USP5敲低通过激活PARP1介导的mTOR信号通路缓解肺癌进展

近年来，肺癌已成为发病率和死亡率明显上升的恶性肿瘤之一，严重影响了人们的生命健康安全。值得注意的是，这种可怕的癌症通常发生在50岁以上的老年人中，男女比例约为5：1[1，2]。而且，肺癌的临床症状相对复杂，与肿瘤部位和病理类型密切相关，肺癌的临床发病机制尚为研究完全清楚。一些研究表明，肺癌与吸烟、致癌因素、慢性肺部感染、遗传因素和空气污染等各个方面有关[3]。目前，超过90%的肺癌患者接受化疗作为全身治疗，包括晚期肺癌患者。虽然化疗不能完全根除肺癌，但它会延长患者生存率并改善生活质量。对此，必须明确研究肺癌相关基因和分子机制，旨在揭示肺癌起源的过程和机制，探索潜在有效的治疗方法。  

在近日发表于《Biology Direct》杂志的一项新研究中[4]，中国医学科学院和北京协和医院的科学家们研究了敲除泛素特异性蛋白酶5（USP5）缓解肺癌进展的机制。泛素特异性蛋白酶5（USP5）是一种去泛素化酶，已被鉴定为几种人类癌症的促进因子。然而，USP5在肺癌中的作用机制尚未阐明。  

图1 研究文献发表示意图

在这篇文章中，研究人员通过一系列实验发现USP5在肺癌中高表达，USP5过表达促进肺癌细胞系H1299和A549的增殖和迁移，而USP5的抑制会通过调节PARP1介导的mTOR信号通路来抑制癌症进展。此外在动物实验中，研究人员在C57BL/6小鼠中建立了皮下肿瘤模型，沉默USP5后皮下肿瘤体积显著减小，USP5过表达后增加，同时shRARP1处理显著减小。  

图2. USP5与肺癌患者的总生存期有关，并且在肺癌组织中高表达

研究人员基于TCGA的肺癌数据库GEPIA分析USP5的表达。结果表明，USP5表达水平在癌症患者中显著较高。低USP5水平组的总生存率高于USP5高表达组（图2 A,B）。研究人员采用免疫组织化学染色来测量USP5在肺癌和癌旁组织中的表达。观察到肺癌组织中USP5蛋白的水平比相应的癌旁组织中高调（图2 C ）。这些数据表明，相比正常和癌旁组织，USP5在肺癌组织中上调表达，并在肺癌患者的预后中起关键作用。

图3 USP5过表达后A549和H1299肺癌细胞系增殖和迁移能力显著增强

为了评估USP5在肺癌进展中的作用，使用了“功能增益”和“功能丧失”策略（即基因过表达和敲除/抑制/沉默表达）。通过基因编辑，研究人员USP5在A549和H1299肺癌细胞中成功抑制或过表达，实验结果发现USP5过表达促进肺癌细胞系H1299和A549的增殖和迁移，而USP5的降低则会抑制肺癌细胞增殖和迁移。USP5抑制的A549细胞的裸鼠皮下肿瘤移植模型实验显示，USP5的沉默抑制了异种移植物的生长，并导致异种移植物重量的明显降低（图4)。  

图4 USP5敲低抑制了肿瘤的生长  

为了确认USP5是否受到mTOR信号的调节，研究人员通过敲低TSC2激活了mTOR信号，随后阻止了Rapa的激活。结果显示mTOR信号通路的阻断显著逆转了USP5促进A549和H1299细胞集落形成的作用。此外，在USP5过表达的A549和H1299细胞中，Rapa也显着提高了细胞凋亡率（图5）。此外，mTOR信号传导的阻断可以显着降低USP5过表达的A549和H1299细胞的迁移能力。

图5. USP5的mTOR激活促进肺癌细胞的增殖和迁移

然后研究人员接下来确认了USP5通过调节PARP1促进肺癌的进展，USP5过表达上调了PARP1，而其敲低下调了肺癌细胞中的PARP1并且增强了PAPR1的泛素化水平。  

