拉曼化学成像，肾结石结构分析的新工具：

Castiglione V, Sacré PY, Cavalier E, Hubert P, Gadisseur R, Ziemons E. Raman chemical imaging, a new tool in kidney stone structure analysis: Case-study and comparison to Fourier Transform Infrared spectroscopy. PLoS One. 2018 Aug 3;13(8):e0201460. doi: 10.1371/journal.pone.0201460. PMID: 30075002; PMCID: PMC6075768.

背景和目标

除结石成分外，肾结石的结构还可能提供临床信息。拉曼化学成像是一种用于生成样品中成分分布二维图的技术。我们旨在确定拉曼化学成像在尿结石分析中的应用。

材料与方法

使用共焦拉曼显微分光光度计通过拉曼化学成像分析了 14 个结石。它们是根据它们的异质组成和形态来选择的。对整块结石进行了拉曼化学成像。获取数据后，通过 MCR-ALS 对数据进行基线校正和分析。然后将结果与通过傅里叶变换红外光谱法获得的光谱进行比较。

结果

拉曼化学成像成功鉴定了每个样品的几乎所有化学成分，包括一水和二水草酸钙、无水和二水尿酸、磷灰石、鸟粪石、透钙磷石以及白钙石、尿酸铵和药物等稀有化学物质。然而，由于巨大的自发荧光背景和这些不良拉曼散射体的浓度低，无法检测到蛋白质。即使碳磷灰石和草酸钙占全部结石的比例不到 5%，也能正确检测到它们。此外，拉曼化学成像提供了结石内成分的分布：准确识别了核，以及其他成分的薄层。在一个样品的中心正确观察到二水合物向一水合物草酸钙的转化。

结论

与红外光谱相比，拉曼化学成像在识别肾结石成分方面显示出良好的准确性。这种分析也有助于确定结石中成分的组织，这有助于定位少量成分，例如核。然而，这种分析非常耗时，使其更适合于研究而不是常规分析。

介绍

尿石症在发达国家是一种传播性疾病，1994 年至 2010 年间患病率从 5% 增加到 8% 。此外，5 年的复发率接近 30%，胱氨酸或透钙石结石形成者的复发率更高。此外，并发症和高度活跃的遗传性尿石症可导致慢性肾脏疾病。因此，这些患者的泌尿科和预防性管理导致医疗保健系统花费巨大。此外，结石治疗的建议高度依赖于结石成分和生物学评估. 总体而言，饮食、病理甚至药物等后天因素以及性别、年龄、泌尿系统畸形和遗传等遗传因素与不同的结石成分有关。此外，在某些特定的急性肾结石病中，如胱氨酸尿症和腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症，结石分析通常是最快、最可靠的诊断方法。这就是为什么必须对每个复发性结石形成者进行结石分析]。

湿化学分析已被放弃多年，因为许多有价值的方法已被开发用于石材成分测定。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 和粉末 X 射线衍射被认为是金标准。自 1983 年以来，拉曼光谱法（另一种振动分析方法）已在尿石症测定中进行了测试 [ 15、16 ]。值得注意的是，Daudon 等人已经评估了大范围的结石化合物 [ 16 ]。因为，一些研究使用拉曼光谱来分析尿路结石 [ 17 – 25]. 它已被证明是区分人体肾结石各种化学成分的适当方法，并且拉曼光谱被大多数这些论文判断为与 FTIR 分析互补或相当。尽管如此，其他一些不常见的化学物质，主要是药物，还没有经过测试。此外，在大多数这些研究中，甚至是最近的研究中，拉曼光谱仅作为 FTIR的替代品用于小样本集[ 20 – 22、24、25]. 这些研究使用了破坏性途径，但没有提供有关样本的任何结构信息。然而，化学成分并不是分析肾结石时要考虑的唯一特征。结石的结构以及某些特定元素的存在，如 Randall 斑块，也提供了有关结石形成和相关疾病的信息 [ 26 – 28 ]。大多数时候，结石是由不止一种元素组成的，不同化学元素的定位也为结石“历史”提供了线索 。拉曼显微镜已在其他人类生物样本中进行了广泛测试，尤其是在癌症诊断中，组织学分类对于诊断和治疗来说是强制性的。一些研究将化学和生物学信息与形态学和分布参数相结合，以便以高精度正确识别肿瘤或亚细胞器官，有时甚至优于经典组织学 。

