科研丨中国农大: 褪黑素改善睡眠限制引起的小鼠肠道菌群节律的稳态(国人佳作)

编译：微科盟Sky蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

睡眠不足被认为是破坏昼夜节律的因素，同时也促进了肠道疾病的发生。肠道的生理功能依赖于肠道微生物群的正常昼夜节律。然而，睡眠不足如何影响肠道昼夜节律稳态仍不清楚。因此，本研究对小鼠进行了睡眠限制，发现慢性睡眠不足会破坏结肠微生物群的模式，并降低具有昼夜节律的肠道菌群的比例，同时伴随着KEGG通路峰值期的变化。我们随后发现，外源性褪黑素补充恢复了具有昼夜节律的肠道菌群的比例，并增加了具有昼夜节律的KEGG通路。筛选了可能存在昼夜节律振荡的菌科，如Muribaculaceae和Lachnospiraceae，这些菌科对睡眠限制敏感，并且可以通过褪黑素得到恢复。综上所述，本研究结果表明，睡眠限制破坏了结肠菌群的昼夜节律。相反，褪黑素改善了由于睡眠限制引起的肠道微生物群昼夜节律稳态的失衡。  

论文ID

原名：Melatonin improves the homeostasis of mice gut microbiota rhythm caused by sleep restriction

译名：褪黑素改善睡眠限制引起的小鼠肠道菌群节律的稳态

期刊：Microbes and Infection

IF：9.570

发表时间：2023.2

通讯作者：陈耀星

通讯作者单位：中国农业大学动物医学院

DOI号：10.1016/j.micinf.2023.105121

实验设计

结果

1 结肠微生物群的昼夜共现网络

为了探究SR处理对结肠菌群网络的影响并寻找关键物种，我们首先对三组OTU进行了不区分时间的共现网络分析。SR处理显著改变了结肠微生物共现网络的拓扑特征(图1A、B; 补充表S1)。SR组具有较少的模块、平均度、度中心性、集群，以及较多的节点和边数、接近中心性。但SR组的负边缘减少(图1B; 补充表S1)。在SR+Mel组中，节点和模块与SR组相比几乎没有变化，但正边、负边和平均度都大幅增加，而度中心性、中介中心性和接近中心性都有所下降(图1 C; 补充表S1)。

根据模块内连通性(Zi)和模块间连通性(Pi)，鉴定了三组中的模块hubs。CON组的6个OTU分属于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Muribaculaceae (补充图S2A)。SR组中的5个OTU分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、毛螺菌科和Muribaculaceae (补充图S2B)。SR+Mel组的8个OTU分别属于瘤胃球菌科、Corynebacteriaceae、Rikenellaceae、Micrococcaceae、毛螺菌科和Muribaculaceae (补充图S2C)。因此，我们发现SR处理改变了结肠微生物及其核心微生物的网络组成。补充褪黑素使微生物网络更加复杂化，并增加了核心微生物的种类。

然后，我们将ZT1、ZT5、ZT9分为AM组，ZT13、ZT17、ZT21分为PM组，比较两组之间的拓扑特征。在CON组中，PM组的网络复杂度远高于AM组(图1D和G)。在SR组中，AM和PM组之间的差异有所减弱，两组之间的拓扑特征非常相似(图1E和H)。SR+Mel组也未能恢复AM和PM组之间的差异，并且在两组中仍具有最高的复杂度(图1 F、I)。以上结果表明，CON组存在昼夜差异的微生物网络，体现了微生物的昼夜节律。SR处理使昼夜差异消失，扰乱了微生物群的昼夜节律。褪黑素的补充增加了微生物网络的复杂性和独特性。

