科研丨天津中医药大学: 约氏乳杆菌通过重塑肠道菌群缓解急性心肌梗死的发展(国人佳作)

编译：微科盟Sky蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

肠道微生物群落可通过内环境的变化而受到干扰或修复，从而促进急性心肌梗死(AMI)的发展。肠道益生菌在AMI后肠道菌群重塑和营养干预中发挥作用。新分离的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株EU03已显示出作为益生菌的潜力。本研究探讨了约氏乳杆菌通过肠道菌群重塑对AMI大鼠的心脏保护作用及其机制。本研究通过超声心动图、组织学和血清心脏生物标志物评估左冠状动脉前降支结扎(LAD)介导的大鼠AMI模型，以评估约氏乳杆菌的有益作用。免疫荧光分析用于观察肠道屏障的变化。抗生素给药模型用于评估AMI后肠道菌群在改善心脏功能方面的作用。宏基因组学和代谢组学分析进一步研究了约氏乳杆菌富集的潜在有益机制。结果表明，经过28天的约氏乳杆菌治疗，保护了心脏功能，延缓了心脏病理，抑制了心肌损伤细胞因子，并改善了肠道屏障完整性。通过增加约氏乳杆菌的丰度，重塑了肠道微生物群落的组成。抗生素引起的菌群失调消除了约氏乳杆菌对AMI后心脏功能的改善作用。约氏乳杆菌的富集通过增加Muribaculaceae、Lactobacillus的丰度和降低Romboutsia、Clostridia UCG - 014的丰度引起肠道微生物组的重塑，这与心脏特征和血清代谢生物标志物16,16 -二甲基-PGA2和Lithocholate 3-O-glucuronide相关。综上所述，这些结果表明约氏乳杆菌对肠道菌群的重塑改善了AMI后的心脏功能，并可能促进微生物组靶向营养干预。    

图文摘要

论文ID

原名：Remodeling of the gut microbiome by Lactobacillus johnsonii alleviates the development of acute myocardial infarction

译名：约氏乳杆菌通过重塑肠道菌群缓解急性心肌梗死的发展

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2023.3

通讯作者：高秀梅，王小莹，赵鑫

通讯作者单位：天津中医药大学方剂学教育部重点实验室

DOI号：10.3389/fmicb.2023.1140498

实验设计

结果

1 约氏乳杆菌EU03保护AMI后心脏功能并改善肠道屏障

AMI后第7、14、28天口服约氏乳杆菌微生物制剂(图1A)。超声心动图评估显示，LAD结扎显著扩大了左心室容积，降低了射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。在约氏乳杆菌治疗7天、14天和28天后分别显著增强了心肌回声、EF和FS水平(与AMI相比p <0.01)(图1B-D)。心脏的宏观图像显示，随着天数的增加，模型组的坏死和肥大严重。与假手术组(Sham组)相比，约氏乳杆菌的长期给药改善了心脏的宏观图像(图1E )。组织病理学检测发现，结扎时间越长，AMI大鼠左心室(LV)壁越薄，并伴有炎性细胞浸润，心肌肥厚越严重，血管周围纤维化和间质纤维化越严重。约氏乳杆菌给药7天后组织病理学损伤轻微改善，给药14天和28天后组织病理学损伤明显改善。AMI组第7、14天血清心肌标志物SOD、LDH、CK-MB水平升高，第28天cTnT升高。约氏乳杆菌治疗7 天显著降低了TNF-α水平，约氏乳杆菌治疗14 天显著降低了SOD、LDH、CK-MB水平。治疗28天后血清SOD、LDH、cTnT水平有所下降，但无统计学差异。检测血清LPS水平以评估肠道屏障的破坏情况(图1L)。AMI后LPS水平随时间逐渐升高。与模型大鼠相比，约氏乳杆菌干预28 天使LPS水平显著降低。

图2A H&E染色切片显示，模型组大鼠结肠黏膜出现充血、水肿、溃疡，并有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。然而，约氏乳杆菌干预后，由AMI引起的结肠病理损伤得到明显改善。与Sham组相比，模型组大鼠结肠AB染色显示结肠杯状细胞受损更严重，约氏乳杆菌治疗可部分改善结肠杯状细胞受损(图2A)。我们还检测了结肠中主要紧密连接蛋白的表达水平。作为肠道屏障完整性的生物标志物，ZO-1和occludin在模型组中的表达随着天数的增加而逐渐降低，且在LJ组中的表达高于AMI组(图2B、C)。

