【论肿道麻】自然杀伤细胞在抗肿瘤过继细胞免疫治疗中的应用

自然杀伤细胞（NK）细胞是一种独特的先天淋巴细胞，能够识别和消除被病毒感染的细胞和肿瘤细胞。NK细胞具有多种细胞毒性机制，能够产生细胞因子，调节免疫反应，在抗肿瘤免疫中起着关键作用。近20年前，NK细胞作为免疫治疗药物，在治疗晚期白血病患者中显示出了安全性和有效性。美国MD安德森癌症中心和德国慕尼黑工业大学的研究者发表在Nat Rev Cancer的题为Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy的综述，详细介绍了抗肿瘤过继细胞免疫治疗中的NK细胞。现介绍如下：                        

NK细胞的生物学特性                          

研究人员在临床前和临床研究中观察到，低NK细胞活性与肿瘤易感性增加和转移⻛险升⾼有关。NK细胞具有很强的细胞毒性，在与靶点形成免疫突触时，通过释放溶解细胞颗粒和细胞毒性细胞因⼦引起强烈反应。NK能够产⽣⼀系列的细胞因⼦和趋化因⼦，调节B细胞和T细胞的形成，影响树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的功能。正引如此，NK细胞在免疫治疗中的地位才显得格外重要。⼈类NK细胞被IL12、IL15和IL18预激活，随后休息1-3周，在暴露于细胞因⼦或K562⽩⾎病细胞后能够产⽣强烈反应。许多研究⼩组在各种免疫环境中描述了类似的记忆功能。                        

NK细胞的来源和供体的选择                          

在肿瘤患者中，NK细胞通常为功能失调的表型，表现为基因表达谱的改变和细胞毒性功能的降低，从⽽降低了⾃体NK细胞治疗应⽤的可⾏性。NK细胞的来源多种多样。即外周⾎单核细胞、脐带⾎、永⽣细胞系、造⾎⼲细胞、祖细胞和诱导多能⼲细胞。所有来源都可以提供有临床意义的细胞剂量，但它们可能具有不同的潜在转录、表型和功能特性。                        

图1. 不同来源的 nK 细胞的优势和局限性                                    

增强NK细胞适应性和抗肿瘤能力                        

嵌合抗原受体                          

嵌合抗原受体（CAR）是合成的融合蛋白，包含细胞外抗原识别结构域和触发细胞活化的细胞内信号部分。最常见的是，来自所需抗体的单链可变片段 (scFv) 用于抗原结合域，利用受体-配体的天然特异性相互作用。CAR可以在免疫效应细胞上表达，目的是将它们的特异性重新编程为特定靶标（图 2a）。CAR工程T细胞疗法最先出现，为免疫肿瘤学应用开发了各种产品。此后该领域不断扩大，NK细胞也被整合到其中。人们越来越关注基于与NK细胞生物学相关的激活信号设计CAR（图3b），包括DNAX激活蛋白12（DAP12）和DAP10，它们在一些研究中被用来代替CD372-76。这些衔接蛋白是细胞内信号域，通过募集 PI3K 发挥作用，并与激活分子如NKp44、KIR（KIR2DS和KIR3DS）和NKG2C相关。与CD3类似，DAP12也包含免疫酪氨酸激活基序（ITAM），一旦磷酸化，就会启动一系列信号，最终导致细胞毒性颗粒和促炎细胞因子（如TNFα和IFNγ72）的释放。DAP10虽然不具有ITAM结构域，但已被证明可通过NKG2D-DAP10轴的信号传导在NK细胞中诱导有效的杀伤活性。           

图2. 重定向NK细胞特异性               

NK 细胞接合剂                          

NK 细胞接合剂可以通过将NK细胞引导至肿瘤部位，接合剂结合肿瘤细胞上的靶抗原（图 2c）激活NK细胞上的受体引发强烈的抗肿瘤反应。在使用NK细胞接合剂靶向血液学和实体恶性肿瘤时，各种临床前研究都显示出可喜的结果。最近的研究表明，通过在 AML 细胞上使用靶向CLEC12A的三特异性分子并通过人源化抗CD16单抗和IL-15激活NK细胞，NK细胞介导的对原发性患者来源AML母细胞的反应很强。此外，针对两种NK激活受体CD16和NKp46的三功能接合剂被证明可以驱动有效的抗肿瘤反应，最终在临床前模型中实体和转移性恶性肿瘤的体内有效控制肿瘤生长。随着越来越多的策略转向临床试验，研究重点将转向评估负载NK细胞抗肿瘤作用的持久性以及确定是否需要多种治疗才能持续治疗效果。            

