预测发生和复发的草酸钙结石形成者的激素和分子特征

Elshal, A.M., Shamshoun, H., Awadalla, A. et al. Hormonal and molecular characterization of calcium oxalate stone formers predicting occurrence and recurrence. Urolithiasis 51, 76 (2023). https://doi.org/10.1007/s00240-023-01440-8

研究的目的是调查性激素、雄激素受体 (ARs) 和 miRNA/CSF-1 在草酸钙 (CaOx) 肾尿石症的发生和复发中的作用。在这项前瞻性研究中，74 名 CaOx 结石患者；结石组 (SFG) 和 40 名健康受试者；对照组进行比较。SFG 包括新发病例和复发病例。分析了类固醇性激素血浆测定，包括睾酮、游离睾酮、二氢睾酮、雌二醇和性激素结合球蛋白。比较各组之间的 AR、miRNA-185-5p 和 CSF-1 表达。SFG 显示出比对照组（分别为 1 ± 0.08 和 1 ± 0.07）显着更高的 AR 和 miRNA-185-5p 表达（分别为 3.7 ± 1.3、1.8 ± 0.4）（p < 0.05)。然而，结石形成者的 CSF-1 表达显着低于对照组（分别为 0.4 ± 0.19 和 1 ± 0.1）（p  < 0.05）。在性激素、AR、miRNA 或 CSF-1 表达方面，新发和复发 SFG 之间未检测到差异。我们的数据表明 AR、miRNA 和 CSF-1 信号在人类肾结石发病机制中的重要作用。

尿石症是全世界最常见的泌尿科保健问题之一。据估计，草酸钙 (CaOx)/磷酸钙 (CaPh) 结石的发生率高达所有肾结石的 80%。钙基肾结石的潜在病理生理学是复杂的和多因素的，大多数这些结石发生在健康个体中，因为代谢紊乱涉及结石形成者和结石抑制剂之间的不平衡。这些紊乱中最常见的是特发性高钙尿症、高草酸尿症和低柠檬酸尿症 [ 1 ]。

CaOx 结石的形成可能受到浸润性巨噬细胞的影响，其中包括促炎性巨噬细胞或促进晶体沉积的 M1 和抗炎性巨噬细胞或直接吞噬草酸钙结石形成的 M2 巨噬细胞 [2 ]。

关于肾结石的年龄和性别患病率，男性比女性更常见，大约为 2–3:1。这种患病率差距主要存在于 15 至 49 岁的育龄期，并且在雌激素水平较低的绝经后女性中最低，这表明雌激素可以作为一种预防尿石症的保护性激素 [3 , 4 ]。然而，最近的证据表明男性和女性之间的发病率差异正在缩小。使用国家健康和营养检查调查 (NHANES) 数据，Stamatelou 等人。据报道，结石病的男女比例略有下降，从 1.75（1976 年至 1980 年）降至 1.54（1988 年至 1994 年）[ 5]. 最近，NHANES 数据 (2007–2010) 显示结石患病率男性为 10.6%，女性为 7.1%，比例为 1.49:1 [ 6 ]。Lieske 等人。发现 60 至 69 岁年龄组的男性发病率最高，而 30 至 39 岁和 60 至 69 岁女性的发病率略高 [7 ]。

此外，在前列腺癌患者中使用雄激素剥夺疗法 (ADT) 可使后续肾结石的风险降低约三分之一 [ 8 ]，这可能表明男性雄激素对肾结石形成有促进作用。在一些试验中，这种效应已在大鼠身上得到证实 [ 9 ]。

睾酮似乎通过抑制肾脏中骨桥蛋白的表达和增加尿液中草酸盐的排泄来促进结石形成，并且已经发现这种作用可以被雌激素逆转 [ 10 ]。促进睾酮对草酸钙结石形成作用的另一个可能机制可能是由于尿中尿酸排泄增加 [ 3 ] 和乙醇酸氧化酶 (GAO) 的肝合成增加，该酶主要参与原发性高草酸尿症 [ 11 ]。