图1. 结肠微生物群OTU水平的共现网络。

(A-C) CON组(A)、SR组(B)、SR+Mel组(C)的共现网络。将每组6个时间点的数据合并分析。每组小鼠数量为30只。节点代表唯一的OTU；节点间连线代表相关性，蓝色代表负相关，橙色代表正相关。(D-I) CON组AM (D)、SR组AM (E)、SR+Mel组AM (F)、CON组PM (G)、SR组PM (H)、SR+Mel组PM (I)的共现网络。将每组6个时间点的数据分为AM (ZT 1、ZT 5、ZT 9)和PM (ZT 13、ZT 17、ZT21)进行分析。每组小鼠数量均为15只。节点代表唯一的OTU；节点颜色表示门；节点间连线代表相关性，蓝色代表负相关，橙色代表正相关。  

2 补充褪黑素可改善SR破坏的结肠菌群的昼夜稳态

考虑到补充褪黑素后微生物网络的独特行为，我们想了解褪黑素在昼夜节律失衡的微生物群中的作用。因此，我们对数据进行了6次24小时周期的昼夜节律分析。我们首先评估CON组小鼠结肠菌群是否存在24小时昼夜节律。我们对不同时间点的聚类加权beta多样性进行了主坐标分析(PCoA)。通过Anosim分析，不同时间点的聚类具有显著差异(aosim p = 0.001; 图2A)。这一结果表明，CON组小鼠结肠菌群呈现时间变化的振荡。我们还对不同时间点到PCoA1的距离进行了Kruskal-Waills检验，发现其也具有显著的昼夜振荡(Kruskal-Waills p = 0.02; 图2D)。随后，我们利用CircaCompare算法检测不同时间点距离PCoA1的24小时周期的昼夜节律，发现其具有显著的昼夜节律性(rhythmic_ p = 0.00; 图2D)。虽然SR组的PCoA分析中各时间点之间仍存在显著差异，因此存在时间振荡(anosim p = 0.004, Kruskal-Waills p = 0.03; 图2B、E)。但CircaCompare分析显示SR组不再具有24小时周期的昼夜节律(rhythmic_ p = 0.06; 图2E)。经褪黑素治疗后，结肠菌群不仅存在时间振荡，而且恢复了24小时周期的昼夜节律(anosim p = 0.001, Kruskal-Waills p = 0.00, rhythmic_p = 0.00；图2C和F)。SR+Mel组的变化趋势与CON组相似，两组的最低值都在ZT 9，最高值都在ZT 17(图2D、F)。通过CircaCompare算法，CON组和SR+Mel组在中值、振幅和峰值方面也无显著差异(补充表S3)。这些结果表明，SR处理扰乱了微生物群的正常昼夜节律振荡。相反，补充褪黑激素可以恢复微生物群的昼夜节律，其昼夜节律趋势与CON组相同。

SR组失去了其昼夜节律，但仍具有时间振荡。这种现象可能暗示了3组间特定细菌成分及其节律的差异。因此，我们接下来在科水平上分析不同细菌丰度的节律变化，以显示不同细菌的变化。CON组17个菌科、SR组10个菌科、SR+Mel组18个菌科出现昼夜节律(补充图S3A)。SR处理消除了13个菌科的昼夜节律，4个菌科的昼夜节律不受SR处理的影响。6个菌科因SR处理出现昼夜节律。相比之下，补充褪黑素导致在SR组中失去节律振荡的5个菌科重新出现昼夜节律。SR处理后产生昼夜节律的4个菌科不受褪黑素的影响。然而，我们也发现补充褪黑素导致9个菌科表现出昼夜节律。

接下来，我们以叠加的形式展示不同菌科在每个时间点的丰度，以说明具有昼夜节律的细菌在整个种群中的比例(图2G-I)。在CON组中，具有昼夜节律的菌科占比达到83％，而SR组只有24%(图2 G和H)。补充褪黑素后，与SR组相比，具有昼夜节律的菌科比例略有增加，占67%(图2 I)。

昼夜节律菌科的丰度峰值时间的可视化显示，在CON组中拟杆菌门各菌科丰度峰值出现的时间集中在ZT9-ZT16之间。同时，厚壁菌门以毛螺科为主(图2J)。SR组中具有昼夜节律的菌科峰值时间分布缺乏聚类特征，且丰度较低(图2K)。在CON组中具有昼夜节律的毛螺菌科和Muribaculaceae，在SR+Mel组中也存在，并且它们的峰值时间与CON组相同。同时，SR组中几个具有昼夜节律的菌科在SR+Mel组中仍然保持其峰值时间(图2 L)。

