Nat Commun︱徐医大肖诚/周春艺/曹君利课题组揭示腹侧苍白球胆碱能神经元在慢性疼痛-抑郁共病中的作用

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撰文︱肖诚，周春艺  

责编︱王思珍，方以一

慢性疼痛的发病率高达15-30%，常伴有焦虑和抑郁等负性情绪障碍，严重影响人们的生活质量 [1-3] 。 但目前还缺乏疗效好副作用小的镇痛药物 [4, 5] 。 理想的镇痛靶点应仅减轻病理性疼痛反应，而不影响机体正常的疼痛反应，以保留机体适当的防御和回避行为，同时，又能改善疼痛相关的焦虑抑郁等伴发症状。基底前脑的腹侧苍白球（VP）是介导吗啡镇痛作用的重要脑区之一 [6, 7] ，可调节觉醒、新奇探索、奖赏和厌恶、情绪等诸多行为 [8-12] 。有研究发现，损毁基底前脑的胆碱能神经元可减弱动物对外界环境温度变化的感受 [13] 。作者团队先前的研究发现，激活丘脑底核向VP的谷氨酸能输入可降低小鼠疼痛阈值，而抑制这一投射则可缓解帕金森病小鼠的痛觉过敏 [14] 。 但目前还不清楚，VP中哪种神经元（如胆碱能神经元）参与疼痛的调控，这些神经元是否也参与慢性疼痛-焦虑抑郁共病。  

2023年4月17日，徐州医科大学麻醉学院的肖诚、周春艺和曹君利教授团队在 《自然通讯》（Nature Communications） 上发表了题为 “Plasticity in ventral pallidal cholinergic neuron-derived circuits contributes to comorbid chronic pain-like and depression-like behaviour in male mice” 的文章， 阐述了腹侧苍白球胆碱能神经元通过局部环路和向基底外侧杏仁核的投射参与急慢性疼痛的中枢敏化机制，证明干预这些胆碱能通路可缓解慢性疼痛的痛觉过敏和焦虑抑郁样症状。

1. VP 胆碱能神经元通过激活VP中的尼古丁受体调控小鼠的疼痛阈值。

为了回答VP胆碱能神经元是否参与疼痛反应，作者采用光纤钙成像记录，用AAV-EF1α-DIO-GCaMP6f（钙离子探针）标记ChAT-Cre小鼠VP胆碱能神经元，并在VP埋置光纤（图1a，b）。三周后，向小鼠左侧和右侧后脚掌施加机械压力，均能观察到右侧VP钙信号的增强。说明单侧VP胆碱能神经元可感受双侧肢体的疼痛刺激。为了明确VP胆碱能神经元的兴奋是否调控疼痛阈值，作者将化学遗传学工具（AAV-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry）转染到VP胆碱能神经元中，并在VP上方埋置套管，用于向VP注射氧化氯氮平（clozapine-N-oxide，CNO）激活VP胆碱能神经元。作者观察到向VP注射CNO显著降低了小鼠的疼痛阈值，而这一效果可被事先在VP注射尼古丁受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）阻断剂美加明（mecamylamine，MEC）所拮抗（图1d-f）。这些结果说明兴奋VP胆碱能神经元通过激活nAChR而降低疼痛阈值。

图1 VP胆碱能神经元参与疼痛

a-c 在体光纤钙成像显示，疼痛样刺激使VP胆碱能神经元活动增强。d-f 结合化学遗传学和脑内定位注射技术，在小鼠VP中注射药物前和CNO或CNO+MEC或CNO+生理盐水（saline）后，后脚掌的机械痛阈值。g-i 用病毒载体标记VP胆碱能神经元，并制作SNI模型和假手术小鼠。j-m SNI和假手术组小鼠VP胆碱能和非胆碱能神经元受去极化刺激后动作电位的发放频率。