拉曼从未被测试用于尿路结石的映射，这就是为什么我们旨在使用拉曼化学成像 (RCI) 来分析结石结构。将拉曼光谱与显微镜相结合，可以获得样品中成分的分布图及其光谱，从而实现其化学表征。这提供了结石内成分的定位，因为它已用于肿瘤绘图或药物制剂控制。因此，RCI 应该提供关于岩石形成的临床相关信息。我们试图评估这种方法在混合成分结石的高级或常规分析中的实用性。

材料与方法

CHU de Liège（比利时）的尿石症实验室每天从医院的门诊病人那里接收结石进行 FTIR 分析。分析完成后，对残余的石头进行匿名处理，并根据其成分和形态进行分类。对于这项非干预性研究，我们根据 FTIR 获得的各种成分选择了 14 种尿路结石。例如，选择由二水草酸钙和一水草酸钙组成的结石，因为当这些成分以不等量混合时，可能难以通过 FTIR 加以区分 [35 ]]. 此外，一些宝石因其异质形态而被选中（样品 10 和 11）。最后，我们测试了三个含有药物沉积物的样品（样品 12 至 14）。在研究期间，没有作者可以访问患者的信息。这项研究符合赫尔辛基宣言和我们的机构审查委员会«Comité d'Ethique Hospitalo-Facultaire de l'Université de Liège»。该研究未得到审查委员会的特别批准，并且不需要知情同意，因为我们的伦理委员会允许使用样本残余进行方法比较，同时根据 2014 年 9 月 23 日的程序尊重患者的匿名性。作者均无法访问在本研究中以任何方式收集患者的信息。

傅里叶变换红外光谱

在分析之前将样品干燥并在室温下保存。首先用显微镜（放大 64 倍）检查结石以进行结构描述。石头被切成两等份，以观察它们的截面和核。一半的石头由 FTIR 分析，而另一部分由 RCI 研究。我们没有在这两种分析中分析结石的同一部分，因为患者的随访需要快速的 FTIR 结果，而 RCI 分析速度较慢。选定的碎片在玛瑙研钵中研磨以实现用于 FTIR 分析的颗粒。加入溴化钾。将最终粉末均化，然后送入压机以制成直径为 3 毫米的丸粒。光谱记录在 4000 和 400 cm -1之间（分辨率 2cm -1) 使用 Alpha FT-IR 分光光度计（Bruker，德国）进行 120 次扫描，并与 OPUS 参考库 6.5 版（Bruker Optics Inc）进行比较。半定量结果以百分比记录。

拉曼化学成像

共聚焦拉曼实验使用配备二维 EMCCD 检测器（1600×200 像素传感器）（Andor Technology Ltd.）的 Labram HR Evolution（Horiba scientific，法国），Leica 50x LWD Fluotar（NA：0.55）物镜进行和 785 nm 激光器（XTRA II，Toptica Photonics AG，德国）。使用 LabSpec 6 (Horiba Scientific) 软件收集光谱。使用 Labspec 6 软件 (Horiba Scientific) 的 EasyNav 包也实现了结石的地形分析。

首先，在进行 RCI 分析之前，对宝石进行切片和研磨，以获得光滑的表面。使用 300 gr/mm 光栅在 464–1853 cm -1的光谱范围内获取光谱。样品处的激光功率降低至 35mW 以防止样品燃烧。使用七次 2 秒的累积和设置在 200μm 的共焦孔。根据样品使用5至50μm的步长。