图1. 约氏乳杆菌EU03对AMI后心脏功能具有保护作用。(A)大鼠AMI后约氏乳杆菌给药管路示意图。(B)大鼠左心室代表性超声心动图。(C) EF和(D) FS采用大鼠左心室三维测量值计算。(E)代表性心脏图片，H&E染色[比例尺为3000 μm (上)和125 μm (下)]、麦胚凝集素(WGA)染色(比例尺为50 μm)、天狼星红染色(比例尺为100  μm)。血清(F) SOD、(G) MDA、(H) LDH、(I) CK-MB、(J) cTnT、(K) TNF-α、(L) LPS水平。与Sham组相比，#p < 0.05，## p < 0.01；与AMI组相比，*p < 0.05，**p < 0.01。

图2. 约氏乳杆菌EU03改善AMI后肠道屏障并影响肠道菌群组成。(A)结肠组织病理学检查：H&E染色[比例尺1250 μm(顶部)和125 μm(底部)]，阿利新蓝(AB)染色(比例尺100 μm)，以及结肠上皮紧密连接蛋白zonula occludentes(ZO)-1 (红色)和occludin (绿色)的代表性免疫荧光显微照片(比例尺125 μm)。通过计算积分光密度(IOD)来量化ZO-1(B)和occludin(C)的强度。(D)给药7、14、28 天，不同组及不同时间点的PCoA(基于Bray-curtis)的Beta多样性。组间Anosim的显著性p值强调了微生物群落结构的差异。(E)各组Shannon指数的Alpha多样性。(F)不同组的F/B比值。(G)在属和种水平上，Kruskal-Wallis H检验的条形图显示了特定微生物组成的结果。(H)种水平上的物种关联网络。计算物种间Spearman相关系数，反映物种间的相关性。默认情况下，图中显示p < 0.05的物种；节点的大小表示对应的细菌丰度，红线表示正相关，绿线表示负相关；线条数越多表明物种间的关系越密切。(I)各组不同水平的LEfSe分析。柱状图的长度代表差异物种的丰度(即LDA值)。'g代表属'，'s代表种'。与Sham组相比，#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001；与AMI组相比，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。  

2 约氏乳杆菌EU03在AMI后重塑肠道菌群

为了确定约氏乳杆菌对AMI后7、14、28天肠道菌群结构的影响，我们进行了基于Bray-curtis的PCoA分析。如图2D所示，与相应的Sham组相比，7天和14天模型组的微生物群落没有明显变化，而约氏乳杆菌给药后微生物群落略有变化；特别是在14天到28天期间表现稳定。通过Shannon指数分析，肠道菌群的丰富度在缺血期间波动，Sham组、AMI组和LJ组之间无显著差异(图2E)。在门水平上，大鼠肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)在AMI手术7 天后下降，给予约氏乳杆菌后升高。相反，模型组的F/B值在治疗14天和28天后升高，LJ组的F/B值随着约氏乳杆菌给药时间的延长而逐渐降低并趋于稳定(图2F)。重要的是，在LJ组的肠道中，乳杆菌属(Lactobacillus)的富集随着给药时间的延长而增加。Blautia和norank_f_Muribaculaceae的丰度增加，并在第14天达到最高丰度。此外，肠球菌属(Enterococcus)的丰度在第14天和第28天降低(图2G)。相应地，在物种水平上，约氏乳杆菌、unclassified_g_Blautia、uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae和屎肠球菌(Enterococcus faecium)的丰度也以同样的趋势发生变化。此外，物种的单变量网络分析表明，约氏乳杆菌在肠道微生物群落中的丰度最高，与Muribaculaceae呈正相关，与肠球菌呈负相关(图2H)。图2I中LEfSe分析总结了各组细菌群落的富集和变化。肠球菌在7天治疗组中富集。Blautia和norank_f_Muribaculaceae在14天治疗组中富集。约氏乳杆菌在28天治疗组中富集(图2I)。这些结果表明，在AMI后给药约氏乳杆菌治疗28 天，增加了约氏乳杆菌的丰度，这与肠道菌群和屏障的改变相一致。

