CAR-T细胞疗法为何耐药？如何应对？

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric antigen receptor T-cell Immunotherapy）简称CAR-T细胞疗法，属于过继免疫细胞疗法，通过基因工程修饰改造T细胞，使T细胞能特异性识别肿瘤抗原并杀死肿瘤细胞。过去十年，CAR-T细胞疗法取得较大进展，已成功治疗了部分血液系统肿瘤患者，但CAR-T细胞疗法治疗后的患者仍存在肿瘤复发风险，临床获益仍有提升空间。另外，由于肿瘤异质性和免疫抑制性的肿瘤微环境等因素，CAR-T疗法对实体瘤的治疗效果一直欠佳。因此，需要采取适当的策略来对新一代的CAR-T进行改造修饰，以应对临床耐药和实体瘤疗效不佳的境况，让CAR-T疗法惠及更多患者。       

01 CAR-T细胞疗法   

什么是CAR-T细胞疗法？ 简单来讲CAR-T细胞疗法是提取患者自身的T细胞后，经过体外培养和基因工程改造，将带有特异性抗原识别结构域和T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，再经过纯化、扩增后回输入体内，特异性与肿瘤上抗原识别而杀伤肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤有较大优势。

CAR-T细胞疗法的主要产品： 目前，FDA和NMPA共批准了7款CAR-T产品，其中，NMPA批准了复星凯特和药明巨诺的两款产品，传奇生物的西达基奥仑赛则是已递交NDA申请。

表1中美批准上市的CAR-T产品      

CAR-T细胞疗法的治疗优势：      

（1）抗肿瘤效果明显：CAR不仅使T细胞直接识别肿瘤细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶B直接杀伤肿瘤细胞，也可通过释放细胞因子募集内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，还能形成记忆性T细胞，获得长久抗肿瘤免疫应答。

（2）高度靶向性：CAR可直接特异性识别特定肿瘤抗原。

（3）高度个性化：CAR-T细胞疗法用患者自身免疫细胞进行改造，可实现个性化医疗。

（4）具有更高的准确性和灵敏性：由于结构的可复制性和不同肿瘤抗原的重复性，可根据不同肿瘤开发不同的CAR或者让一种CAR用于多个肿瘤的治疗。

图1 CAR的结构和发展        

CAR的主要结构： CAR主要由细胞外抗原识别结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内结构域组成，目前CAR已经发展到第五代，CAR不同结构部位的作用如下：   

（1）细胞外抗原识别结构域：识别肿瘤抗原并启动下游信号转导，信号通过铰链、跨膜结构域和共刺激结构域，产生CAR-T细胞活化、转录因子表达、细胞增值和细胞因子释放等级联反应。常见的细胞外结构域由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的单链抗体（Single chain antibody fragment，scFv）组成，负责识别并结合靶抗原。

（2）铰链：一般来源于IgG1、IgG4、IGD或者CD8的Fc段，铰链将细胞外抗原识别结构域和跨膜结构域连接，铰链的长度与肿瘤抗原的位置与暴露程度有关。

（3）跨膜结构域：位于铰链和细胞内结构域之间，连接细胞外结构域和细胞内结构域，并将受体锚定在T细胞膜上。

（4）细胞内结构域：通常由共刺激域和信号转导结构域组成，共刺激结构域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞增殖并释放细胞因子；信号转导结构域发挥T细胞信号转导功能。

02   CAR-T细胞疗法的耐药机制  

1 抗原逃逸      

CAR-T细胞疗法耐药的主要机制是抗原逃逸，抗原突变、抗原下调或抗原丢失可导致肿瘤细胞规避免疫系统的识别和清除，使CAR-T细胞疗法治疗效果降低或出现肿瘤复发。肿瘤细胞可能发生基因突变，导致原本可以被CAR-T细胞识别的抗原发生结构改变，无法被修饰过的T细胞所识别。肿瘤细胞也可通过下调或完全丢失目标抗原来规避CAR-T细胞的攻击。研究发现CD19 CAR-T细胞疗法对B淋巴母细胞白血病（B-ALL）和B细胞淋巴癌有较好治疗效果，但仍有30-50%患者复发，CD19基因缺失和突变可能导致肿瘤细胞上CD19抗原丢失，导致CD19阴性复发。研究发现在实体瘤中，由于肿瘤异质性，可促进抗原丢失和抗原逃逸，最终导致肿瘤耐药和复发。