对于数据处理，一旦获取，就会展开高光谱图像，并使用 Savitzky-Golay 算法（窗口大小为 5）平滑光谱 [36 ]，使用非对称最小二乘法（λ：10 5；p：10 - 3）算法[ 37 ]。使用对 C 和 S 矩阵具有非负性约束的 MCR-ALS [ 38、39 ]解析一般映射的纯光谱。所有计算均使用 Matlab R2016a（9.0 版，The Matworks，美国）和 PLS 工具箱 8.2.1（美国特征向量研究）实现。最后，将 RCI 的结果与 FTIR 的结果进行了比较。

结果

14 个样品用两种方法进行了分析；拉曼化学成像和傅里叶变换红外光谱。在每个样本中，RCI 都成功识别了 FTIR 记录的几乎所有成分。根据 FTIR，在所有结石中检测到草酸钙一水合物 (COM) 和二水草酸钙 (COD)、无水尿酸和二水合物、磷灰石、鸟粪石（磷酸铵镁或三磷酸镁）、白钙石、透钙磷石和尿酸铵（表格1). 关于药物，确定了磺胺甲恶唑、N-乙酰磺胺甲恶唑和阿扎那韦的代谢物。相比之下，样品 13 中的氨苯蝶啶及其硫酸盐和羟基共轭代谢物的痕量未通过 RCI 检测到。同样，蛋白质和糖胺聚糖也未通过 RCI 方法鉴定。根据 FTIR 分析，大多数测试成分占宝石成分的 15% 以上。样品 10 中的 COM 被 RCI 正确识别，其中仅占 FTIR 宝石成分的 5%。FTIR 分析在样品 5 和 9 中分别鉴定出 10% 的无水尿酸和 COD，这也被 RCI 正确检测到。此外，RCI 分析显示样品 13 中存在少量 FTIR 未检测到的磷灰石。

表格1 傅里叶变换红外光谱和拉曼化学成像样品的成分。 

鸟粪石：磷酸铵镁（三磷酸盐）

RCI 正确识别的每个组件也精确定位在石头切片面的二维地图表示中。在几块石头中观察到不同成分的连续层。样品3主要由草酸钙组成。然而，结石中存在一水草酸钙和二水草酸钙的极化分布（图。1). 事实上，石头的核心是由一水草酸钙组成，而尖锐的外部晶体主要由二水草酸钙组成。同理，样品9核的定位清晰定位（图 2). 然而，它由不能提供强拉曼光谱的间隙构成。拓扑分析证实了这一点（图 S2）。然后核心大部分被与磷灰石混合的白云石覆盖。最后，一层薄薄的 COD 位于外部透钙磷石涂层下方。这两个样品的核被精确定义。在样品 12 中，N-乙酰磺胺甲恶唑薄层（约 100 μm）与 COM 核心区分开来（图 3). 有趣的是，COM 根据石材结构具有不同的拉曼光谱。COM的一般光谱在1487或1462cm -1处有一个主吸收峰。在对光谱进行数学处理后，我们能够识别出在这两个波长之一处具有更高吸收强度峰值的宝石径向区域（图 3A 和 3B). 在这三个样品中，拓扑分析可以轻松识别较低光谱强度与孔隙率相关的区域（图S1 – S3）。

图1

样品 3 的拉曼映射。

二水草酸钙 (A)、一水草酸钙 (B) 和磷灰石 (C) 的拉曼图谱及其相应的拉曼光谱。步长：50 微米。黄色到深蓝色的刻度表示成分的高密度或不存在。结石外围的尖刺主要由二水草酸钙构成，而其中心已变成一水草酸钙。