3 抗生素诱导的菌群失调干扰了约氏乳杆菌在AMI后的有益作用

为了确定约氏乳杆菌和肠道菌群变化在AMI后改善中的重要性，我们在AMI诱导前7 天给大鼠口服抗生素，以抑制约氏乳杆菌并扰乱肠道菌群(图3A、B)。约氏乳杆菌的富集通过增加Muribaculaceae和乳杆菌属的丰度，降低Romboutsia和Clostridia UCG-014的丰度引起肠道微生物组的重塑(附图S3A、B)。ABX处理对Muribaculaceae和乳杆菌属物种具有抑制作用。Spearman相关性分析表明，ABX敏感菌约氏乳杆菌的丰度与EF、FS、SOD水平呈正相关，与MDA、LDH、cTnT呈负相关(附图S3C)。超声心动图检查表明，在给药28天后，与无ABX的模型样本(AMI)相比，乳杆菌治疗改善了心脏功能，而ABX治疗不影响模型样本(ABX_AMI)(图3C)。值得注意的是，与不给予ABX的LJ组相比，ABX处理(ABX_LJ)消除了约氏乳杆菌对心脏的保护作用。与LJ组相比，ABX_LJ组的EF水平显著降低(p＜0.05)，而LVID;s和LVID;d显著较高(p<0.05, p<0.01)。LJ组和LR组在EF、FS和LVID;s水平上的比较没有差异，而LJ组的LVID;d水平显著低于LR组(p＜0.05；图3D-G)。观察心脏宏观图像发现，与Sham组相比，AMI组的坏死面积更大(图3H)。约氏乳杆菌给药组的坏死面积小于模型组和抗生素组，心脏外观与Sham组一样完整光滑。进一步的组织病理学分析显示，ABX_LJ治疗并没有改善心肌细胞间质水肿和炎性浸润的程度，左心室壁变薄，病变面积增大，一定程度的心肌损伤和大量间质纤维化。同样，ABX处理也降低了鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)给药对心脏功能的有益影响。

图3. 抗生素(ABX)诱导的菌群失调干扰了约氏乳杆菌对心脏功能的有益作用。(A) AMI大鼠约氏乳杆菌和ABX给药管路示意图。(B) LAD手术前给予ABX治疗7天。Sham组和AMI组每天给予生理盐水，乳杆菌单独或与ABX同时灌胃治疗28 天。(C)大鼠左心室代表性超声心动图。(D) EF，(E) FS，(F) LVID;d和(G) LVID;s通过大鼠左心室的尺寸测量来计算。(H)代表性心脏图片，H&E染色[比例尺为3000 μm(上)和75  μm(下)]，心脏组织WGA和Masson染色(比例尺为50  μm和650 μm)。与Sham组相比，#p <0.05，##p <0.01，###p <0.001；与AMI组相比，*p <0.05，**p <0.01；与LJ组相比，&p <0.05；与AMI、LJ、LR组相比，^p <0.05，^^p <0.01。  

4 约氏乳杆菌富集鉴定血清代谢生物标志物

本研究检测了约氏乳杆菌治疗的血清代谢物谱与肠道菌群的关系。与Sham组相比，AMI组血清中总SCFAs、乙酸、异戊酸和胆碱水平升高(p < 0.05, p < 0.01)，而甜菜碱水平降低(p < 0.01)。与模型组相比，LJ能显著升高血清丙酸、丁酸、甜菜碱含量，并降低己酸、胆碱含量(p < 0.05)。与LJ组相比，ABX处理可显著抑制SCFAs和TMAO相关代谢产物的水平，包括丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和甜菜碱(p < 0.05, p < 0.01) (图4A-M)。

为了进一步研究约氏乳杆菌与肠道菌群相关的生物候选物的整体代谢变化，我们进行了非靶向代谢组学分析。在有监督的OPLS-DA得分图中观察到Sham组和AMI组样本之间的显著分离，以及在PCA得分图中也观察到Sham组和AMI组样本之间的显著分离。约氏乳杆菌组与AMI组之间也表现出明显的分离(图5A、B)。与Sham组相比，AMI组在正离子模式下检测到59种差异代谢物，在负离子模式下检测到37种差异代谢物。相应地，在AMI后，LJ组在正离子模式下检测到81种差异代谢物，在负离子模式下检测到36种差异代谢物(图5C、D)。在AMI引起的差异代谢物中，LJ给药后共逆转了60个差异代谢物(附表S1)。KEGG富集分析显示，LJ影响的化合物参与cAMP信号通路、色氨酸代谢、味觉传导、突触囊泡循环、嘧啶代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢、神经活性配体-受体相互作用、TRP通道的炎性介质调节、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、癌症中的甘油磷脂代谢和胆碱代谢(图5E)。

图4. 大鼠血清中SCFAs (A-H)和TMAO相关代谢产物(I-M)的水平。与Sham组相比，#p < 0.05, ##p < 0.01；与AMI组相比，*p < 0.05；与AMI、LJ组相比，^p < 0.05，^^p < 0.01。

