精准前沿 | 基于血液cfDNA全基因组片段化特征对肝癌进行筛查

本期《精准前沿》栏目分享美国约翰霍普金斯大学医学Victor E. Velculescu研究团队发表于Cancer Discovery（IF=38.27）上的一篇研究[1]，研究利用基于血液cfDNA全基因组片段化特征—DELFI（DNA evaluation of fragments for early interception）的方法，为肝癌的无创筛查提供了一种准确、高效且具有成本效益的选择方案。

研究背景

肝癌的发病率和死亡率在所有癌症中位居前列，全球每年新增肝癌患者超过90万例，因肝癌死亡的人数超过80万例。90%的肝癌病例是肝细胞癌（HCC），生存率高度依赖于疾病诊断时的病理分期。局部转移患者（占患者总数的44%）的5年生存率为34%，区域转移患者（占患者总数的27%）的5年生存率为12%，远端转移患者（占患者总数的18%）的5年生存率为3%。全世界目前有3.5亿的慢性肝炎患者和5000万的肝硬化患者，高达三分之一的肝硬化患者和25%-40%的HBV患者会发展为HCC。目前 常用的肝癌高危人群筛查手段有腹部超声和/或甲胎蛋白（AFP），敏感性为47%-84%，特异性为67%-90%。因此，亟待开发一种具有可及性且高灵敏度的HCC筛查方法。  

研究设计

本研究共纳入501例受试者的血浆样本，包括75例HCC患者和426例非肝癌受试者。426例非肝癌受试者中包括133例HCC高风险患者（因各种原因引起的肝硬化或病毒性肝炎）。前瞻性收集来自约翰霍普金斯医院的处于不同癌症分期的HCC患者和高危人群的血液样本，其余健康对照样本来自美国其他医院或欧盟医院（US/EU队列）。每名受试者分离0.5-5mL血浆，构建基因组文库并对cfDNA片段进行低深度全基因组测序（~2.6X coverage）。

此外，本文来还纳入223例来自香港的受试者作为独立验证队列（香港队列）。香港队列包括90例可手术切除的早期HCC患者（BCLC-A期85例，BCLC-B期5例），35例肝硬化患者和32例无肝脏疾病的健康受试者。

研究结果

1. 染色质结构决定全基因组cfDNA片段化特征

本文使用DELFI方法共评估了473个非重叠5 Mb区间的片段化特征，每个区间包括约8万个片段，跨越近2.4 Gb的基因组区域[2]。非肝癌受试者间的cfDNA片段化特征一致，HCC患者间的cfDNA片段化特征差异较大（图1A），肝硬化患者的片段化特征更加接近于无肝脏疾病的非肝癌受试者而非HCC患者（图1A），病毒性肝炎患者的片段化特征与无肝脏疾病的非肝癌受试者几乎相同（图1A）。

为了研究cfDNA片段化模式的起源，本研究将全基因组片段化特征与使用高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术分析的开放（A）和闭合（B）隔室进行比较。研究者发现健康受试者的cfDNA模式和人类淋巴母细胞高度相关（图1B）。分析来自10例高ctDNA水平的HCC患者的cfDNA特征表明，其A/B隔室特征与肝癌组织样本的A/B隔室特征相似；非肝癌受试者的A/B隔室特征与淋巴母细胞的A/B隔室特征更加接近（图1B和C）。上述分析表明，HCC患者的cfDNA片段化特征是外周血和肝癌染色质隔室cfDNA特征的混合。

图1. 全基因组cfDNA片段化特征反映染色质结构

2. 根据cfDNA片段化特征推测疾病特异性转录因子

本研究分析了cfDNA片段化特征是否可以反映肝癌中转录因子（TF）结合DNA的改变引起的变化。为了确定全部已知TF的DNA结合位点，作者分析了来自ReMap 2020数据库的5620个ChIP-seq实验结果。比较HCC患者和非HCC个体的TF，以确定在全基因组cfDNA TF结合处覆盖率差异最大和最小的TF（图2A和B）。使用基因疾病关联数据库DisGeNET进行基因集富集分析，分析结果表明HCC患者和非HCC个体间cfDNA TF结合覆盖率差异与肝癌和其他癌症相关（图2C和D）。对该研究团队之前发表的LUCAS肺癌队列的数据进行类似分析，揭示TF结合位点覆盖率的差异增加与肺癌相关（图2C和E）。上述结果表明，肝癌和其他癌症患者的cfDNA片段化特征变化是由于肿瘤细胞中存在大量的转录谱改变导致的。

图2. HCC患者的片段化特征突出肝癌特异性TF

3. cfDNA片段化特征揭示基因组变化

由于cfDNA片段组特征可能包含由肿瘤细胞释放的相关的大规模基因组变异，本文研究了患者血液中的染色体扩增和缺失。除了在肝癌患者中观察到染色质和TF改变导致的全基因组片段化特征（图3A），分析还揭示了染色体臂的改变。HCC cfDNA染色体臂的变异与TCGA数据库肝癌组织样本（n=372，图3B）相似，均表现为1q, 7p, 7q和8q扩增，及4q, 8p, 9p, 13q和21q缺失。染色体臂变异只在HCC患者中观察到，肝硬化、慢性肝炎和健康受试者未观察到此现象（图3B）。

图3. 肝癌患者cfDNA全基因组片段化特征和TFBS特征的改变（图A）及染色体臂变异（图B）

4.DELFI模型用于肝癌筛查

鉴于肝癌基因组和染色质变化与cfDNA片段化特征之间的直接联系，本研究使用机器学习方法确定cfDNA片段化特征的改变是否可以区分HCC患者和非肝癌患者。通过10次5折交叉验证，对每名受试者产生一个分数值（DELFI score）来确定该分类器在美国/欧盟队列中的性能。该模型包括cfDNA片段化特征和染色体长短臂特征(图4A)。