性激素的这种作用可以通过血清激素水平的变化或其受体的表达来完成。研究发现，雄激素受体 (AR) 刺激会增加抑制巨噬细胞集落刺激因子 1 (CSF-1) 的 miRNA-185-5p，从而抑制 M2 介导的 CaOx 晶体吞噬作用[ 12、13、14 ]。然而，这种作用仅通过体外研究和大鼠模型使用人类细胞系得到证明。此外，据报道肾结石患者的睾酮水平较高。考虑到雌激素的作用，由于缺乏对雌激素作用的评估或缺乏可描述的雌激素对结石形成的抑制作用，数据很少 [ 12 , 13 ,14 ]。此外，性激素和草酸钙结石复发之间的关系在之前的任何试验中都没有被评估过。

到目前为止，关于性激素与尿路结石患病率之间的关联以及这种关联在临床实践中的应用的数据还很缺乏。这项研究旨在寻找性激素与草酸钙结石形成之间的关联。此外，还评估了性激素与草酸钙结石复发之间的关系。

患者和方法

研究设计和小组

这是一项前瞻性对照研究，经当地伦理委员会批准后于 2020 年 6 月至 2021 年 6 月期间进行。

在进一步的结石分析中被诊断为草酸钙 (CaOx) 结石的患者，无论是纯 CaOx 结石还是混合结石，都被分配为结石形成组 (SFG)，并与选自相同年龄范围且没有病史或放射学证据的健康志愿者进行比较尿路结石并被视为“控制”组。

结石形成组被细分为：“denovo”组包括首次出现肾结石的患者，并将他们与“复发”组进行比较，“复发”组出现之前需要积极干预的肾结石发作。

纳入和排除标准

纳入标准包括 18 至 60 岁之间的男性患者，他们被诊断患有肾结石并被收治到我们的中心进行积极的结石干预。要求符合条件的受试者签署知情同意书。

排除标准包括患有已知甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、反复尿路感染、肾脏和肝脏疾病、肠道吸收不良或代谢综合征的患者被排除在研究之外。此外，患有已知尿路结构或功能异常（如膀胱输尿管反流、神经性膀胱或骨盆输尿管连接部梗阻）的患者也被排除在研究之外。

干涉

根据结石体积、位置和外科医生的偏好，所有被诊断患有肾结石的患者均采用标准经皮肾镜取石术 (PNL) 或逆行肾内手术 (RIRS) 进行治疗。取回的结石被提交进行结石分析，其中包括草酸钙 (CaOx) 结石形成剂。

研究检查

收集所有临床数据，包括病史、临床检查和常规实验室检查。肾脏和泌尿道系统的超声和计算机断层扫描评估以及肾结石的诊断由主治放射科专家进行。

用于实验室和分子分析的样品采集如下：

收集 24 小时尿液样本，用于测定钙、尿酸、柠檬酸盐和草酸盐的水平。

用于使用 FT-IR（傅里叶变换红外线）光谱分析寻找石头类型的石头样本。

采集血液样本以评估性激素水平和基因表达。

激素分析

对于激素分析，收集所有血液样本，每个样本以 3000 g 离心 15 分钟，分离的血浆然后分离并储存在 - 20 ℃ 直到激素测定。通过 ELISA 分析血浆样品中的激素，包括睾酮 (T)、游离睾酮 (FT)、二氢睾酮 (DHT)、雌二醇 (E2) 和性激素结合球蛋白 (SHBG)。

使用实时 PCR 的 AR 和 CSF-1 基因表达

通过定量 RT-qPCR 方法评估 AR mRNA 水平。从血样中分离出总 RNA (0.5 μg)，并进行逆转录。使用 AR 引物（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通过实时 qPCR 检查 AR 和 CSF-1 引物以及人 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 的基因表达。基因表达所有数据均标准化为 GAPDH；假定一个肿瘤的表达为1并用作参考。2-ΔΔCT 方法用于计算目标基因的相对数量。

miRNA-185-5p的基因表达

miRNA 技术巧妙地将成熟 miRNA 特异性的通用加尾和逆转录反应与最先进的引物分析设计技术相结合，能够准确测量 miR-2909 的表达水平。使用 miRneasy 从血浆样本中提取 miRNA迷你套件。从 1 μg 总 miRNA 合成 cDNA。使用实时 PCR（第一步加）进行扩增和检测。AR、CSF-1 和 miRNA-185-5p