图2 抗原逃逸导致CAR-T细胞疗法耐药    

2 CAR-T细胞活性      

CAR-T细胞疗法耐药的第二个主要原因是 T细胞效力 不足， T细胞维持最佳活化状态是其发挥增殖和肿瘤杀伤的重要原因 。T细胞需接受抗原刺激才能被激活和扩增，但过度激活以及对靶标的过度亲和可能导致T细胞耗竭和杀伤活性降低，影响CAR-T细胞的持久性，并可能导致活化诱导细胞死亡。

共刺激结构域在CAR-T细胞的持久性和有效性中发挥重要作用，CAR结构的调整可改善CAR-T细胞疗法的体内抗肿瘤效果，并增强记忆性免疫应答的维持，研究发现和CD28结构域的CAR-T细胞相比，4-1BB结构域的CAR-T细胞增强T细胞活性。CAR-T细胞疗法的治疗效果与细胞质量直接相关，CAR-T细胞制备过程需从患者身上获得大量的健康T细胞，低质量的T细胞会导致CAR-T细胞疗法中患者的治疗效率降低，当患者接受过化疗后会导致患者淋巴细胞减少和CAR-T细胞产品质量欠佳；另外由于人体衰老导致免疫系统功能降低，研究表明年轻供体产生的CAR-T细胞和老年供体CAR-T细胞相比具有更高的转导效率、细胞增值、信号激活和肿瘤杀伤能力，晚期疾病患者也可能无法提供高质量的T细胞制造CAR-T细胞。

图3 T细胞耗竭导致CAR-T细胞疗法耐药    

3 肿瘤微环境      

实体瘤的CAR-T细胞疗法需克服肿瘤免疫抑制微环境，免疫抑制细胞、免疫抑制细胞因子和免疫检查点配体可抑制T细胞活性和减少T细胞浸润。肿瘤微环境中的调节性T细胞（Tregs）、髓样源性抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可降低细胞毒性T细胞的浸润水平，可抑制抗肿瘤免疫应答，促进免疫逃逸和疾病进展。通常抑制性免疫检查点配体抑制免疫应答，PD-L1通过结合PD-1可抑制CAR-T细胞活化，CTLA-4免疫检查点也可抑制CAR-T细胞活性。肿瘤微环境中TGF-β和IL-10等免疫抑制分子的释放可抑制免疫应答，而IL-2和IL-15等细胞因子的激活有利于CAR-T细胞发挥抗肿瘤效果，尤其是IL-12可通过募集和激活先天免疫细胞延长T细胞的存活，提高治疗效果。

4 毒性      

CAR-T细胞识别抗原后触发T细胞发挥效应功能，激活的T细胞会释放大量的细胞因子来杀伤肿瘤细胞，但过多的细胞因子可能导致健康细胞裂解，产生细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome，CRS），造成毒副作用，抑制CAR-T细胞疗法的肿瘤治疗效果。     

03   CAR-T细胞疗法耐药性的应对措施  

图4 逆转CAR-T治疗耐受性的方法    

1 克服抗原缺失      

设计能同时靶向肿瘤细胞上两种及以上抗原的CAR分子可克服CAR-T细胞疗法治疗后抗原丢失的问题，针对不同CAR单独转导的T细胞产物可同时给药也可顺序给药，或将两个CAR的载体在细胞生产过程中组合，以获得混合产物。但上述方法的缺点是生产多种载体的成本高，并且由于生产产品的异质性导致临床分析复杂。

CAR分子可被工程改造成后识别多种抗原，将两个scFv掺入单个受体可实现双特异型靶向CAR的制备，研究者将CD20、CD22单独或串联scFv进行临床实验。Ciltacabtagene autoleucel是2022年FDA批准的靶向BCMA的CAR-T细胞产品，该产品一个受体中包含两个串联VHH串联物，可结合BCMA上两个不同的表位，临床显示27个月时该产品治疗后患者的sCR和PFS分别为83%和55%，是目前为止CAR-T细胞疗法治疗多发性骨髓瘤的有效性最高报告。

另一种方法是增加靶细胞的抗原表达，小分子γ分泌酶抑制剂可破坏骨髓瘤细胞上B细胞成熟蛋白（B cell maturation protein，BCMA）的裂解，该方法和BCMA靶向的CAR-T细胞疗法联合已经进入临床实验（(NCT03502577）。同样，苔藓抑素1（Bryostatin 1）可通过上调CD22增强CD22靶向的CAR-T细胞疗法的治疗效果。