作者团队近期研究证明，当CB-NK细胞与AFM13（一种结合NK细胞上的CD16和白血病或淋巴瘤靶标上的CD30的双特异性接合剂）复合时，表现出CD30+肿瘤细胞杀伤力的增强，从而导致CAR样反应。作者的团队已经将这种方法转化为临床治疗R/R CD30+霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤（NHL）（NCT04074746）的方法。随着越来越多的策略转变为临床试验，评估载有接合剂的NK细胞抗肿瘤作用的持久性并确定是否需要多次治疗才能获得持续的治疗效果也很重要。                        

细胞因子武装                          

NK细胞体外扩增时添加细胞因子IL-2、IL15和IL-21，可以增强NK细胞毒性功能，提高增殖率，同时保持细胞处于健康状态。当在存在 IL-12/15/18 的情况下培养时，原代NK细胞转变为另一种细胞表型，即细胞因子诱导的记忆样NK细胞。它在移植前和移植后的复发髓系肿瘤患者中显示出较好的临床疗效。作者的研究小组以及其他研究人员已经证明，与单独使用CAR相比，联用IL-15的 NK细胞在临床前模型中表现出优越的持久性。这些发现在一项对CD19+淋巴样恶性肿瘤患者的临床研究中得到了证实。许多患者在治疗一年后仍然可以在循环中检测到CARNK细胞。相对于细胞因子修饰方法而言，更重要的是确定最佳的细胞因子给药策略，以增加功能性和持久性，而不会诱导代谢衰竭而损害NK细胞的功能。            

克服免疫抑制                          

肿瘤微环境的特征是免疫抑制性代谢物、葡萄糖和氨基酸匮乏、缺氧和代酸，这些共同阻碍了有效的抗肿瘤免疫。特别是在实体肿瘤中，缺氧是免疫细胞功能障碍的一个常见因素。            

肿瘤通常表现出异常增高的代谢行为，导致高乳酸水平、重要营养物质过度消耗和代谢产物增加、腺苷和活性氧浓度增加。此外，不受控制的增殖、功能失调的血管系统和免疫抑制性细胞亚群的存在导致进入肿瘤微环境的免疫效应细胞无法生存。为了克服代谢性免疫抑制的有害影响，目前的策略主要集中在两个领域：改变肿瘤的代谢构成或修改免疫细胞中的基因表达程序，以保护它们免受肿瘤微环境中的抑制性代谢物影响。            

腺苷是ATP代谢产物，是通过外切核苷酸酶CD39和CD73的活性产生的。在临床前研究中，基因编辑删除CAR T细胞和CAR NK细胞中的腺苷A2A受体，提高了这些细胞的效力和抗肿瘤疗效的希望。TGFβ信号通路是肿瘤微环境内免疫抑制的另一种机制，对NK细胞功能产生有害影响。体内证据表明在胶质⺟细胞瘤⼩⿏模型中，TGFβ信号通路的破坏可以保护NK细胞的细胞毒性。调节肿瘤微环境中的免疫代谢，最重要的是实现⽣理平衡， ⼀些代谢物也是正常代谢的重要组成部分。许多策略仍在开发中，肿瘤微环境调节和NK细胞⼯程的联合⽅法似乎可以减少免疫抑制，并维持强⼤的免疫细胞活性。           

图4. 克服NK细胞功能抑制因⼦的基因⼯程策略

检查点中断                          

肿瘤已经进化出复杂的机制来逃避免疫监视，包括免疫检查点的参与，这可能以与针对T细胞描述的类似方式抑制NK细胞。阻断T细胞相关免疫检查点PD1和CTLA4已经取得的床成功，研究人员继续探索在NK细胞背景下调节这些调节回路的潜力（图4b）。已研究的其他调节剂包括TIM3、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）和LAG3。它们在体外可以逆转肿瘤诱导的NK功能障碍。这些研究预示了靶向基因干预调节NK细胞生物学的潜力。作者预计无偏倚的高通量途径将以更系统的方式阐明特定基因干预的功能后果，最终为下一代NK细胞免疫疗法的设计提供信息。                        