接下来研究者在肝癌高危人群中研究了DELFI score与受试者是否为肝癌及肝癌分期之间的关系。133例非肝癌受试者的DELFI score较低，病毒性肝炎和肝硬化患者的DELFI score中位数分别为0.078和0.080（图4B）。相比之下，75例处于不同BCLC分期的HCC患者DELFI score的中位值显著增高（Wilcoxon秩和检验，P<0.01），BCLC-0期、A期、B期和C期的DELFI score中位值分别为0.46、0.61、0.83和0.92（图4B）。DEILFI模型在高危人群中筛查HCC患者的AUC为0.90（95% CI，0.86-0.94）(图4C)。模型对于早期HCC患者的检出性能稳健，BCLC-0期和A期的AUC分别为0.90和0.81，晚期HCC患者（BCLC-C期）几乎全部被检测到（AUC>0.97；图4D）。

研究者进一步将DELFI模型适用范围扩展到低风险人群，检验DELFI模型区分肝癌和无肝炎或肝硬化的普通人群（n=293）的性能。在原有的DELFI模型中增加TFBS特征（图4A），模型的性能较高（AUC=0.98）（图4C）。对于平均风险人群设置模型阈值，在98%的特异性下评估模型性能，模型的总体灵敏度为88%，全部癌症分期的灵敏度都在75%以上（图4D）。

图4. DELFI模型在欧美人群中的肝癌筛查性能

5. DELFI模型在东亚人群外部验证集的性能

除了对美国/欧盟队列进行交叉验证分析，研究者还在包括223例受试者的香港队列中检验了DELFI模型的性能。香港队列包括90例可手术切除的早期HCC患者（BCLC-A期85例，B期5例）和101例肝硬化或HBV感染患者。香港队列与欧盟队列相比，使用的测序仪器不同（HiSeq 2000 vs. Novaseq; 76-bp vs. 100-bp read length），建库方法不同，建库的PCR循环数更多（14 vs. 4轮PCR）。病毒性肝炎患者、肝硬化患者和健康受试者的全基因组片段化特征高度一致，HCC患者的片段化特征变化较大（图5A）。DELFI模型在香港验证队列中区分HCC患者和高危人群的AUC为0.97（图5B）。这些结果表明，DELFI模型是一种检测HCC的可靠方法，适用于不同的高危人群。

图5. DELFI模型在东亚人群中的肝癌筛查性能

6. DELFI模型在人口规模的性能模拟

为了评估DELFI模型对于肝癌高危患者的监测和检测性能，研究者使用蒙特卡洛模拟评估DELFI模型在10万理论高危人群中的性能。考虑到早期肝癌检测的重要性，研究者重点关注DELFI模型对于BCLC-0/A期的检测性能，将DELFI方法与现有指南推荐的腹部超声联合AFP的检测方法进行比较。尽管指南推荐，但在美国HCC检测的依从性很低，最高不超过39%，10万理论人群中平均有40,042名受试者（95% CI, 21,320–61,890）接受筛查。由于血液筛查的可及性和依从性较高，文献报道的依从率为80%-90%，保守假设平均75%的人群（95% CI, 60%–90%）会使用DELFI方法进行肝癌筛查。蒙特卡洛模拟结果表明腹部超声联合AFP平均检出2，233例肝癌患者（95% CI, 1,088–3,699）。使用DELFI，能够平均额外检出2,794例肝癌患者，或与腹部超声联合AFP相比肝癌检出人数有2.46倍的增加（95% CI, 1.25–4.57倍增加）（图6A和B）。DELFI方法不仅会极大提高肝癌的检出率，同时有望降低肝癌检测的假阴性率或癌症漏检率（超声联合APF的FNR为38%，DELFI的FNR降至24%）。此外DELFI方法的NPV也有望从超声联合APF的95.7%增加至97.1%（图6C和D）。这些分析结果表明，使用高特异性的基于血液的肝癌早期筛查方法具有显著的人群获益。

图6. DELFI模型在肝癌筛查中的模拟应用

讨论

虽然本研究的方法对目前肝癌筛查有所改进，但也有一些局限性。例如，本研究纳入的HCC患者样本量相对较小。尽管香港独立验证队列和欧美队列在文库构建和测序方法上存在差异，但DELFI模型在独立验证队列中性能表现良好，说明该方法能够在不同的诊断实验室中使用。DELFI模型在临床应用前，还需要更大规模的验证研究。

结语

本研究的结果表明，使用cfDNA全基因组片段化特征具有高灵敏度和特异性。DELFI模型即使对于非常早期的肝癌，也具有稳健的检出性能。本文是首次将全基因组片段化特征在不同种族的高风险人群中进行独立验证，模型性能在欧美队列和香港队列中均表现稳定和强劲。此外，本研究在DELFI模型中加入TFBS特征可以进一步改善HCC的筛查性能。

END 

参考文献：

[1] Foda, Z. H. et al. Detecting Liver Cancer Using Cell-Free DNA Fragmentomes. Cancer Discovery 13, 616-631, doi:10.1158/2159-8290.Cd-22-0659 (2023).

[2] Mathios, D. et al. Detection and characterization of lung cancer using cell-free DNA fragmentomes. Nature Communications 12, doi:10.1038/s41467-021-24994-w (2021). 

撰写丨无言

编辑、排版丨SX

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