科研丨南方医科大学: 肠道菌群在妊娠期糖尿病中的作用机制(国人佳作)

编译：微科盟溧阳，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

肠道微生物失调引起的代谢紊乱被认为是妊娠期糖尿病(GDM)的重要原因。越来越多的证据表明，肠道微生物的多样性和组成在疾病状态下发生了改变，但疾病调节的关键微生物和机制仍不明确。检索PubMed®、Embase®、Web of Science™和Cochrane Library数据库，以确定2012年7月7日至2022年7月7日期间发表的关于分析GDM患者与健康个体之间肠道细菌差异的病例对照和对照研究的文章。收集肠道细菌相对丰度的信息进行多样性比较，并采用随机效应分析肠道细菌差异。本文共纳入22项研究，共涉及965名GDM患者和1508名健康参与者。α多样性在各组之间没有差异，但β多样性有显著差异。厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)为优势细菌，但两组间差异不显著。定性分析显示，组间厚壁菌门/拟杆菌门比值、Blautia和Collinsella存在差异，但无统计学意义。综上所述，GDM群体和非GDM群体的肠道细菌谱存在显著差异。GDM患者的α多样性与健康个体相似，但β多样性显著不同。厚壁菌门/拟杆菌门比值在GDM中显著增加，同时Blautia和Collinsella丰度发生变化，这可能是微生物群多样性变化的原因。虽然我们的荟萃分析结果令人鼓舞，但还需要进行更多的研究来阐明肠道微生物组在GDM中的作用。

论文ID

原名：Mechanismbased role of the intestinal microbiota in gestational diabetes mellitus: A systematic review and meta-analysis

译名：肠道菌群在妊娠期糖尿病中的作用机制：系统回顾和荟萃分析

期刊：Frontiers in Immunology

IF：8.786

发表时间：2023.3

通讯作者：杨杏芬，吴为

通讯作者单位：南方医科大学公共卫生学院

DOI号：10.3389/fimmu.2022.1097853

实验设计

结果

1.检索结果与研究资格

从四个数据库(PubMed，155篇；Embase，34篇；CochraneLibrary，48篇和Web of Science，395篇)中共检索到632篇文章。其中106篇为重复文章被删除，354篇因报道了不同的研究目的而被排除，20篇因描述了其他研究设计而被排除。在排除了不符合纳入标准的文章后，剩下22篇研究，并对全文进行了系统回顾。在所有入选的研究中，有18项研究在亚洲进行(16项来自中国，1项来自马来西亚，1项来自日本)。9项为队列研究，13项为案例研究。参与者的年龄从28岁到45岁不等。记录的参与者信息包括血液生化指标、慢性炎症和生物标志物。这些研究大多采用国际妊娠期糖尿病协会的标准，只有一项来自泰国的研究选择了自己的标准。由于分析方法不同，粪便样本的存储温度也不同(一项研究为-20℃，19项研究为-80℃)。我们将重点放在比较GDM患者与健康个体存在的差异。一篇文章根据参与者的血压和血脂测量结果将他们分为四组。因此，我们只考虑了GDM组和健康组。一篇文章没有排除那些在怀孕期间服用益生菌或抗生素治疗的个体。只有两篇文章包含了样本量计算，这使得这些研究比其他研究更可靠。

图1 本研究的PRISMA流程图。

2.纳入研究的质量

采用NOS进行质量评估。每项研究均基于3个标准进行评估，即受试者的选择、组间可比性(即无混杂偏倚)和暴露(结果影响的测量)。10篇被评估为质量尚可，12篇被评估为质量良好，没有研究属于质量差。每项研究的详细评分见图2。

图2 使用NOS计算纳入文章的质量评分。通过计算三个指标得出文章的总体质量评分和发表偏倚风险。

3.GDM检测和研究标准

一般来说，GDM是在怀孕24-28周诊断，使用国际妊娠期糖尿病研究协会(IADPSG)基于2小时口服75克葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果制定的标准。如果一个或多个血糖水平升高，孕妇被诊断为GDM，如下：空腹≥5.1 mmol/L，1小时≥10.0 mmol/L，2小时≥8.5 mmol/L。参与者的基本人口统计学和临床特征见补充表3。