增强NK细胞靶向运输                          

NK细胞运输和穿透肿瘤床的能⼒是有效抗肿瘤免疫的关键先决条件，决定了是否能够改善临床结果。NK细胞与其他免疫细胞类似，通过在肿瘤微环境中分泌的趋化因⼦受体及其同源配体的动态相互作⽤，被引导到肿瘤部位。现有的研究已经提供了令⼈⿎舞的临床证据，⽀持趋化因⼦受体调节，以增强NK细胞进⼊肿瘤床，治疗许多类型的肿瘤，包括多发性⻣髓瘤、成胶质细胞瘤、肾细胞癌、胰腺导管腺癌和卵巢癌。            

尽管取得了这些进展，但仍然存在三个重要障碍。 首先，趋化梯度依赖于足够的肿瘤灌注，而微血栓诱导的循环障碍可能需要增加肿瘤微灌注的策略。 其次，肿瘤微环境中趋化因子的释放遵循不同的肿瘤特异性动力学，可能需要人为地提高肿瘤内趋化因子水平以强烈吸引NK细胞。最后，趋化因子-受体相互作用究竟是促进还是消除NK细胞归巢，可能是取决于特定肿瘤类型。未来的研究将需要解决这些重要问题，并最终验证其作用是否可以在人体内复杂和动态的趋化因子相互作用的背景下进行。                        

临床经验                          

CAR-T细胞治疗取得了显著的临床结果，⼀些患者在持续CAR-T细胞治疗下实现了长达10年的缓解。这种新型细胞免疫疗法还显示出治疗各种肿瘤的潜力，推动了越来越多新策略的发展，以在这些成功的基础上再接再厉。CAR T细胞的经验阐明了成功开发安全有效的细胞疗法的许多要求，也揭示了与抵抗机制和免疫效应细胞持久性障碍相关的关键挑战。从 CAR T细胞的临床经验中获得的知识促成了新型细胞治疗方式的出现。在过去的十年中，该领域已经看到NK细胞成为新的治疗候选者，其生物学特性可能有助于克服基于T细胞的方法所见的一些局限性。早期的临床数据表明，NK细胞非常适合用于异体治疗，到目前为止，在正在进行的临床研究中还没有报道过重大不良事件。            

确保NK细胞治疗中的基因组保真度                          

鉴于对基础NK细胞免疫生物学新见解产生的范围广阔且步伐加快，作者预计新型工程细胞产品将会不断增加，因此需要建立用于筛选和表征产品的平台，以识别由脱靶核酸酶活性引起的意外遗传改变。随着该领域的进步，一些基因组变化可能无意中导致致癌突变并继续在背景中循环。为了满足这一需求，美国国立卫生研究院（NIH）启动了体细胞基因组工程（SCGE）计划，其主要任务有两个：一是向研究人员提供经济援助，以促进基因组编辑技术向临床的转移，二是支持开发更全面的检测方法，以调查使用这些工具可能产生的潜在生物学不利影响。                        

总结                          

在这篇综述中，作者详细介绍了NK细胞的生物学特性、来源和供体选择、增强NK细胞的适应性和抗肿瘤功能、确保NK细胞治疗的基因组保真度、临床经验教训等内容。重点讲述了增强NK细胞毒性和寿命的各种方法，评估了挑战和机遇，并反思了从临床中获得的经验教训将如何指导下一代NK细胞产品的设计，以解决每种癌症的独特复杂性。                        

需要注意的是，尽管基于NK细胞的免疫治疗被视为安全、现成的抗肿瘤治疗，但重要问题仍悬而未决。随着该领域的发展，阐明决定NK细胞效力和持久性的关键参数将成为解决每种疾病适应症的重要途径。此外，与共刺激信号的使用、细胞因子武装以及与其他治疗方式的结合相关的决策，将在最大化过继转移NK细胞的寿命和获益方面发挥作用。最后，至关重要的是开发和实施NK细胞扩增和冷冻保存的最佳方法，以确保维持高质量的产品。从逻辑上讲，为了使新出现的NK细胞治疗计划取得成功，必须建立由研究人员、临床医生和监管人员组成的多学科团队结构，共同构建临床转化的整体路径。                                  

编译：奚旻萱；吴星

审校：张军；缪长虹

参考文献：Laskowski T J, Biederstädt A, Rezvani K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy[J]. Nature Reviews Cancer, 2022, 22(10): 557-575.              

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