图 2

样品 9 的拉曼映射。

白钙石 (A)、草酸钙二水合物 (B)、磷灰石 (C) 和透钙磷石 (D) 的拉曼图谱。步长：50 微米。黄色到深蓝色的刻度表示成分的高密度或不存在。石头的核心不存在并提供低信号。石头的其余部分由白钙石和磷灰石制成，可能是由于以前的尿路感染，而透钙磷石外层与近期的高钙尿症有关。

图 3

样品 12 的拉曼映射。

主要吸收峰在 1487 (A) 或 1462 (B) 和 N-乙酰磺胺甲恶唑外部沉积物 (C) 的一水草酸钙的拉曼图谱及其对应的拉曼光谱。步长：5μm。黄色到深蓝色的刻度表示成分的高密度或不存在。一水草酸钙主吸收峰的差异揭示了结石的放射状结构。

讨论

元件识别

我们在本文中报告说，RCI 是肾结石分析的相关方法。我们在本研究中测试了大量肾结石成分。RCI 正确识别了以下成分：COM、COD、无水尿酸、尿酸二水合物、尿酸铵、磷灰石、磷酸铵镁、透钙磷石和白钙石。这些发现与其他先前使用传统拉曼光谱 [ 17、25 ] 的报告一致。拉曼光谱已经描述了常见化合物的主要拉曼振动带，但没有提供样品映射[ 16、17、20]. 这些化合物在肾结石中最常见，但其他成分，即使它们出现的频率较低，对于结石形成者的管理也很重要 [ 8 ]。此外，胱氨酸、黄嘌呤和2,8-二羟基腺嘌呤这三种出现在某些遗传性疾病中的尿石症也已通过拉曼光谱鉴定出来[ 17 , 23 ]。必须不要错过这些化合物，因为它们与需要特殊治疗的非常罕见但危及生命的疾病有关 [ 10 ]。

经常在接受治疗的患者的尿液中发现的药物晶体也容易形成肾结石。鉴定结石中的药物或其代谢物会直接导致具体的建议（补水甚至停止服用药物）。虽然 Hong等人报告了一个氨苯蝶啶结石样本，但据我们所知，此后还没有通过拉曼振动方法分析过其他药物结石 [ 17]]. 我们未能测量样品 13 中的氨苯蝶啶及其代谢物，可能是因为它以痕量形式存在于宝石表面并且因为它太易碎而无法抵抗研磨过程。然而，RCI 设法在另外两个样本中定位了 N-乙酰磺胺甲恶唑和阿扎那韦层，而据我们所知，这些化合物尚未在尿路结石中得到描述。拉曼光谱法已广泛用于药物质量控制，因此，广泛的药物光谱数据库可用于评估 [ 40]]. 然而，结石也可能含有药物代谢物，就像我们用 N-乙酰磺胺甲恶唑和氨苯蝶啶的硫酸盐和羟基结合物展示的那样。这些代谢物的光谱可能在数据库中不可用。在其他研究中，显微拉曼光谱成功地提供了阿霉素或厄洛替尼等药物的细胞分布。其他研究表明，也可以评估组织内药物的鉴定 。例如，双膦酸盐的测量是在 20 毫米厚的猪骨中进行评估的，这是一种类似于肾结石的基质 。

在我们的样品（样品 2、7、9 和 11）中无法检测到蛋白质和糖胺聚糖，即使数量很多，也是因为这些不良拉曼散射体的巨大自发荧光背景。蛋白质总是存在于尿路结石中，但通常是微量的。当它们的比例较高时，它们可能与尿路感染、尿路上皮或肾小球损伤有关。这在感染性和药物性结石的情况下尤其具有挑战性，因为它们通常含有大量有机基质 。

拉曼光谱分析也被用于区分药物工业中晶体的多晶型形式。晶体的多态性在结石测定中很重要，可以区分 COM 和 COD、无水尿酸和二水尿酸，或区分不同的磷酸钙。例如，与无水尿酸肾结石相比，尿酸肾结石的二水合物多晶型物与较低的复发率和较高的 BMI 有关 。在我们的研究中，RCI 能够区分所有这些多晶型物。