降低抗原密度阈值的新型受体（提高scFv与靶抗原的亲和力）有助于CAR-T细胞识别低密度靶抗原，Katsarou等表达了一种嵌合共刺激受体（CCR），该受体缺乏CD3ζ结构域，CCR在非常低的抗原密度下激活了原型CAR，防止了抗原低逃逸。

2 增强T细胞活性      

CAR-T细胞的内在缺陷可通过改善CAR-T细胞工程来克服。将基因编辑技术应用于来自同种异体健康供体的T细胞，破坏内源性TCR的表达，避免HLA错配诱导的移植物抗宿主病（GvHD），并为患者因疾病或衰老而导致T细胞缺乏和衰老提供解决方案。

改善细胞类型可提高治疗效果，研究表明使用T细胞的某些亚群可能产生更有效的治疗效果，例如γδ T细胞群是一种有效的细胞群，目前绝大多数的CAR-T产品输注的是αβ T细胞，相比而言，γδ CAR-T细胞在激活后T细胞免疫球蛋白黏蛋白受体3（Tcell immunoglobulin mucin receptor 3，TIM3）和PD-1的表达水平更低，导致γδ T细胞的持久性更强。另外，γδ CAR-T细胞表达共刺激分子和抗原呈递分子，有利于将肿瘤抗原较差呈递给肿瘤微环境中的其他T细胞。

趋化因子受体修饰有利于增加CAR-T细胞在肿瘤微环境中的浸润和肿瘤内免疫细胞的募集。例如，CXCR1或CXCR2修饰的CAR-T细胞增强了T细胞的浸润能力。肿瘤浸润的CAR-T细胞可招募其他免疫细胞，分泌IL-17和CCL-19的CAR-T细胞，可促进其他免疫细胞浸润。表达乙酰肝素酶（Enzyme heparanase，HPSE）的CAR-T细胞可有效降解细胞外基质并增加免疫细胞的肿瘤浸润。表达抗VEGF2的CAR-T细胞同样可增强肿瘤中免疫细胞的浸润。含有细胞因子和CAR-T细胞的水凝胶在肿瘤部位注射，可提高免疫细胞浸润的抗肿瘤效果。

联合其他肿瘤治疗方法可增强T细胞活性。多西紫杉醇介导的化疗上调CXCL11表达并增强CD8 T细胞的募集；低剂量放疗增加肿瘤微环境中T细胞的浸润；联合免疫检查点抑制剂可克服T细胞抑制，例如抗PD-1/PD-L1联合CD19靶向的CAR-T细胞正在临床评估阶段（(NCT02650999，NCT02706405，NCT02926833和NCT03310619），联合治疗中患者中观察到明显的肿瘤衰退，并且T细胞发挥功能的时间延长和抑制衰竭。

3 克服免疫抑制微环境      

提高CAR-T细胞治疗后 T细胞增殖需要的代谢酶 ，例如通过表达精氨酸再合成酶提高精氨酸的可用性，降低肿瘤微环境对T细胞增殖的影响。CAR-T细胞可通过表达Fas的突变形式,克服肿瘤微环境中表达的凋亡诱导配体FasL诱导的细胞死亡，从而提高CAR-T细胞的寿命和抗肿瘤效果。

增加肿瘤微环境中的促炎因子可增强CAR-T细胞治疗效果，表达IL-7和CCL19的CAR-T细胞可增加T细胞在实体瘤中的浸润，并增强抗肿瘤效果。构建过表达IL-12或IL-18的CAR也能激活更多的炎性内源性免疫细胞，增强抗肿瘤反应。

另外一种策略是 重定向肿瘤免疫微环境 ，例如开发TGF-β抗性的CAR-T细胞，可克服免疫抑制微环境，可增强T细胞活性和增强CAR-T细胞的持久性（NCT03089203）。CRIPSR-Cas9介导的敲除CAR-T细胞内源性的TGFβRII可减少Treg的转化、减少T细胞衰竭和增强治疗效果。可通过改变Treg的活性克服Treg造成的免疫抑制，例如EGFRvIII靶向的CAR-T细胞可重定向T细胞和Treg，从而发挥细胞毒性功能。

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作者：福莱格 编辑人：Transparent 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。  ©2021 医药速览 保留所有权利 来源：医药速览 2023-04-27