研究成果

主要结果是评估性激素与草酸钙肾结石发生之间的关联，而次要结果是评估这些激素与草酸钙结石随时间复发之间的关联。

统计分析

连续变量表示为正态分布的平均值±标准差和非正态分布变量的中位数和范围。序数和名义变量以频率和百分比表示。研究组和对照组之间的比较通过对正态分布连续变量的Student's t检验和对不对称连续变量的 Mann-Whitney 检验进行。卡方检验和 Fisher 精确检验用于分类变量之间的比较。适当时通过逻辑回归进行多变量分析。P值 < 0.05被认为是显着的。SPSS软件用于数据的存储和分析。

结果

人口统计和围手术期数据

在 2020 年 6 月至 2021 年 6 月期间接受 PNL 或 RIRS 内镜治疗的 91 名被诊断患有肾结石的男性患者中，有 74 名患者被诊断为 CaOx 结石并被纳入研究。然后，将它们与 40 名健康受试者进行比较。

之后，将 SFG 的 2 个亚组相互比较：新发组 40 名患者和复发组 34 名患者，如研究流程图所示（图 1  ）。

图。1  

CONSORT 流程图

SFG 和对照组的平均 ± SD 年龄和 BMI 分别为（52 ± 14 和 54 ± 10，P = 0.4）和（30.6 ± 7.3 和 29 ± 5.3，P = 0.09）。此外，新发和复发结石形成组的患者人口统计学和结石特征具有可比性，无显着差异，如表1所示。

主要结果

如表2所示，与对照组 1 ±分别为 0.08、1 ± 0.07 和 34 (20–55)，p  < 0.001。

表2 SFG（及其2个亚组）与对照组的激素和分子特征比较  

然而，SFG 中的 RQ-csf-1 显着低于对照组（分别为 0.4 ± 0.19 和 1 ± 0.1），p  < 0.001，而血清雄激素和 SHBG 水平在两组之间没有显着差异。

次要结果

表2总结了 SFG 的数据及其 2 个子组的比较分析。新发和复发性结石形成者组在血清雄激素、雌二醇水平和 RQ-AR、RQ-csf-1 和 Mirna 185 的分子基因表达方面具有可比性，p > 0.05  。

表3总结了 2 个结石形成亚组的 24 小时尿液代谢物，只有尿柠檬酸盐水平在新结石形成者中显示出显着更高的中值浓度 (< 0.001)。

表 3 新发结石组和复发结石组的代谢检查比较  

讨论

在过去的 2 年中，肾结石患病率显着增加。根据国家健康和营养检查调查 (NHANES 2007–2010) 的最新报告，美国成年人的肾结石患病率为 8.8%：男性为 10.6%，女性为 7.1% [13 ]。

由于治疗费用、病假、肾功能损害和肾血管性高血压的风险，肾结石具有重大的经济和医疗负担 [ 15 ]。结石病的另一个主要问题是复发的风险，50% 的肾结石患者有机会在 7 年内再次发生结石病 [ 16 ]。

CaOx 结石是通过复杂的多因素过程形成的，包括潜在的遗传和代谢异常、生活方式、肥胖和炎热的气候环境 [ 1 ]。最近，在性激素和肾结石之间发现了很强的关联。睾酮和二氢睾酮激素被发现是 CaOx 尿石症发生的潜在促进因素，而雌激素被发现对尿石症具有保护作用 [ 3 , 14 ]。

这一作用得到了尿石症流行的支持。据观察，女性结石病呈双峰分布，在 60 岁时出现第二个发病高峰，与绝经期开始和雌激素水平下降相对应 [7 ]。此外，与正常雄性相比，高草酸尿症在阉割雄性中的发生率显着降低 [ 17 ]。以高雄激素血症的临床和实验室证据为特征的多囊卵巢综合征是肾结石形成的已知危险因素 [ 18 ]。在一些动物研究中，睾酮的给药增加了尿液中草酸盐的排泄并促进了草酸钙结石的形成 [ 19 ]。