通过 RCI 对组件进行量化是可行的，即使它没有在本研究中进行。例如，可以使用准确的量化来计算磷灰石与草酸钙的比率，以筛查甲状旁腺功能亢进症患者。然而，量化仍然是一个问题，特别是当自动分析由具有库比较的软件执行时。拉曼和 FTIR 光谱提供了整个样品的光谱，可以通过软件进行分析 [ 48]. 然而，库将其与最佳匹配项进行比较，并识别最多三个组件的混合。RCI 提高了感兴趣的小元素的检测率。2013 年，Miernik 等人开发了一种自制的拉曼设备，用于分析新鲜提取的肾结石. 它用于分析表面上 6 个随机点的样品，无需准备（也没有切片或干燥）。该方法显示出良好的灵敏度和特异性，但由于随机靶向，可能无法检测到少于 25% 的成分。尽管如此，我们认为这对于优质宝石分析来说不够准确。实际上，必须不要遗漏一些与特定和严重情况相关的成分，即使它们的数量很少，例如赖氨酸-胱氨酸尿症和产脲酶尿路感染中的胱氨酸或鸟粪石。我们证明，分辨率为 50μm 的 RCI 能够在单个样品中区分多达 4 种不同的成分，这在我们选择的高度复杂的宝石中特别有用。

结石结构与形态

除了结石成分外，RCI 还提供了样品中成分分布的精确映射。原子核以及其他成分的薄层被准确定位。石头的形态和不同层的连续性可以可靠地告知石头形成的“历史”。大多数人类尿路结石是异质的，由至少 2 种不同的元素组成。肾结石具有多种形态，其部分内的成分分布高度可变且复杂 [ 51]. 表面、内层和核心之间的成分可能有很大差异，尤其是草酸钙和磷酸钙结石。与外层相比，磷酸钙更常出现在结石的核心中。因此，与外层和更近的层相比，石芯可能与不同的尿液饱和度风险相关。肾结石患者的治疗应考虑到这一点。

不同的成分与不同的尿生化扰动和不同的病理有关。COD 结石主要与高钙尿症有关 [ 18 , 52 ]。COD 与磷灰石的混合结石与纯磷灰石结石中的高钙尿症而非低柠檬酸尿症相关 [ 52 ]。具有磷灰石核心的草酸钙结石可能是由尿路感染引发的。Daudon 团队广泛研究了石材结构并将其与特定条件相关联。甲状旁腺功能亢进更常与具有特定形态的结石相关，称为 IVd 或 II/IVa1 [ 47]. 这些宝石由透钙磷石或 COD 和磷灰石层制成。有关结石形态分类的更多详细信息，请参阅 Daudon 等 [ 54 ]。附着在肾乳头上的某些 COM 结石表面上小于 0.5 毫米的非常小的磷灰石斑点被称为兰德尔斑]。这些患者可能改变了与肾脏炎症和氧化应激相关的基因表达。检测特殊结构很重要，尽管它们只代表样本的一小部分，因为它们可能具有临床相关性。

所有这些要素都是对结合成分定位的结石进行准确和精确分析的论据。

在我们的研究中，石头 9 的核由白云石构成，周围是磷灰石，最后涂有透钙磷石（图 2). 我们假设尿液成分发生了变化，导致了这些不同阶段的沉淀。结石的核心可能与导致磷酸钙沉淀的古代复发性尿路感染有关。相反，我们假设透钙磷石和 COD 外部晶体与结石清除时的高钙尿症有关。如果尿路感染的其他症状已经停止，这种结石形成者的治疗应遵循钙结石建议（包括甲状旁腺功能亢进症筛查）而不是抗生素治疗。