图5. 循环代谢组学用于不同组间代谢物的定量。(A) Sham组与AMI组在正离子模式下[R2Xp1 = 0.261, R2Xp2 = 0.146, R2Xp3 = 0.13]和负离子模式下[R2Xp1 = 0.255, R2Xp2 = 0.173, R2Xp3 = 0.136]的PCA得分图。Sham组与AMI组在正离子模式下[R2X = 0.184, R2Y = 0.7, Q2 = 0.475]和负离子模式下[R2X = 0.171, R2Y = 0.717, Q2 = 0.45]的OPLS-DA得分图。(B) AMI组和LJ组在正离子模式下[R2Xp1 = 0.25, R2Xp2 = 0.16, R2Xp3 = 0.115]和负离子模式下[R2Xp1 = 0.224, R2Xp2 = 0.18, R2Xp3 = 0.135]的PCA得分图。AMI和LJ组在正离子模式下[R2X = 0.207, R2Y = 0.837, Q2 = 0.607]和负离子模式下[R2X = 0.188, R2Y = 0.876, Q2 = 0.582]的OPLS-DA得分图。(C) Sham组和AMI组之间的火山图、(D) AMI和LJ组之间的火山图显示了差异积累[log2(倍数变化)，x轴]和显著变化[-log10(p值)，y轴]的代谢物。(E)基于LJ给药后变化代谢物的通路富集。  

此外，在有监督的OPLS-DA得分图中观察到LJ和ABX-LJ样本之间的显著分离，以及在PCA得分图中观察到LJ和ABX-LJ组之间的样本显著分离(图6A)。与ABX-LJ处理组相比，LJ组在正离子模式下检测到81种差异代谢物，在负离子模式下检测到41种差异代谢物。以VIP > 1和p < 0.05为ABX筛选条件，列举了LJ与ABX-LJ组之间前10个常见差异代谢物(图6B、C)。ABX治疗后，代谢物16,16-二甲基-PGA2水平下调，而伊沙匹隆、3-(2,4-Cyclopentadien-1-ylidene)-5alpha-androstan-17beta-ol、、3-keto Petromyzonol、Pregnan-20-one、17-(acetyloxy)-3-hydroxy-6-methyl-(3b,5b,6a)、25-Acetylvulgaroside、7a,12b-dihydroxy-5b-Cholan-24-oic acid、灵芝酸H、Lithocholate 3-O-glucuronide、氟维司群表达上调(相对于LJ)(附表S1;图6C)。约氏乳杆菌给药实验的Spearman相关性分析显示，16,16-二甲基-PGA2与EF、FS呈正相关；7a,12b-dihydroxy-5b-Cholan-24-oic acid、灵芝酸H、Lithocholate 3-O-glucuronide、25-Acetylvulgaroside与EF、FS、SOD呈负相关，与MDA呈正相关；7a,12b-dihydroxy-5b-Cholan-24-oic acid、Lithocholate 3-O-glucuronide、25-Acetylvulgaroside与LDH呈正相关(图6D)。进一步对约氏乳杆菌给药组进行相关性分析，16,16-二甲基-PGA2与乳杆菌呈正相关，与Romboutsia呈负相关。Lithocholate 3-O-glucuronide与乳杆菌和norank_f_Muribaculaceae呈负相关(附图S4)。

图6. 循环代谢组学用于ABX和ABX-LJ组AMI大鼠代谢物的定量。(A) LJ组与ABX-LJ组在正离子模式下[R2Xp1 = 0.28, R2Xp2 = 0.13, R2Xp3 = 0.119]和负离子模式下[R2Xp1 = 0.286, R2Xp2 = 0.14, R2Xp3 = 0.118]的PCA得分图。LJ组与ABX-LJ组在正离子模式下[R2X = 0.238, R2Y = 0.757, Q2 = 0.58]和负离子模式下[R2X = 0.234, R2Y = 0.731, Q2 = 0.553]的OPLS-DA得分图。(B) LJ和ABX-LJ之间的火山图显示差异积累[log2(倍数变化)，x轴]和显著变化[-log10(p值)，y轴]的代谢物。(C) LJ和ABX-LJ中VIP > 1的代谢物表达谱。(D)关键疗效指标与标志性代谢物之间的Spearman相关性分析，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。  