纳入的研究包括965名GDM患者和1508名健康人。为了获得更客观的结果，只有四项研究记录并考虑了研究前的身体质量指数(BMI)。患有其他代谢性疾病或曾使用抗生素或益生菌治疗的参与者被排除在外。

4.所选文章关于粪便样本的方法学特征

粪便样本一般储存在-80°C，除了一项研究中，样本储存在-20°C。研究使用了多种DNA提取试剂盒。只有QIAamp Fast DNA StoolMini试剂盒(Portsmouth，NH，USA)使用超过两次。在V3-V4区的DNA测序是最常见的技术，在15项研究中使用。4项研究在V4区测序，1项在V1-V2区测序，1项在V6-V8区测序。OTUs的聚类有四个标准，分别是95% OTUs(1/22)、97% OTUs(13/22)、99% OTUs(5/22)和100% OTUs(1/22)。分类注释主要使用SILVA(6/20)、RDP(3/22)和Greengenes(5/22)数据库训练的RDP(核糖体数据库项目)分类器进行。

5.α多样性和β多样性

多样性通常被称为α多样性和β多样性。它们被用来描述肠道菌群的物种组成，被认为是可能影响结果的重要因素。α多样性可以预测物种数量和个体分布，即丰富度和均匀度，可以通过ACE、Chao1、Simpson和Shannon指数来衡量。在纳入的研究中，有4项比较了GDM和非GDM患者的ACE[SMD -0.28 (95% CI：-1.98~1.42)，P=0.75，I2=98%]。6项研究报道了Chao1指数用于质量评估[SMD 0.48 (95% CI：0.23~0.73)，P< 0.05，I2= 67%]。6项研究提供了Shannon指数[SMD -0.06 (95% CI：-0.67~0.94)，P=0.84，I2=88%]，7项研究提供了Simpson指数[SMD -0.44(95% CI：-1.30~0.41)，P=0.31,I2= 95%]。各组指标均相同(图3)。

异质性评估的结果没有我们预期的那么好。I2值>50%，异质性强。这种异质性的来源有待进一步探讨。因此，我们进一步进行敏感性分析，依次省略每项研究，以确保结果的准确性和稳定性。若将某篇文章从指标中剔除后，I2值和P值都是稳定的，说明该文章具有稳定的敏感性分析结果。此外，为了检验我们的假设，即结果是可靠的，我们根据漏斗图的对称性，使用Egger检验评估了发表偏倚的风险。结果显示，各指标的P值均大于0.05，无发表偏倚的证据，表明Meta分析的结论相对稳健。

17篇文章报道了β多样性，其中11篇采用了主成分分析(PCA)，10篇采用了主坐标分析(PCoA)。因为结果大多以图形式提供，而没有具体数据，所以无法对β多样性进行可靠的分析。

图3 比较GDM和NGDM之间α多样性的随机对照试验森林图。(A) ACE的SDs；(B) Chao1；(C) Shannon指数的结果；(D) Simpson指数。

6.亚组分析

由于在分析中遇到了显著的统计异质性，所以分别对几个亚组进行分析。如果在至少两篇文章中进行了报道，则对肠道微生物组和饮食摄入量进行分类分析。属水平的肠道微生物亚组分析显示，GDM组Blautia[SMD 0.36，(95% CI，0.02~0.71)，P=0.04，I2=0%]和Collinsella[SMD -4.18，(95% CI，-8.73~0.38)，P=0.38，I2=78.9%]的丰度显著高于对照组。Clostridium[SMD -0.47，(95%CI，-0.92~-0.01)，P=0.187，I2= 42.4%]和Faecalibacterium[SMD -0.19，(95%CI，-0.42~0.04)，P=0.971，I2=0%]的丰度组间无差异。同样，亚组分析显示，与低纤维摄入量相比，高纤维摄入量可以预防GDM(SMD -0.96，(95% CI，-0.95~-0.43)，P<0.05, I2=92%)，而患者和对照组参与者在能量摄入(SMD -0.46，(95% CI，-1.84~0.93)，P=0.52，I2=97%)、谷物摄入(SMD -0.31，(95% CI，-0.92~0.29)，P=0.31，I2=86%)、肉类摄入(SMD -0.08，(95% CI，-0.31~0.15)，P=0.15，I2=93%)和牛奶摄入[SMD -0.66，(95% CI，-1.55~0.24)，P=0.15，I2=93%]方面没有差异，尽管在所有分析中仍存在相当大的异质性。