SR导致结肠微生物群核心菌科的昼夜节律丧失，而次要菌科则出现了昼夜节律，从而总体上表现为节律失调。虽然褪黑素部分恢复了核心菌科的昼夜节律，但并没有消除SR中出现的菌科的昼夜节律。因此，SR+Mel组相当于同时复合了CON组和SR组的特征，这可能是其在共现网络中表现出最高复杂性的原因。更有趣的是，SR+Mel组可以独占一些昼夜节律菌科。然而，鉴于节律菌科的总体丰度，褪黑素确实恢复了CON组的昼夜节律稳态。

图2. 结肠菌群的整体昼夜节律。

(A-C) CON组(A)、SR组(B)、SR+Mel组(C)小鼠结肠菌群OTU的主坐标分析(PCoA)。不同颜色的点代表不同时间点的OTU数据。通过anosim函数分析p值和R值，p < 0.05代表组间差异显著。每个时间点n = 5只小鼠。(D-F)从ZT1到ZT21的每个时间点到PCoA1的距离。Kruskal-Waills检验计算振荡，p < 0.05被认为存在显著的时间振荡。节律性p < 0.05代表存在昼夜节律。数据以均值±SEM表示。(G-I) 24小时结肠菌群的科水平分类组成。(G) CON组、(H) SR组、(I) SR+Mel组。(J-L)极坐标图显示节律性显著的微生物组科水平相对丰度峰值出现的时间。(J) CON组、(K) SR组、(L) SR+Mel组。每个圆圈代表一个菌科。弧度表示达到峰值的时间，距离中心的距离表示显著性(距离较远表示更显著/更强的节律)。  

3 结肠中典型菌科的昼夜节律变化

不同的菌科对结肠节律有着独特的影响。因此，有必要针对不同的菌科进行具体分析。首先，我们展示了SR引起的菌科昼夜节律的变化。根据是否存在昼夜节律将其分为4种类型：(1)在CON组和SR+Mel组中具有昼夜节律的菌科；(2)仅在SR组中具有昼夜节律的菌科；(3)仅在CON组中具有昼夜节律的菌科；(4)在SR组和SR+Mel组中具有昼夜节律的菌科。

类型(1)包含5个菌科：毛螺菌科、Muribaculaceae、Rikenellaceae、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和unculture_bacteria_o_Chloroplast。它们代表了被褪黑素从SR中恢复的菌科。毛螺菌科的振幅和峰值时间在两组中都相同(图3B; 补充表S4)。与CON组相比，SR+Mel组中Muribaculaceae的中值显著降低(图3A; 补充表S4)； 理研菌科(Rikenellaceae)、棒状杆菌科和 unculture_bacteria_o_Chloroplast的中值显著增加；棒状杆菌科的振幅也有所增加；理研菌科的峰值时间不同，为12 h (图3B; 补充图S3B、C; 补充表S4)。SR组和SR+Mel组中Muribaculaceae的平均值显著降低(图3J)，而理研菌科、棒状杆菌科和unculture_bacteria_o_Chloroplast的平均值显著升高(图3L; 补充图S4 B、C)。  

SR导致两个菌科出现了昼夜节律，而褪黑素使它们的昼夜节律消失。我们将其设定为类型(2)。SR组中Family_XIII_o_Clostridiales和unculture_bacteria_o_Gastranaerophilales的峰值时间均出现在ZT13附近(图3D、E)。Family_XIII_o_Clostridiales的平均值在SR+Mel组中最高，SR组次之，CON组最低(图3M)。三组之间unculture_bacteria_o_Gastranaerophilales的平均值没有差异(图3N)。