2. VP胆碱能神经元过度兴奋是慢性疼痛“痛觉过敏”的重要病理生理基础。

在证明了急性疼痛刺激可兴奋VP胆碱能神经元降低疼痛阈值后，作者又用坐骨神经部分切断术（spared nerve injury，SNI）制作了左侧后肢慢性神经病理性疼痛小鼠模型（图1g-i）。脑片膜片钳记录数据显示SNI小鼠VP胆碱能和非胆碱能神经元对兴奋性刺激的反应显著增强（图1j-m）。说明慢性疼痛小鼠中，VP胆碱能神经元和非胆碱能神经元均处于过度兴奋状态。作者又用光遗传学技术选择性地兴奋VP胆碱能神经元，发现小鼠双侧VP中c-Fos阳性的胆碱能和非胆碱能神经元显著增加（图2a-c），双侧后脚掌的机械痛和热痛阈值下降（图2d，c）。相反，抑制SNI小鼠患肢对侧的VP胆碱能神经元可减少VP中c-Fos阳性的胆碱能和非胆碱能神经元（图2f-h），并提高了SNI小鼠患侧后脚掌的机械痛和热痛阈值（图2i-j）。以上结果说明VP胆碱能神经元的过度兴奋可能是慢性疼痛小鼠VP中非胆碱能神经元过度兴奋和患肢痛觉阈值下降的重要原因。

图2 VP胆碱能神经元对VP局部环路和小鼠疼痛阈值的调控作用 

a-c 光遗传学兴奋VP胆碱能神经元后，对VP中c-Fos阳性的胆碱能和非胆碱能神经元的数目。d，e 光遗传学刺激单侧VP胆碱能神经元前中后小鼠的机械痛和热痛阈值。f-h 假手术组、SNI组和VP胆碱能神经元受光遗传学抑制的SNI组小鼠，VP中c-Fos阳性的胆碱能和非胆碱能神经元的数目。g-j 假手术组、SNI组和VP胆碱能神经元受光遗传学抑制的SNI组小鼠的机械痛和热痛阈值。

3. 慢性疼痛小鼠焦虑抑郁样行为与VP胆碱能神经元的过度兴奋有关。

与以往的报导一致[15]，作者观察到SNI小鼠在手术4周后出现抑郁和焦虑样表现，包括悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间延长，在高架十字迷宫开放臂的时间缩短和次数减少（图3b-d）。用光遗传学技术对SNI小鼠VP胆碱能神经元进行反复间歇性的抑制（每2 min 持续黄光刺激间歇2 min）（每天2 h，反复3天）（图3a）后，发现SNI小鼠抑郁和焦虑样行为得到缓解（图3b-d）。这些实验结果提示VP胆碱能神经元的长期过度兴奋与慢性疼痛小鼠抑郁和焦虑样行为之间存在密切联系。为了进一步证明两者间的因果关系，作者采用了反复间歇性地光遗传学刺激方式（每2 min 20 Hz蓝光刺激间歇2 min）（每天2 h，反复刺激3天）在正常小鼠中模拟VP胆碱能神经元兴奋性反复增强的状态（图3e），观察到这种刺激方式诱导小鼠表现出抑郁焦虑样的行为（图3f-h）。作者在补充材料中显示，由慢性束缚应激和慢性不可预知的应激事件诱导的焦虑和抑郁样行为并不伴随VP胆碱能神经元的过度兴奋，也不能被抑制VP胆碱能神经元所缓解。接下来作者又研究了VP胆碱能神经元的下游投射对疼痛阈值和抑郁焦虑样行为的调控作用。

图3 反复间歇式光遗传调控对小鼠抑郁焦虑样行为的影响  

a 对SNI小鼠单侧VP胆碱能神经元进行反复间歇式光遗传抑制（每2 min黄光照射间歇2 min）（2 h每天，共3天）。b-d 假手术组、SNI组和VP胆碱能神经元受光遗传学抑制的SNI组小鼠，在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中的不动时间，在高架十字迷宫（EPM）进入开放臂的时间和次数。e 对小鼠单侧VP胆碱能神经元进行反复间歇式光遗传兴奋（每2 min 20 Hz蓝光照射间歇2 min）（2 h每天，共3天）。f-h 反复间歇式蓝光照射表达eGFP和ChR2的VP胆碱能神经元后，小鼠在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中的不动时间，在高架十字迷宫进入开放臂的时间和次数。