表1 肠道菌群与饮食摄入影响的亚组分析。

7.怀孕期间肠道微生物丰度的差异                

本研究比较了GDM患者和健康参与者的肠道菌群。9篇文章在门水平上进行了分析。3篇文章认为厚壁菌门在GDM患者中丰度较低，而2篇文章报道了相反的结果。拟杆菌门在GDM患者中更丰富。两篇文章报道了放线菌门的丰度在GDM患者中更低。四项研究报告了GDM患者中变形菌门的丰度高于健康对照。只有一项研究得出了相反的结论。三项研究比较了厚壁菌门/拟杆菌门，其中两项研究发现它们在GDM组的丰度更高。    

在纲水平上，一项研究提到来自放线菌门的Rothia、Actinomyces、Bifidobacterium、Adlercreutzia和Coriobacteriaceae在GDM组中减少。在科水平上，不同研究之间有轻微的差异。GDM患者中Veillonellaceae和Prevotella group 9丰度均增加，而Lachnospiraceae和Ruminococcaceae则减少。一些研究得出了关于Streptococcaceae、Enterobacteriaceae、Lachnospira、Clostridiales、Clostridia和Firmicutes有争议的结论。两项研究发现，在科水平上，GDM患者中Clostridiales科成员增加。    

在属水平上的研究最为常见。我们发现Ruminococcaceae、Lactococcus、Escherichia、Lachnospiraceae、Clostridia、Alistpes、Firmicutes和Phascolarctobacterium富集。Streptococcus和Bacteroidetes的检测结果各不相同。我们还发现，在健康对照中，Coprococcus、Staphylococcus、Oscillospira、Burkholderiales、Akkermansia、Prevotella group 9和Faecalibacterium富集。Blautia、Staphylococcus、Sutterella、Oscillospira、Enterococcus和Lactobacillus的丰度也存在差异，有待进一步研究。    

本文对四种优势细菌进行了进一步的随机森林分析。变形菌在GDM中相对丰富[SMD -0.44，(95% CI，-1.3~0.41)，P=0.31，I2=95%]，而放线菌[SMD -1.64，(95% CI，-2.32~-0.95)，P<0.05，I2=94%]、拟杆菌[SMD 7.96，(95% CI，-7.77~23.69)，P=0.32，I2=100%]、厚壁菌门[SMD 0.25，(95% CI，-0.01~0.51)，P= 0.06，I2=49%]和变形菌[SMD 1.10，(95% CI，-1.59~3.80)，P=0.42，I2=99%]在两组间无显著差异。

8.肠道菌群类型及其对GDM的影响

为了进一步探讨GDM患者关键临床指标与肠道微生物改变的潜在相关性，采用Spearman分析进行相关性分析。结果表明，Bacteroidetes与1小时血糖水平(1hPG)呈正相关，而Proteobacteria、Verrucomicrobiota、Actinobacteria与1hPG呈负相关。在属水平上的分析显示，Ruminococcaceae UCG014与1hPG呈负相关，但Ruminococcaceae UCG014与高密度脂蛋白(HDL)水平呈正相关。Akkermansia与1hPG呈负相关，与HDL水平呈正相关。Chen等人研究发现，厚壁菌门中的Clostridiales、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae与至少一个OGTT值呈显著负相关。厚壁菌门中Enterococcaceae的一个未分类属、放线菌门中的Atopobium和变形菌门中的Sutterella与1-h或2-h OGTT值呈显著正相关。