类型(3)代表SR破坏的昼夜节律，不能被褪黑素恢复。类型(3)包括8个菌科。拟杆菌科(Bacteroidaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、Saccharimonadaceae、Stcryptlococcaceae、肠球菌科(Enterococcaceae)、uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39的峰值时间均出现在ZT13附近(图3F; 补充图S3F-K)。只有Clostridiaceae_1的峰值时间出现在ZT7.3 (补充图S3E)。Clostri diaceae_1、肠球菌科、Saccharimonadaceae和Stcryptlococcaceae在SR和SR+Mel组中显著较高(补充图S4 E、G、I、J)。丹毒丝菌科的平均值在SR+Mel组中显著升高(补充图S4H)。褪黑素恢复了SR处理中降低的拟杆菌科的平均值。

4个菌科在SR处理后出现了昼夜节律，但在褪黑素治疗后仍有昼夜节律。我们称之为类型(4)。经SR处理后，它们均表现出平均值增加的趋势，而补充褪黑素未能逆转这种趋势(图3P; 补充图S4L-N)。这两组的峰值时间均在ZT0左右(图3G; 补充图S3L-N)。且各菌科的峰值时间在SR和SR+Mel组无明显差异(补充表S4)。然而，褪黑素显著降低了气单胞菌科(Aeromonadaceae)的振幅，显著增加了Arcobacteraceae的中值和振幅(补充表S4)。类型(4)与类型(2)具有相同的意义，即昼夜节律被SR破坏而不能被褪黑素恢复的菌科。

其次，我们将对SR不敏感的昼夜节律菌科分为两种类型，(5)在CON组和SR组中都具有昼夜节律的菌科，(6)仅在SR+Mel组中具有昼夜节律的菌科。类型(5)反映了褪黑素对肠道细菌昼夜节律影响的复杂性。包含四个科：普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃球菌科、Christensenellaceae和Peptococcaceae。三组间的平均值无显著差异(图3Q; 补充图S4O-Q)。尽管CON组和SR组均存在昼夜节律，但SR提前了Peptococcaceae和瘤胃球菌科的峰值时间。

最后，在类型(6)中有9个菌科仅在SR+Mel组表现出昼夜节律。Akkermansiaceae的平均丰度在SR和SR+Mel组中显著降低(图3R)。Dermacoccaceae、Micrococcaceae、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)和韦荣球菌科(Veillonellaceae)的平均丰度在SR和SR+Mel组中显著升高(补充图S4 T-W, Y)。褪黑素恢复了SR导致Deinococcaceae平均值的升高(补充图S4S)。Akkermansiaceae、Caulobacteraceae、Deinococcaceae、Dermacoccaceae、Micrococcaceae、Rhizobiaceae、Sphingobacteriaceae的峰值时间均在ZT17左右(图3I; 补充图S3R-W)。Tannerellaceae和Veillonellaceae的峰值时间出现在ZT1附近(补充图S3X和Y)。类型(6)反映了褪黑素对特定细菌的部分改善作用，但不能完全抵消损伤。

CON组具有昼夜节律的菌科可能是主要的节律振荡因子。它们的昼夜节律对睡眠不足较敏感。这些结果表明，SR对肠道的节律稳态造成了毁灭性打击。褪黑素可以有效地调节昼夜节律优势细菌，但也会带来独特的影响。

图3. 结肠细菌随时间的变化。

(A-I)结肠菌群中具有昼夜节律的细菌在24小时内的昼夜节律模式。在每张图中，水平的白条代表主观白天，黑条代表主观夜晚。每个时间点n = 5只小鼠。数据以均值±SEM表示。通过CircaCompare算法计算的p < 0.05被视为昼夜节律。曲线表示余弦分析点的最佳拟合。R2值表示拟合程度。(J-R)具有昼夜节律的细菌的平均丰度。每组n = 30只小鼠。数据以均值±SEM表示，柱形图中不同字母表示差异显著( p < 0.05)。  