从样本 12 可以看出（图 3), COM 根据其在石头中的定位呈现不同的光谱。吸光度峰的强度在整个结石部分是可变的。经过光谱的数学解析，一些COM点在1487cm -1 (图 3A), 和其他在 1462cm -1 (图 3B). 草酸钙光谱的这种变化与结石结构有关。两种类型的 COM 光谱以来自石核的径向线组织。在大多数情况下，COM 结石的截面具有放射状结构，可以用显微镜或扫描电子显微镜观察到 [ 52、56 ]。相比之下，有人怀疑某些 COM 结石中放射状组织的缺失可能与 COD 多态性转化有关，或者当结石颜色也非常清晰时与原发性高草酸尿有关 [56 , 57 ]。根据 Daudon 的说法，Ic 型（无组织、浅色）的 COM 结石复发率高达 82%，而 Ia 型（放射状和深色）的复发率较低，为 34% [58 ]。RCI 提供了一种最简单、更标准化的方法来检测 COM 的径向组织，并可以减少观察者间的变异性。

我们在示例 3 中展示了外部的、最近的、尖锐的晶体由 COD 组成，而石头的较旧部分，即中心，由 COM 组成（图。1). 我们假设随着时间的推移，尿潴留可能导致 COD 结晶转化为 COM，这是最稳定的热力学形式 [ 59 ]。此外，根据光谱，COM 没有径向组织，与样品 12 相反。这也表明 COM 没有像往常一样生长，而是 COD 转换的结果。事实上，已经表明草酸钙结石的结构可以与其成分可靠地相关联。Duan 等人表明，使用计算机断层扫描可以根据形状准确地区分 COM 结石与 COD 结石 [ 60]]. 他们开发了一种根据断层扫描结果自动计算形状指数的方法，该方法在 COD 结石中显示出更多曲线。该指数可用于评估结石对冲击波碎石术治疗的反应。COM 和 COD 出现在不同的尿液饱和度条件下。虽然 COM优先在高草酸尿中产生，但当尿草酸盐与钙的比例降低时，COD 会沉淀 [ 61、62 ]。此外， COD结石形成者通常更年轻，并且结石复发的风险增加 [ 63、64 ]。这些考虑因素对于钙摄入量以及抗冲击波碎石术的治疗很重要 [ 60]]. 该样本中的磷灰石内部沉积物可能与尿液成分的变化以及高钙尿症和低柠檬酸尿症有关，而不是与上述尿路感染有关。Blanco 等人还提出，尿液可以在 COD 晶体形成后在其间流动，磷灰石随后会因尿液淤滞而沉淀 [ 65 ]。所有这些考虑都意味着对患者的不同治疗和随访。

此外，良好的 RCI 分辨率（低于 2–3 μm）提高了灵敏度，并允许检测非常小的元素，如原子核和 Randall 斑块，这些元素很难用 FTIR 或 X 射线衍射分析识别。兰德尔斑是出现在肾乳头上的磷灰石小斑点，作为结石生长的成核因子。它们越来越多地出现在 COM 结石的顶部 [ 26 ]。此外，必须将它们与尿液 pH 值较高时简单沉淀的随机磷灰石沉积物区分开来。在这两种情况下，FTIR 或 X 射线衍射分析将提供低磷灰石百分比，而 RCI 可以通过它们的定位来区分它们。

与其他方法的比较

在这项研究中，我们比较了肾结石分析中的 RCI 与 FTIR 光谱。FTIR 是金标准方法，粉末X 射线衍射也证明了结石测定的性能，但较少使用 [ 30、35、66 ]。它们都有很好的结石分析记录，但与 RCI 相比，它们不提供任何结构信息。在将拉曼光谱与 FTIR 进行比较的几项研究中，样品分析表明，某些成分只能通过两种方法中的一种进行鉴定 [ 23 ]。在成分鉴定方面，拉曼几乎与 FTIR 相同，并且在某些情况下甚至更有效 [ 25 ]。