两项研究报告了炎症、粪便钙卫蛋白(FCALP)、脂多糖(LPS)、脂多糖结合蛋白(LBP)和粪便脂多糖(FLPS)指标。GDM患者zonulin、FCALP、LPS、LBP和FLPS水平高于非GDM患者，结果具有统计学意义。Cui等人报道Enterococcus和Vagococcus与FCALP和LPS成正比，Streptococcus与LBP成反比，Staphylococcus与FLPS成正比。女性的饮食，包括总能量和纤维摄入量，在两次抽样之间保持不变。4篇文章报道了KEGG通路分析。每篇文章得出的结论差异很大。Chen等人发现了几种微生物基因通路，包括聚糖生物合成通路和维生素代谢通路。Li等人研究表明，在血糖正常孕妇(NOR)和GDM中发现的肠道微生物参与了细胞壁/膜/包膜生成、有机离子运输和代谢、翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣、转录、未知功能、细胞内运输、分泌和囊泡运输。Su等人发现GDM患者中丰富的拟杆菌种类与氨基糖和核苷酸糖代谢呈正相关。Wang等人发现，患有GDM的女性的预测宏基因组中参与淀粉和蔗糖代谢的生物丰富，而参与赖氨酸生物合成和氮代谢的生物则减少。

图4 肠道生态失调与GDM的潜在联系机制。肠道通透性受饮食因素和zonulin途径的调节。肠上皮基底层的细胞分泌zonulin，并结合启动复杂的细胞内信号通路，允许磷酸化紧密连接。当LPS进入主循环时，增加其吸收，并与LBP形成复合物，进一步结合单核细胞释放的CD14，导致MD2/TLR4受体复合物介导的促炎细胞因子的产生，如TNF-α、白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素6(IL-6)。LPS浸润外周脂肪组织，与TLRs结合，激活接头蛋白MyD-88、IRAK、TAK1、TRAF6，引发巨噬细胞浸润，上调炎症通路。上调JNK/IKKb/NF-κB可增加IRS-1+Ser307的丝氨酸磷酸化，导致PI3-K抑制和Akt下调Ser473。

讨论

据我们所知，这是第一篇系统分析肠道细菌差异如何影响GDM患者和健康个体代谢健康的文章。一致的证据表明，GDM的肠道菌群组成发生了改变。我们发现了不同组间微生物丰度的差异。这表明Blautia的增加和Clostridium的减少可能是潜在影响因素，因此可能通过重建肠道微生物的稳态来提供预防或治疗GDM的靶点。未来在这方面的研究是有必要的。本研究的主要目的是确定受试组之间的验证，这可能为肠道微生物群与GDM之间可能的机制联系以及导致疾病发展的途径提供见解。现有结果表明微生物组成与疾病之间存在关联。尽管研究方法存在差异，但研究间的肠道微生物多样性和组成结果基本一致。α多样性被广泛用于分析肠道微生物群的丰富度和均匀性。我们的荟萃分析表明，GDM与多样性指数的下降之间存在显著相关性，这表明受影响个体的物种丰富度降低了。虽然α多样性已被证明是慢性疾病的标志，如T2DM、结直肠癌和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，但多项研究表明，T2DM患者肠道微生物α多样性与健康受试者相比无统计学差异。

一些研究发现，与健康参与者相比，T2DM患者的α多样性略低，但没有显著降低。与胰岛素抵抗升高相关的丰富度(Shannon和Simpson指数)在GDM患者和健康个体中显示出重叠趋势。然而，我们的meta分析结果显示，GDM患者和健康个体之间的α多样性或丰富度没有显著差异，表明α多样性可能不是区分GDM患者和非GDM个体的标志性指标。与α多样性相比，β多样性在GDM组和对照参与者中有所不同，这突出了一个事实，即GDM患者肠道菌群的特征发生了改变。在门水平上的进一步研究确定了肠道微生物丰度被GDM改变的分类群，并表明拟杆菌和变形菌的增加以及放线菌的减少可能促进GDM的发生发展。

