于单独应用病毒组(AUC为0.882)和单独应用细菌组(AUC为0.878)。其中，病毒组在前30个最重要的特征中贡献了12个，包括7种TTV，成功地预测了CD患者。

图7

病毒组组成有助于区分CD患者和健康对照。(A) DNA病毒组、(B)细菌组和(C)病毒组和细菌组组合的每个分类器的前30个物种权重。红色标记的病毒分类单元表示TTV。(D)三种模型的ROC曲线分析。AUC，曲线下面积；CD，克罗恩病；ROC，受试者工作特征曲线。

讨论

本文报道了一种全面优化的克罗恩病患者粪便病毒组分析方法(改进的病毒鉴定和数据分析流程)。通过研究，作者在CD中发现了生态失调病毒组，其特征是病毒丰度增加，尤其是TTV (DNA病毒)和感染番茄的Beihai tombus-like virus 15 (RNA病毒)，以及病毒多样性降低。疾病状态与病毒组组成的变化相关，CD活动期患者样本中TTV物种比缓解期更丰富。作者还观察到CD患者的多种功能发生改变，这些改变与病毒DNA复制、整合和修饰以及真核TTV相关衣壳蛋白有关。此外，跨界分析支持了病毒组和细菌组生态失调在CD中的相互作用和诊断能力。总之，这些发现强调了病毒组生物标志物在CD发病机制和准确诊断CD风险和疾病状态方面的巨大潜力。

首先，作者分析了CD患者和健康对照组之间的病毒多样性。病毒组分析没有发现两组之间病毒α多样性的差异，这与之前的研究结果一致，这意味着疾病中以真核病毒为主的病毒组取代了对照组中的健康噬菌体。此外，组内个体之间的肠道病毒组具有独特性和异质性(尤其是在CD患者中)，这与之前关于人类肠道病毒组复杂多样性的报道一致。因此，作者推测CD患者可能存在严重的病毒组生态失调。

接下来，作者比较了两组之间丰度存在差异的粪便病毒，发现噬菌体Microviridae sp.和Bacteriophage sp.是人类肠道中最稳定的定植病毒，这些病毒在健康对照中大量存在。此外，本研究中CD患者粪便中Faecalibacterium phage FP Brigit、Escherichia phage D6/sp.和Escherichia virus P2 4B2/4E6b的丰度增加，与结肠炎小鼠和IBD患者面部的发现一致。更重要的是，作者发现在CD患者中，真核病毒指环病毒科，特别是33种TTV的丰度显著增加，其与CD的关系尚未报道。很明显，真核病毒和噬菌体以不同的方式影响人类宿主，本研究结果强调了单独分析噬菌体和真核病毒组的重要性。许多人类流行病学研究已经证实，TTV是一种机会性病原体，与免疫失衡和合并症有关。最近的一项研究发现，在接受免疫抑制药物治疗的移植后人类患者中，TTV占病毒组的65%以上，这支持了TTV在临床上与CD等各种慢性免疫性疾病相关的可能性。更重要的是，在TTV分离株的ORF蛋白质中发现了与自身抗原相似的氨基酸序列基序，这些基序与自身免疫性疾病相关。动物实验发现，巨噬细胞系中ORF蛋白的过表达导致IL-10、PD-1和SOCS-1上调，与慢性感染相关。因此，作者从致病机制的角度，提出TTV可能诱发CD发病的假设。总之，本研究结果表明，健康受试者的病毒组稳定，主要是噬菌体病毒组，这在各个研究中都有报道。然而，与健康相关的病毒组在CD患者中不存在，似乎被个体特异性的真核病毒所取代，这与最近的一项研究部分一致，该研究描述了IBD患者粪便中真核病毒丰富度增加。这表明，毒力强的真核病毒或异常噬菌体的不稳定积累与CD发病有关。

然后，作者分析了与疾病状态相关的病毒组多样性和组成的变化。从组成上看，CD活动期患者病毒组与健康对照距离最远，异质性最大，表现出最大的病毒多样性，可能反映了疾病的严重程度。值得注意的是，CD活动期患者的TTV物种相对丰度显著高于CD缓解期患者。这一结果与既往真核病毒感染在活动期IBD患者中较为常见的研究结果一致，再次支持了疾病特异性真核病毒替代噬菌体可能与CD发病及疾病状态相关的可能性。

最后，同样重要的是，作者确定了病毒组和细菌组的生态失调，并提供证据表明CD患者肠道病毒组的变化与细菌组的变化同时发生。多项研究表明，CD患者肠道菌群中细菌多样性降低，丁酸产生菌(如F. prausnitzii)丰度降低，黏附侵袭性大肠杆菌的丰度增加，这些发现与本文数据一致。已知噬菌体是细菌适应性和多样性的主要驱动因素。在这项研究结果中，CD患者的特征是复杂和倾斜的噬菌体-细菌动态平衡。在CD患者粪便中，观察到Faecalibacterium phage丰度增加，Faecalibacterium phage与F. prausnitzii之间存在拮抗关系。这一结果与之前研究一致，即Faecalibacterium phage可触发或加剧IBD患者的Faecalibacterium prausnitzii消亡。作者还观察到Escherichia物种和噬菌体在CD粪便中的共增加现象，这与之前的报道一致，这可能表明在CD患者中与应激相关的特有的噬菌体-细菌动态“军备竞赛”。此外，在CD缓解期，病毒组和细菌组之间的相关性比在活动期的相关性更明显。这一发现表明，病毒-细菌之间的联系容易受到CD发作和缓解之间的干扰，或者反映出CD的严重程度与特定的病毒-宿主相互作用相关。在随机森林模型中，作者观察到细菌组和病毒组组合后的AUC提高到99%以上。特别是，TTV物种贡献了12个贡献病毒组中的7个。虽然需要未来的研究来验证该模型，但它确实提供了证据，证明肠道菌群的变化在细菌组和病毒组中都存在，而且CD特异性真核TTV在疾病诊断和治疗方面具有巨大潜力。

尽管本文研究结果较新颖，但值得一提的是，它也存在一些不足。首先，样本量不足以全面阐明和验证CD的病毒组变化，特别是不同疾病状态的病毒组。因此，有必要根据足够的临床样本，特别是来自同一患者的纵向随访样本进行验证。其次，由于CD患者的异质性高，有多种药物治疗史，在未来的研究中，详细的治疗前亚组分类或不同的药物史将使我们更深入地了解病毒组数据集。最近的研究已经证实了地理因素对肠道微生物组组成的影响，未来计划可以通过多区域、多中心的合作研究来进一步探讨地理因素对克罗恩病患者病毒组的影响。此外，当前病毒组数据库缺乏足够的深度，限制了我们检测测序数据中可能存在的其他病毒的能力，而这只能通过大量扩展现有数据库中的病毒组序列和注释来解决。最后，本研究只鉴定了CD特异性病毒TTV，而没有对CD发病的潜在机制进行研究。但是，这一限制有望在未来通过设计良好的体外和体内实验来解决。

综上所述，本研究强调了肠道病毒在克罗恩病发病机制中的重要性。疾病特异性真核病毒替代多样化和稳态噬菌体与CD有关，特别是活动期。虽然还需要更多的临床验证和机制研究，但本研究展示了克罗恩病患者肠道病毒组变化的整体情况，并强调了病毒组生物标志物在治疗和准确诊断克罗恩病风险和疾病状态方面的巨大潜力。

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