睾酮在尿石症发病机制中的这种促进作用是通过不同的机制介导的，包括增加肝脏合成乙醇酸氧化酶 (GAO)，从而导致高草酸尿症 [ 11 ]。此外，还发现睾酮会抑制肾脏骨桥蛋白的表达，随后会增加肾脏对草酸盐的排泄 [ 10 ]。在血清中，95% 的睾酮与性激素结合球蛋白结合，只有 1% 到 2% 是游离睾酮 [ 20 ]。游离睾酮扩散到靶细胞中，在那里它与 AR 结合，AR 在雄激素信号传导中起着关键作用。

发现 ARs 在正常远端肾小管上皮细胞的细胞核中表达。此外，他们被发现在高草酸尿症患者的肾小管上皮细胞中上调，这表明雄激素/AR 轴增强在肾结石形成中的重要作用 [9 ]。

AR 在高草酸尿症和 CaOx结石形成发病机制中的分子作用机制已在 2 项小鼠动物试验中得到证实 [ 12、21 ]。

首先，在生理学基础上，存在肾内巨噬细胞的类型：M1巨噬细胞引起肾上皮损伤和炎症而不吞噬CaOx晶体，M2巨噬细胞促进CaOx晶体的吞噬。

在这项试验中，他们发现 CSF-1 主要由肾小管上皮细胞分泌，在 M2 巨噬细胞增殖和高草酸尿症的扩展抑制中发挥重要作用。

然而，他们发现 AR 增加了抑制 CSF-1 的 miRNA 表达，导致 M2 巨噬细胞抑制并促进高草酸尿症。

在第二项试验中 [ 21 ]，他们发现 AR 可以在转录水平上直接上调肝乙醇酸氧化酶和肾上皮 NADPH 氧化酶亚基 p22-PHOX。这种上调可能会增加草酸盐的生物合成和氧化应激，从而导致肾小管损伤。使用 AR 降解增强剂二甲基姜黄素 (ASC-J9) 靶向 AR 可抑制 CaOx 晶体形成。然而，这些结果仅在动物研究中得到证实。

只有一项试验评估了患有 CaOx 结石的人类患者的 ARs 水平 [ 9 ]。该研究包括 68 名参与者、37 名患有 CaOx/CaPh 结石的男性患者和 31 名健康对照者。在正常远端肾小管上皮细胞的细胞核中通过免疫组织化学检测到 AR。此外，发现它们在高草酸尿症患者的肾小管上皮细胞中上调，这表明雄激素/AR 轴增强在肾结石形成中的重要作用。然而，这项研究存在样本量小的一些局限性，AR 的详细机制尚未完全阐明。

从临床角度来看，知道结石形成的复发风险约为 50% [ 16 ]，因此需要进行一项试验来寻找分子和遗传差异以及它们是否在结石复发中起作用。这可能会对减少结石复发的尝试产生临床影响。

据我们所知，这项前瞻性试验是第一个比较新发结石形成者和复发性结石形成者之间性激素差异的试验，也是第一个研究结石中 AR 与 miRNA 和 CSF-1 基因表达之间关系的试验以前的病人。此外，它包含的样本量大于以往任何其他研究。

在目前的研究中，与对照组相比，SFG 中的 AR 和 miRNA 显着升高，CSF-1 显着降低。这些结果与先前的 [ 12 ] 动物研究结果一致。然而，在血液雄激素水平方面，两组之间没有差异。有趣的是，在目前的研究中，SFG 的血浆雌二醇水平更高，但这可以解释为睾酮代谢途径中睾酮向雌二醇的转化率更高。然而，这一较高水平似乎不足以对男性发挥结石抑制作用 [ 13 ]。

尽管如此，新发结石形成者和复发性结石形成者在所有研究参数方面都没有差异。需要进一步的研究来寻找这些发现的临床效用。

总之，发现 CaOx 肾结石与 AR 和 miRNA 的基因表达呈正相关，与 CSF-1 呈负相关。然而，肾钙结石的复发与性激素水平及其相关分子通路的变化无关。

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