4. VP胆碱能神经元向基底外侧杏仁核的投射调控疼痛阈值和抑郁焦虑样行为。  

作者用光遗传学技术标记ChAT-Cre小鼠VP胆碱能神经元，在多个脑区发现其轴突纤维，其中，在基底外侧杏仁核（BLA）最为密集（图4a-c），且蓝光刺激单侧BLA的纤维末梢，可降低小鼠对侧后脚掌的痛觉阈值（图4d）。对双侧VP-BLA胆碱能投射的反复间歇性蓝光刺激（每2 min 20 Hz蓝光刺激间歇2 min）（每天2 h，反复刺激3天）提高了BLA神经元的兴奋性（图4e-g），也诱导了小鼠的抑郁和焦虑样行为（图4h-k）。作者还发现，小鼠SNI对侧BLA中c-Fos阳性神经元数目多于假手术组，且抑制VP-BLA胆碱能投射可显著减少BLA中c-Fos阳性神经元（图5b，c），并显著提高SNI小鼠患侧后脚掌机械痛和热痛阈值（图5a, d，e）。反复间歇性地（每2 min 持续黄光刺激间歇2 min）（每天2 h，反复3天）抑制双侧VP-BLA胆碱能通路也能显著减少SNI小鼠BLA中c-Fos阳性神经元（图5f，g），且缓解SNI小鼠的抑郁焦虑样行为（图5f，h-k）。以上结果证明，BLA是VP借以调控疼痛阈值和抑郁焦虑样行为的重要下游脑区。

图4 兴奋VP-BLA投射对小鼠疼痛阈值和抑郁焦虑样行为的调控  

a-d 光遗传学刺激单侧VP-BLA胆碱能投射降低对侧后脚掌机械痛阈值。e-g 反复间歇性光遗传学刺激双侧VP-BLA胆碱能投射提高BLA神经元兴奋性。h-k 反复间歇性蓝光照射双侧VP-BLA胆碱能投射对eGFP和ChR2小鼠行为的影响，包括在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中的不动时间，在高架十字迷宫（EPM）进入开放臂的时间和次数，在空旷场中央区（OFT）的时间。

图5 抑制VP-BLA投射对SNI小鼠疼痛阈值和抑郁焦虑样行为的调控  

a-c 光遗传学抑制单侧VP-BLA胆碱能投射降低同侧BLA中c-Fos阳性神经元数目。d，e 光遗传学抑制单侧VP-BLA胆碱能投射提高对侧SNI后脚掌机械痛和热痛阈值。f，g 反复间歇性光遗传学抑制双侧VP-BLA胆碱能投射减少SNI小鼠BLA中c-Fos阳性神经元数目。h-k 反复间歇性光遗传学抑制双侧VP-BLA胆碱能投射改善SNI小鼠抑郁焦虑样行为，包括在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中的不动时间，在高架十字迷宫（EPM）进入开放臂的时间和次数，在空旷场中央区（OFT）的时间。

作者利用乙酰胆碱荧光探针 [16] 发现，SNI小鼠VP和BLA乙酰胆碱释放显著增加；用离体脑片膜片钳记录技术发现，阻断nAChRs可减轻SNI小鼠VP非胆碱能神经元的过度兴奋；用在体电生理技术发现，光遗传学刺激VP-BLA投射对BLA神经元的兴奋作用在SNI小鼠中显著增强 （见原文） 。综合有关VP和BLA神经元兴奋性的数据， 以上结果说明SNI中VP胆碱能神经元向局部和BLA投射的两条胆碱能通路的可塑性增强。

图6 

总结图： AAV-EF1α-DIO-ChR2 ：兴奋性光遗传工具，被蓝光激活而兴奋神经元； AAV-EF1α-DIO-NpHR ：抑制性光遗传工具，被黄光激活而抑制神经元； ACh ：乙酰胆碱； BLA ：基底外侧杏仁核； ChAT-Cre ：胆碱能神经元表达 Cre 重组酶的小鼠品系，结合以上 AAV 工具可特异表达 ChR2 和 NpHR ，实现对胆碱能神经元的选择性调控； GACh ：乙酰胆碱绿色荧光探针，结合乙酰胆碱后荧光增强； nAChRs ：尼古丁受体； VP ：腹侧苍白球