还开发了更复杂的方法，例如显微 CT 扫描和电子扫描显微镜，以收集广泛的结构信息。然而，它们目前专门用于研究目的，因为它们特别昂贵且耗时。此外，它们在区分某些相似成分时不够具体 [ 14 , 24 , 67]. 这些方法在形态测定方面比 RCI 更准确，但在成分测定方面不太精确。总之，所有技术都存在缺点，因此，应该结合起来，以避免信息丢失，并获得对成石途径中涉及的代谢风险因素的最佳理解。与其他方法相比， RCI 将振动技术和面向结构的分析很好地结合在一起，这两者非常不同 。单个样品的分析时间从 10 小时到 36 小时不等。这对临床实验室来说非常耗时，更适合研究而不是常规分析。RCI 是非破坏性的，可以存储样本。

拉曼光谱测量振动和旋转分子的散射，而 FTIR 显微镜评估这些分子的吸收。这两种方法相似且互补，但在光谱和成像分辨率方面各有优缺点。拉曼几乎不需要样品制备，并且不受水或尿素的阻碍，这在尿石症分析中很有用 。此外，人们普遍认为，与 FTIR 显微镜相比，拉曼具有更好的空间分辨率，而不是更低的光谱分辨率和更长的分析时间 此外，拉曼源可能具有破坏性，特别是对于蛋白质等较差的拉曼散射体。

Daudon 等人使用与 MOLE（激光分子微声）相关的拉曼光谱，可以分析 1 或 2μm [ 16 ] 的非常小的晶体。最近，Shameem 等人评估了在尿路结石研究中与 LIBS（激光诱导击穿光谱）相关的显微拉曼显微镜 [ 51 ]。这些方法是互补的，可以提供高分辨率样品的分子和元素数据。LIBS-Raman 要求样本切片在相对较大的区域具有物理均匀性 [ 51]. 此外，仅靠拉曼无法识别所有样品，并且结果无法通过 FTIR 金标准方法进行确认。与目前市场上可用的拉曼显微镜相比，MOLE 和 LIBS 都是昂贵且不易获得的方法。再一次，这些论文中没有提供元素分布。Tang 等人最近使用分辨率为 1μm 的 RCI 设备对分枝杆菌进行了表征 [ 69 ]。RCI 的高分辨率使这种方法甚至可以提供药物在细胞器官内的细胞分布图。

Krafft 等人测试了结肠组织的拉曼和 FTIR 成像。RCI 以 2.5 μm 的步长进行。作者证实，与 FTIR 显微镜相比，RCI 具有更好的空间和光谱分辨率，但光谱质量较低且分析时间较长。值得注意的是，一些论文还使用 FTIR 显微镜来测量肾脏内的微晶。Daudon 等人发现肾组织中存在磷酸钙和草酸钙晶体沉积物. Crystal 的栓塞尺寸约为 50μm，在 4μm 截面的组织中检测到，分辨率为 6.25μm。这些药物沉积物比我们在样本中检测到的要小。N-乙酰磺胺甲恶唑层在样品 12 中测得厚度约为 100μm。同样，在病例报告中，作者使用红外显微镜识别急性肾功能衰竭患者肾脏内的小万古霉素沉积物（100-900nm）[ 74 ]. 最后，更值得注意的是，Blanco 等人最近在尿路结石上测试了红外显微镜，并设法获得了 80μm 的分辨率，从而提供了结石成分的准确映射. 在一个样本中，他们从核心到表面识别了多达 5 个具有不同光谱的不同区域。FTIR 成像分辨率受限于接近 25μm 的衍射 [ 72 ]。通过与同步加速器、原子力显微镜或 ATR 等其他技术结合使用，可以提高分辨率。使用带有同步加速器源的 FTIR 显微镜可获得 10μm 的分辨率，用于使用金属镀膜玻璃进行肾活检中的晶体沉积 [ 70]]. 显然，这种样品制备不适用于测量数毫米且不能在 μm 范围内切片的肾结石样品。尽管如此，拉曼显微光谱学具有更好的成像分辨率，可以如上所述识别细胞和器官，但速度更慢，这使得红外显微镜成为一种有前途的方法。