体外粪便发酵后鉴定出的门主要为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门。此外，本综述还发现，GDM患者的厚壁菌门/拟杆菌门比值明显高于健康对照组。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道中两种主要的细菌群。它们通过参与脂肪和胆汁酸的代谢来维持宿主体内的能量平衡。厚壁菌门/拟杆菌门比值通常被用作肥胖和胰岛素抵抗中轻度全身炎症的标志，并作为不同个体肠道菌群组成的指标。与其他研究结果相似，厚壁菌门/拟杆菌门比值在GDM患者中较高，表明它是区分GDM患者与非GDM个体的敏感指标。动物实验表明，正常胃肠道的定植，如拟杆菌的培养实验所示，通过Toll样受体(TLRs)等特异性宿主-微生物间交互作用介导的定植是宿主免疫系统识别和选择的结果。一般来说，胰岛素抵抗与厚壁菌门/拟杆菌门比率升高以及产生丁酸盐的细菌数量减少有关，而拟杆菌作为健康成人胃肠道微生物群中最稳定的组成部分，包含大多数产生丁酸盐的属。丁酸盐被认为是一种促进健康的分子，因为它可以增加胰岛素敏感性，发挥抗炎活性，调节能量代谢，增加瘦素基因表达。结肠中的丙酸刺激L-肠内分泌细胞释放胰高血糖素样肽1(GLP-1)和肽YY(PYY)，从而抑制食欲。它还可能到达门脉循环并被肝组织捕获，参与肝脏糖异生，降低脂肪酸和胆固醇合成酶的表达。

Blautia与许多疾病呈显著负相关，包括1型糖尿病(T1DM)、肥胖和克罗恩病。作为肥胖、心血管和代谢疾病的风险标志，Blautia丰度已被证明与内脏脂肪组织呈负相关。这可能是由于其具有潜在的抗炎作用，可降低T2DM患者TNF-α与IL-4的比值，平衡免疫与抗炎，有助于维持葡萄糖稳态，从而调节胰岛素信号转导，从而调节空腹血糖(FBG)水平。T1DM患者中Blautia的丰度与HbA1c和FBG结果一致。本研究确实发现Blautia丰度在GDM患者中略有升高，这可能是因为该疾病最常在孕早期被确诊。从妊娠早期到妊娠晚期，Blautia水平逐渐下降，导致丁酸盐产生减少，刺激中性粒细胞和巨噬细胞释放炎症因子。炎症因子的增加与纤维摄入量低有关，可能导致代谢紊乱，从而引起生态失调，加重炎症。毛螺菌科的Collinsella属通常被认为是一种严格厌氧病原体，产生乳酸，这通常与SCFAs相关。该类群丰度的降低与T1DM和T2DM患者的健康状况有关。这种细菌似乎受到低纤维饮食的刺激。体外和动物实验均表明，SCFAs通过改善上皮屏障、改变各种信号通路、抑制促炎细胞因子、上调抗炎细胞因子水平来调节肠道炎症。SCFAs刺激胰高血糖素的产生并向下丘脑发出信号，作为糖尿病的一种机制。丁酸抑制促炎细胞因子的产生，如TNF-α、IL-12和干扰素γ(IF-γ)，并上调单核细胞产生抗炎IL-10，从而产生抗炎作用。丁酸已被证明能减弱脂多糖刺激的促炎作用。高脂肪和低纤维的饮食可能会改变肠道菌群的正常组成和饮食发酵。饮食的改变可能导致过多SCFAs产生和从饮食中吸收能量增加。在患有GDM的女性中，厚壁菌门的相对丰度升高，而放线菌门和拟杆菌门的相对丰度降低。这种肠道菌群特征与代谢紊乱的表型相似，主要是由于肥胖表型所致。此外，研究中提到的代谢途径是与糖代谢相关的途径，如糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢等，这些代谢途径在GDM女性中较为丰富。我们对饮食状况的调查结果显示，两组个体(即GDM患者和非GDM个体)的能量摄入没有差异，但GDM组的膳食纤维摄入量较非GDM人群较低，这提示了GDM的可能机制。产丁酸盐的细菌，如Faecalibacterium和Akkermansia在整个膳食背景下对纤维摄入的反应趋势相同。因此，膳食纤维成分随着微生物群而增强。