文章结论与讨论，启发与展望  

本文采用多种神经元类型和投射特异性的研究手段，证明了VP胆碱能神经元兴奋性的增强可通过激活nAChRs而兴奋VP非胆碱能神经元和下游BLA神经元（图6）。在慢性疼痛状态下这两个胆碱能通路均显著增强，引起VP和BLA神经元的过度兴奋，这些病理生理过程参与慢性疼痛小鼠痛觉过敏和焦虑抑郁样行为，但不参与慢性应激诱发的抑郁和焦虑样行为。本文还发现反复间歇性干预VP-BLA胆碱能通路对正常和SNI小鼠焦虑抑郁样行为的调控作用可在停止干预后持续至少4天，提示胆碱能通路出现了可塑性变化，在此期间疼痛阈值与干预前相比并无变化。这些结果提示VP-BLA胆碱能投射可能是慢性疼痛-抑郁共病的潜在干预靶点，值得更加深入地研究，阐明胆碱能通路可塑性变化的机制，不同干预模式对疼痛阈值和焦虑抑郁样行为产生不同作用的神经通路和受体机制，以及受VP胆碱能神经元支配的VP非胆碱能神经元调控疼痛和抑郁的机制等，以找出调控这一通路的精准方法。

作者简介

肖诚，医学博士，徐州医科大学麻醉学教授，博士生导师，江苏特聘教授。长期从事基底神经节调控运动、疼痛和情绪的神经环路机制研究，探讨帕金森病运动障碍、慢性神经病理性疼痛和情绪障碍的干预靶点。主持国家自然科学基金4项、Michael J Fox Foundation项目1项。在Neuron、Nat Commun、PNAS、Cell Reports、J Neurosci、Neuropsychopharmacology等SCI期刊发表论文50余篇，论文被引用3000余次。现为江苏省神经科学学会理事，Neuropsychopharmacology、Cerebral Cortex、Acta Pharm Sin、Neural Regen Res、《生物化学与生物物理学进展》等多个杂志审稿人。   

周春艺，医学博士，徐州医科大学麻醉学教授，博士生导师，江苏特聘教授。长期从事疼痛和情绪的神经环路机制研究，探讨帕金森病疼痛、慢性神经病理性疼痛和情绪障碍的干预靶点。主持国家自然科学基金3项、省部级课题4项。在Neuron、Nat Commun、PNAS、Cell Reports、J Neurosci、Pain等SCI期刊发表论文30余篇。   

曹君利，医学博士，二级教授，主任医师，博士生导师。徐州医科大学副校长、麻醉学院院长，全国高校“黄大年”式教师团队带头人、国家药监局麻醉精神药物研究与评价重点实验室主任、江苏省麻醉学重点实验室（麻醉学国家重点实验室培育建设点）主任、江苏省麻醉临床医学中心主任、江苏省“科教兴卫”工程麻醉学重点学科带头人。主要从事慢性疼痛的脑机制及疼痛-抑郁共病的神经生物学机制研究，疼痛神经生物学机制研究组组长，入选教育部长江学者特聘教授、国家“百千万人才工程”和国家“有突出贡献的中青年专家”、国务院特殊津贴专家、教育部高等教育指导委员会麻醉学专业分指导委员会秘书长（主任委员单位）、江苏省“双创团队”领军人才、江苏省333人才培养工程第一层次培养对象（中青年首席科学家）、江苏省“双创计划”引进人才、江苏省“科教兴卫工程”杰出人才等人才项目。主持科技部科技创新“脑科学与类脑研究”重大项目1项，国家自然科学基金项目7项 （重大项目1项、重点项目2项，国际合作重点项目1项，面上项目3项），省部级课题14项，发表SCI论文近100篇，研究成果发表在Nat Commun, Autophagy, Biol Psychiatry, PNAS, Annal Surgery, Curr Biol, J Neuroscience, Pain, Anesthesiology等国际著名学术期刊，论文总引用1800次以上。获得江苏省科技进步一、二等奖、教育部高等学校科学研究优秀成果（自然科学）二等奖等，获得首届中国百篇最具影响的优秀国际学术论文和2017、2019年两次获得中华医学百篇优秀论文。

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编辑︱王思珍

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编辑：Michel.米萱

校对：MiLu.米鹭