4 褪黑素改善SR破坏的菌群功能的昼夜节律

接下来，我们分析了昼夜节律振荡是否会影响微生物群落的功能。在43条KEGG通路中，CON组有23条KEGG通路具有昼夜节律，占61% (图4A)。SR处理后，有18条KEGG通路具有昼夜节律，占48% (图4B)。褪黑素处理后，43条KEGG通路中有31条具有昼夜节律，占95% (图4C)。褪黑素恢复了12条KEGG通路的昼夜节律，并形成了2条独特的昼夜节律通路(补充图S5A)。

在3组样本中，KEGG通路峰值时间呈现明显的聚集性。CON组KEGG通路峰值时间出现在ZT12和ZT0附近(图4D)。SR组KEGG通路峰值时间出现在ZT8和ZT20附近(图4E)。在SR+Mel组中，KEGG通路峰值出现时间较为分散，但也在ZT6-ZT18之间(图4F)。

根据三组的昼夜节律对KEGG通路进行分类。类型(1)：CON组和SR+Mel组存在昼夜节律；类型(2)：仅SR组存在昼夜节律；类型(3)：仅CON组存在昼夜节律；类型(4)：SR组和SR+Mel组存在昼夜节律；类型(5)：3组均存在昼夜节律；类型(6)：仅SR+Mel组存在昼夜节律。

类型(1)包含12条KEGG通路。其中有5条KEGG通路的节律参数在两组中是相同的(图4H; 补充图S5D、F、G、K; 补充表S4)。其中4条KEGG通路的中值显著降低(补充图S5E、L、C、H; 补充表S4)，1条KEGG通路的中值显著升高(补充图S5J;补充表S4)。其他次级代谢物生物合成的振幅增加(补充图S5C)，药物耐受性的振幅降低(补充图S5E)。在峰值时间变化的4条KEGG通路中，3条KEGG通路的峰值时间提前，1条KEGG通路的峰值时间延迟(补充图S5B、H、I、L)。

类型(2)的KEGG通路也显示了褪黑素的治疗作用。只有免疫性疾病属于类型(2)(图4 I)。免疫性疾病的平均值在SR处理后升高，且褪黑素补充后不能恢复(图4O)。

KEGG类型(3)和(4)代表SR破坏但褪黑素不能恢复的通路。类型(3)包含3条KEGG通路。它们在CON组中具有相似的峰值时间(图4J; 补充图S5M和N)。类型(4)包含9条KEGG通路。其中，核苷酸代谢和其他氨基酸代谢以及传染病寄生虫的峰值时间均提前(补充图S5Q-S)。其余KEGG通路的节律参数未发生变化。

类型(5)包含8条KEGG通路。其中，有5条KEGG通路在3组中仅出现峰值时间变化(图4L; 补充图S7A-C、G)。具有中值变化的KEGG通路有3条。SR组和SR+Mel组的分泌系统和神经系统的中值显著低于CON组(补充图S7D、F)。SR组和SR+Mel组的膜转运显著降低。该组的中值与CON组相比显著升高(补充图S7 E)。类型(6)包含2条KEGG通路，外源物质生物降解和代谢，以及物质依赖。峰值时间出现在ZT17附近(图4M; 补充图S7H)。

图4. 结肠菌群KEGG通路的整体昼夜节律变化。

(A-C)具有昼夜节律的KEGG通路比例。(A) CON组、(B) SR组、(C) SR+Mel组。(D-F)极坐标图显示具有显著节律性KEGG通路相对丰度的峰值时间。(D) CON组、(E) SR组、(F) SR+Mel组。每个圆圈代表一个KEGG通路，按类别着色，按中值缩放。弧度表示达到峰值的时间，距离中心的距离表示显著性(更显著/更强的节律靠近图表边缘)。(H-M) KEGG通路中具有昼夜节律的通路24 h周期的昼夜模式。在每张图中，水平的白条代表主观白天，黑条代表主观夜晚。每个时间点n = 5只小鼠。数据以均值±SEM表示。通过CircaCompare算法计算的p < 0.05被视为昼夜节律。曲线表示余弦分析点的最佳拟合。R2值表示拟合程度。(N-S)具有昼夜节律的通路平均丰度。每组n = 30只小鼠。数据以均值±SEM表示，条形图中不同字母表示差异显著( p < 0.05)。