图6. USP5通过靶向体外和体内的PARP1来促进肺癌的进展

图6（A）蛋白质印迹显示，PARP1在USP5过表达的肺癌细胞中被有效敲低。（B-D）PARP1敲低对USP5过表达肺癌细胞的增殖、集落形成和迁移能力有着抑制作用。（E-F）PARP1抑制剂对集落形成和USP5过表达细胞迁移能力有抑制作用。（G）PARP1敲低显著减少了对小鼠皮下肿瘤体积(* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001)。  

在癌细胞中蛋白质的翻译修饰过程中，去泛素化酶特异性地去除泛素抑制底物。USP5是这种泛素特异性蛋白酶家族的成员，可以有效去除DNA双链受损位点处的泛素信号，进而有效修复DNA。多项研究表明，USP5敲除可以显着增加P53的表达及其转录活性。在研究中，观察到肺癌组织中USP5蛋白的水平高于相应的癌旁组织中。此外，H5和A1299细胞中USP549基因下调后增殖能力显着降低，USP5水平过表达后显着促进。因此，USP5水平可以实质性地调节肿瘤细胞的增殖。  

此外，由于p53与mTOR信号通路密切相关，研究人员便随后研究了USP5与mTOR信号通路之间的关系。mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇相关激酶家族的重要成员之一。mTOR参与基因转录、蛋白质翻译和核糖体合成以及其他生物过程，在细胞的增殖、分化和转移中起着极其重要的作用。此研究采用蛋白质印迹法验证了在H5和A1299细胞系中mTOR信号通路激活后USP549表达水平可以上调。雷帕霉素是一种mTOR信号通路抑制剂，用于鉴定USP5的表达受mTOR信号通路的调节。另有研究[5]表明USP5的过表达通过稳定β-连环蛋白促进非小细胞肺癌的肿瘤发生。  

而PARP1是一种DNA修复酶，可调节mTOR信号通路。在研究中，观察到USP5可以通过免疫共沉淀直接与PARP1结合。敲低PARP1后，USP5依赖性进展在肺癌细胞中的作用将被终止。在皮下肿瘤小鼠模型中，可以看到消除PARP1的作用可以显着减少小鼠皮下肿瘤的体积。  

总之，USP5可以通过mTOR信号通路和与PARP1相互作用促进肺癌细胞的进展，表明USP5可能成为肺癌治疗的新靶点。  

Ref：  

[1]. Mao Y, Yang D, He J, Krasna MJ. Epidemiology of Lung Cancer. Surg Oncol Clin N Am. 2016;25(3):439–45. doi: 10.1016/j.soc.2016.02.001.  

[2]. Rodriguez-Canales J, Parra-Cuentas E, Wistuba II. Diagnosis and molecular classification of Lung Cancer. Cancer Treat Res. 2016;170:25–46. doi: 10.1007/978-3-319-40389-2_2.  

[3]. Bade BC, Dela Cruz CS. Lung Cancer 2020: Epidemiology, Etiology, and Prevention. Clin Chest Med 2020; 41(1):1–24.  

[4]. Cao L, Liu H, Huang C, Guo C, Zhao L, Gao C, Xu Y, Wang G, Liang N, Li S. USP5 knockdown alleviates lung cancer progression via activating PARP1-mediated mTOR signaling pathway. Biol Direct. 2023 Apr 14;18(1):16. doi: 10.1186/s13062-023-00371-z. PMID: 37060095; PMCID: PMC10103446.  

[5]. Ma X, Qi W, Pan H, Yang F, Deng J. Overexpression of USP5 contributes to tumorigenesis in non-small cell lung cancer via the stabilization of β-catenin protein. Am J Cancer Res. 2018 Nov 1;8(11):2284-2295. PMID: 30555744; PMCID: PMC6291653.  

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