研究的偏倚

这项研究的主要偏见是我们没有通过 RCI 对成分进行量化。也可以通过 FTIR 分析将磷灰石与弱碳酸化的磷灰石高度区分开来。Daudon 等人还使用拉曼微探针评估了该参数 [ 16 ]。在这项研究中，RCI 没有记录到这种差异，尽管它对尿路感染筛查很有意义 [ 75]]. 那么，这两种方法都无法对样品进行全面分析，而且该方法需要选择同一块石头的不同样品碎片。RCI 不是一种破坏性方法，但用于分析的胶水会损害 FTIR 测量。尽管我们使用 RCI 测量了最常见的宝石成分，但我们只评估了一小部分样本。不幸的是，我们没有 FTIR 显微镜，我们无法直接将其与 RCI 进行比较。

观点

除肾结石外，其他人体生物样本也已通过拉曼分析进行了评估。RCI 已在癌症诊断中得到广泛测试 [ 31 ]。实际上，癌症的组织学分类在诊断和治疗中是强制性的 [ 32 , 76 ]。因此，RCI 可以提供对癌症管理有用的肿瘤组织映射。拉曼显微镜能够区分正常组织与宫颈组织中低级别或高级鳞状上皮内病变 [ 33]. 在 Rashid 等人的研究中，RCI 还发现了具有生化异常的组织层，尽管使用了 100μm 的相当低的空间分辨率，但在光子显微镜下并未注意到这些异常。RCI 甚至已在脑外科手术中用于区分肿瘤浸润组织和非浸润组织 [ 77 ]。该方法与组织学结果高度相关，灵敏度和灵敏度分别为93%和91%，分辨率为300～25μm。一些研究将化学和生物学信息与形态学和分布参数相结合，能够以高精度正确识别肿瘤或亚细胞器官，有时甚至优于经典组织学 [31 ]。

考虑到尿石症测量在实验室之间变化很大，并且依赖于分析人员 [ 35 ]，此类方法应适用于结石评估，以减少操作员的可变性并提供高质量的分析。事实上，正如尿结石分析的两项质量评估所证明的那样，缺乏识别有趣元素的教育是一个主要问题，特别是对于破坏性方法 [ 35、66 ]。自动化软件分析和计算机辅助诊断的发展应减少观察者间和实验室间的变异性 [ 31、69 ]。

在经典拉曼光谱 [ 78 ]中可以分析湿样品，但在 RCI 中可能是一个限制，因为切片不是规则的。当切片面不够光滑时，孔隙度会发出较弱的信号。这也是一些过于易碎的化学品的问题，如磷灰石、MAP 和蛋白质。这个步骤可以通过 3D 映射设备来克服，这些设备允许将焦点保持在弯曲或粗糙的表面上，而无需进一步的样品制备 [ 79、80 ]。此外，它可以很容易地提供有关晶体几何形状或表面的信息，因为它已在骨骼或软骨以及岩石上显示出来。然而，在我们的研究中，拓扑分析的用途有限，因为样品是根据我们的协议进行研磨的。

结论

这是第一次使用拉曼化学成像来制作肾结石的二维图。我们表明，与 FTIR 金标准分析相比，RCI 是识别肾结石成分的有效工具。此外，RCI 提供了有用的成分分布图，可以更好地检测细胞核和药物层等小结构，从而提高灵敏度。RCI 允许检测 COD 到 COM 的转化，以及 COM 结石的径向结构。这种分析是半破坏性的但很耗时。该分析是 FTIR 和其他先进技术（如显微 CTscan）之间的良好折衷，但红外显微镜可能会超过它。蛋白质测量仍然是我们未能克服的问题，并且在质量评估中可能很麻烦。

打赏