讨论

在本研究中，我们建立了一个为期28天的睡眠限制小鼠模型，发现长期睡眠不足会破坏肠道菌群的昼夜节律。然而，补充褪黑素可以部分恢复微生物的昼夜节律。

过去的研究表明，睡眠剥夺会破坏肠道菌群稳态，而褪黑素可改善这种情况。我们的研究填补了关于褪黑素对微生物昼夜节律作用的空白。本研究发现，睡眠不足严重扰乱了结肠菌群的整体昼夜节律。在本研究中，肠道菌群的平均值没有发生变化，但它们的昼夜节律不同。微生物群节律的失调可能是睡眠不足引起疾病的根本原因之一。褪黑素的补充具有令人满意的效果，它恢复了微生物群受损的昼夜节律。但值得注意的是，褪黑素并未完全修复SR处理后的节律稳态。它部分保留了SR组的节律振荡特征，同时自身也带来了新的节律振荡单元。因此，SR+Mel组的网络最为复杂。

本文将三组中表现出昼夜节律的菌科分为六种类型。类型(1)和(2)共同代表可以通过褪黑素恢复昼夜节律的菌科。它们是睡眠不足敏感的标志物和褪黑素治疗的靶点。巧合的是，网络节点筛选出的模块hubs包括的Muribaculaceae和毛螺菌科均属于该类型。Muribaculaceae是小鼠肠道菌群中的有益菌，属于拟杆菌门，有助于延长小鼠寿命。在反刍动物中的研究表明，Muribaculaceae在奶牛瘤胃中表现出明显的昼夜节律振荡，其节律受褪黑素的影响，而其丰度的升高可能有助于治疗奶牛的隐性乳房炎。在患有肌少症的血液透析患者中，Muribaculaceae也被发现呈下降趋势。毛螺菌科属于厚壁菌门。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)患者中毛螺菌科的丰度较低。毛螺菌科还可以增强宿主的抗氧化和抗辐射能力。以上两种菌科可视为治疗人群睡眠剥夺的候选益生菌。

类型(3)和(4)代表对SR敏感但不能被褪黑素恢复的细菌群。肠杆菌科是SR组中的模块hub，属于此类别。它是一种常见的细菌，包括机会性病原菌和共生菌，在肠炎发生时会增加。然而，SR+Mel组的模块hub不包括肠杆菌科，表明褪黑素削弱了其在整个微生物群中的作用。

类型(5)和(6)是对SR处理不敏感但对褪黑素有反应的菌科。这些类型表明了褪黑素在恢复效应之外的作用。CON组中被鉴定为模块hub的瘤胃球菌科和在SR+Mel组中鉴定为模块hub的Micrococcaceae均属于此类。瘤胃球菌科是属于厚壁菌门的有益菌。它产生短链脂肪酸，特别是丁酸，是一种重要的脂质代谢介质。它还可以改善肠炎，增强宿主肠道的抗氧化能力。

褪黑素参与宿主与肠道共生菌相互作用的机制尚不清楚。有研究报道，褪黑素对某些疾病的改善作用必须通过肠道微生物群来发挥。考虑到褪黑素能够穿过包括细胞膜和血脑屏障在内的所有细胞屏障，因此褪黑素可能是来自共生微生物的内分泌信号，并且作为“元器官”对宿主做出响应。褪黑素可以通过上述途径影响微生物的分子生物钟，调节微生物代谢产物的节律，进而影响宿主的功能。仅在SR+Mel组中具有昼夜节律的菌科可能对褪黑素非常敏感。未来利用对褪黑素敏感的单一细菌培养物的研究将有助于进一步了解褪黑素作用的机制。

结论

本研究结果表明，睡眠不足会导致结肠菌群的节律失调。补充褪黑素可以改善结肠菌群的昼夜节律。本研究证明了时间维度在肠道内稳态中的重要作用。这为治疗因睡眠不足或睡眠障碍引起的肠道问题提供了候选的益生菌和药物。

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