讨论

肠道菌群向有益方向的重塑可以延缓CVDs的病理加重。鉴于肠道菌群可以通过多种干预措施进行修饰，因此可以靶向调控参与AMI发病的宿主信号通路。肠道共生菌作为缓解CVDs的功能性益生菌，通常被认为能够恢复肠道菌群并保持平衡。研究表明，一些与肠道有关的微生物可以作为功能性益生菌，在AMI后改善心脏功能方面发挥作用。鼠李糖乳杆菌给药可能对AMI患者的心脏重塑产生有益影响。双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)可减轻动物AMI的病理效应。利用益生菌进行肠道细菌调节以缓解CVDs的发展具有重要意义。合理的益生菌组合可以成为一种替代药物治疗选择，适用于那些在初级心血管疾病预防中具有轻度心血管风险的患者，以及某些无法耐受他汀类药物的患者。总之，益生菌治疗的多数积极效果应该与临床药物治疗相结合，才更具有指导意义。本研究揭示了新分离的约氏乳杆菌随着时间的推移改善了AMI的病理过程和肠道菌群，表明约氏乳杆菌具有心脏保护作用，因此在临床上具有价值。

已报道的AMI肠道菌群失调的生物标志物，包括高F/B比值、pro-AMI微生物和较低丰度的有益菌，可以通过益生菌的健康益处得到缓解。我们发现，通过微生物重塑获得的约氏乳杆菌以上调菌群为特征，包括Muribaculaceae和乳杆菌，下调菌群包括Romboutsia和Clostridia UCG-014。共生菌的积极改变可以减少梗死面积、缺血损伤和炎症，并且可以调节脂质代谢和整体心脏存活。肠道菌群丰富度和多样性的恢复以及有益菌Muribaculaceae的恢复有助于抑制肠道屏障功能障碍、炎症和脂质代谢紊乱，这些作用与AMI的发展呈负相关。然而，一些促炎细菌(如Clostridia UCG-014)丰度的增加，会引起炎症反应，上调脂质促炎代谢物，最终加剧AMI。Romboutsia丰度的增加与高心血管风险有关。

肠-心轴是一个新颖的概念，为AMI的复杂机制提供了见解。肠道屏障是肠道菌群与心脏之间沟通途径的关键环节。肠道屏障的“渗漏性”特征是连接蛋白(包括occludin和ZO-1)受损，导致肠源性菌群和有害代谢物易位，如来自革兰氏阴性菌细胞壁的LPS，这进一步触发系统性炎症并加剧AMI。在本研究中，我们发现约氏乳杆菌改善了肠肠道屏障完整性，抑制多种氧化细胞因子、促炎细胞因子和心肌损伤相关指标(包括SOD、MDA、LDH、cTnT、LPS、TNF-α)的产生，同时伴随着ZO-1和occludin表达的增加以及心脏功能的恢复。包括Nrf2-Keap1-ARE和AMPK在内的信号通路介导了对微生物组的影响。此外，乳杆菌对病原体具有较强的抗菌活性，并能增强肠道屏障，最终发挥促进肠道微生物重塑和缓解心血管相关疾病症状的有益作用。本研究结果表明，心肌梗死后心脏重塑和结肠病理的共同变化与肠-心轴一致，即心脏和肠道菌群之间存在双向关系。

来自肠道微生物的循环代谢物有助于促进对治疗机制的理解。除常规代谢物SCFAs和TMAO之外，约氏乳杆菌的有益作用可能归因于其他代谢物的变化。约氏乳杆菌治疗减少了心脏损伤代谢物的产生。例如，PGA类似物是小鼠黑色素瘤细胞锚定独立生长的强效抑制剂。Lithocholate 3-O-glucuronide诱导胆汁淤积，对肝细胞和机体造成损伤。然而，还需要更多的实验来确定其他代谢物是否与AMI相关。“多组学”分析的结果为特定微生物类群与代谢物之间的关系指出了多种途径，为机制问题指明了方向。

在无菌或抗生素耗尽的动物中进行特定微生物菌群的移植研究，有助于探索特定细菌在表型关联中的潜在作用。抗生素处理的小鼠在AMI后表现出较强的剂量依赖性死亡，减少抗生素剂量会呈现剂量依赖性存活。这些结果是相互矛盾的，可能归因于AMI后炎症的双相性和抗生素剂量的使用。因此，我们选择了具有较高存活率和菌群清除率的抗生素剂量进行实验。我们的研究表明，在相同的条件下，抗生素对AMI没有严重的影响，这表明抗生素仅干扰了肠道菌群。抗生素治疗降低了约氏乳杆菌的丰度，因此可以观察到约氏乳杆菌对心肌梗死的保护作用。目前AMI的治疗主要包括药物治疗和手术治疗，但AMI后患者恢复期出现了诸多问题。因此，使用微生物靶向干预的精准治疗对AMI具有治疗潜力。

综上所述，通过整合多组学技术和标准化的体内策略，富集约氏乳杆菌并将肠道微生物组调节为健康状态，缓解了AMI后的不良症状。益生菌的开发将加强微生物群干预的效果，并增进人们对肠道微生物群在疾病中作用的理解。