肠道微生物还通过影响肠道通透性来调节代谢产物和内毒素的吸收过程。已有研究表明，妊娠晚期GDM的发生与肠内LPS的增加以及以血清LPS和链球蛋白水平升高为特征的肠粘膜损伤有关。本研究中，GDM患者炎症因子水平明显高于非GDM个体，这与特定的生理变化相一致。肠道通透性受饮食和zonulin通路的调节。肠上皮基底层细胞分泌zonulin，并结合启动复杂的细胞内信号通路，允许紧密连接磷酸化，从而导致通透性增加。当LPS准备进入主循环时，它会增加吸收，并与LBP形成复合物，进一步结合来自单核细胞的CD14。这可能导致MD2/TLR4受体复合物介导的促炎细胞因子的产生，如TNF-α、IL-1、IL-6和LPS，它们浸润外周脂肪组织并与TLRs结合，激活接头蛋白MyD-88、IRAK、TAK1和TRAF6，从而触发巨噬细胞浸润和炎症通路上调。JNK/IKKb/NF-κB上调可能增加IRS-1+Ser307丝氨酸磷酸化，导致PI3-K抑制和Akt下调Ser473。降低乙酸Ser473磷酸化可能会影响胰岛素信号，降低外周组织的葡萄糖摄取，导致GDM女性高血糖症状。

先前的研究表明，从饮食中获取能量的效率与特定的代谢途径有关，特别是那些与碳水化合物运输和利用有关的代谢途径。氨基酸对胰岛素作用也不敏感。支链氨基酸氨基转移酶(线粒体BCAT和细胞质BCAT)催化支链氨基酸(BCAAs)第一次可逆转氨/脱氨反应生成相应的α-酮酸。然后它们结合起来将α-酮戊二酸转化为谷氨酸；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸分别生成α-酮异己酸(KIC)、α-酮-β-甲基戊二酸(KIM)和α-酮异戊酸(KIV)。BCAA分解代谢的第二步主要由支链酮酸脱氢酶(BCKD)复合物的催化活性调节。支链酰基辅酶A(CoA)是由同源α-酮酸产生的。BCCA物种的完全代谢产生过氧化代谢物，随后在三羧酸循环(TCA)中利用生脂、生酮或生糖底物产生燃料(即ATP)。此外，在BCAA血清浓度升高的参与者的脂肪组织中，显著下调的BCAA分解代谢基因与高HOMA-IR值相关(P<0.05)。研究表明，乳杆菌属的细菌通过改善代谢受损小鼠的氨基酸代谢途径来帮助维持代谢稳态，从而通过增加能够通过AhR信号传导的肠道代谢物的可用性来更好地补偿受损的芳香烃受体(AhR)信号传导。据实验研究报道，肠道菌群可以直接利用色氨酸并产生细菌源性吲哚。例如硫酸吲哚和硫酸对甲酚，它们能刺激GLP-1并增加胰腺β细胞分泌胰岛素。同样，KEGG富集分析结果显示，到目前为止，下调最多的途径是BCAA降解途径。

本篇文中有几个不足之处。首先，样本量小意味着研究的准确性较低。其次，大多数文章没有提供足够的肠道微生物多样性和组成的具体指标，无法进行准确的定量分析。因此，这些研究提供的证据是不足的。第三，由于数据有限，我们无法通过采样时间、饮食、肥胖等因素对患者进行分层。对肠道微生物群的机制了解仍然有限，因此需要进一步研究以确定特定的生物标志物及其引起疾病的机制。