FLT3是iPSC-NK分化的关键细胞因子

扩增方法是异体来源NK细胞疗法开发的重点环节之一，扩增规模、扩增速度和安全监管都需要兼顾。

Shoreline Bioscience和加州大学圣地亚哥分校再生医学系医学系的研究人员将在ASH2022上通过口头报道展示其研发的一种通过细胞因子诱导克隆主iPSC系生产cGMP级NK细胞的方法，能保证其一致性、生产高效性、高纯度。这种方法不需要细胞分选或使用鼠源性基质细胞。

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作为产生临床疗效的可能必要条件，大多数NK细胞的临床试验需要大量CD3- CD56+ NK细胞进行输注，数量范围从5×10^6到1×10^8个/公斤体重不等。

据该口头报告称，使用这种新方法能够扩增8000倍以上，通过1x10^6个未分化的iPSCs最终可生产1x10^12个功能性完整的NK细胞。这种生产规模可以通过一次cGMP生产活动提供超过200份临床剂量。

细胞因子诱导iPSC-NK细胞方法进展

NK细胞的扩增方法都可以分为基于供血细胞的系统或无供血细胞的系统。细胞因子是最早也是最广泛被用于激活NK细胞的无基质细胞法。

例如：

IL-15：已替代IL-2成为可单独使用的NK刺激剂。IL-15刺激NK细胞增殖、免疫刺激受体表达和细胞毒性，且不诱导Treg的激活和增殖。然而，持续的IL-15信号转导会导致NK细胞衰竭和体外和体内疗效的丧失。

IL-21：单独使用不足以刺激NK细胞显著增殖，但与其他细胞因子一起使用时存在协同增殖效应。

IL-18和IL-27与IL-15结合可促进NK细胞倍增。

IL-12、IL-15和IL-18的组合驱动记忆样NK细胞的优先扩张，增加了在二次挑战时产生免疫刺激细胞因子的能力。

2013年，David A Knorr团队在基质细胞上使用IL-3、IL-7、IL-5、干细胞因子(SCF)、fms样酪氨酸激酶受体-3配体(FLT3L)从几种不同的hESC和iPSC系中生产出成熟的功能性NK细胞。不过其原始干细胞数量仅为2.5x10^5个。

相对iPSC，hESC则需要预先进行单细胞适应，例如CD34+CD45+细胞分选。该步骤通常花费数月。

2019年，HuangZhu和DanS.Kaufman通过使小鼠胚胎成纤维细胞依赖性hESC/hiPSC适应无基质细胞的培养条件，直接用来形成胚胎体(EB)，在EB中产生血液内皮前体细胞作为自基质细胞。该方法被选入《Methods in Molecular Biology》丛书中的《In Vitro Differentiation of T-Cells》(MIMB，第2048卷)。

此前，该团队已尝试在体外hESC/hiPSC通过单细胞分选和IL-21的两步培养对NK细胞进行临床规模的培养和扩增。

HuangZhu和DanS.Kaufman同样是此次ASH口头报告的作者之一。因此该方法应当是在2019年方案上的进一步改良。

所用的细胞因子对比：

第一步形成EB：

2019方案：SCF、BMP-4、VEGF、ROCKi (RHO激酶抑制剂)的APEL培养基

shoreline：SCF、BMP-4、VEGF、FLT-3(FMS样酪氨酸激酶受体-3)

第二步扩增NK细胞：(相同)

2019方案：IL-3，IL-15，IL-7和SCF

shoreline：IL-3，IL-15，IL-7和SCF

FLT3是RTK家族的成员，靶向多种细胞类型，包括造血干细胞、B细胞、T细胞、DC和NK细胞。

在TME中，NK细胞还通过分泌其配体FLT3L达到直接杀伤之外的抗肿瘤作用。该作用需要IL-2的激活。

FLT3L和其他因子共用可刺激造血多能祖细胞的分化和增殖，并促进树突细胞及其亚群的增殖。

也曾出现在最初的无基质细胞培养法中。

RHO激酶抑制剂则

Rocki能抑制肿瘤细胞张力纤维的收缩和细胞侵袭；

在其他疾病的治疗中表达出对角质细胞、小梁网细胞、牙周韧带干细胞等的增殖作用；

Rock-mDC轴可能与CD1d限制性不变自然杀伤T(iNKT)细胞有关，是恢复CML患者免疫监视的新潜在靶点；

二者相对而言，FLT3更侧重于“分化”的部分，与NK细胞关系密切。

或许说明，在用于增殖的细胞因子组合已经调配合适的情况下，FLT3能更高效地满足NK细胞从干细胞分化而来的效果，从而一方面提高后续增殖的响应比例，一方面提高目标NK细胞的抗肿瘤活性。

据报告称，用这种方法生产的NK细胞

表达CD56+和NKG2D、NKp44、NKp46、DNAM-1等NK细胞经典表型；

与从健康供体分离的外周血来源的NK细胞相比，产生更高水平的IFNγ和TNFα，抗肿瘤活性更高。

其使用的iPSC系是经过基因工程敲除CISH基因，CISH是NK细胞激活的关键细胞内检查点。在标准细胞毒性试验中与未修改的NK细胞相比，使用这种优化方法生产的CISH KO NK细胞对多种液体和固体肿瘤细胞系显示出明显更好的抗肿瘤活性。

图源：参考资料1

小结

虽然脐带血来源(UCB)和外周血来源(PB)的同种异体NK或CAR-NK细胞疗法也已经有不少临床进展。不过就生产而言，在现有的NK癌细胞系中，只有NK-92细胞系在多种肿瘤中显示出抗肿瘤活性，并在临床前研究中表现良好。

NK-92细胞系也可以进行cGMP生产，但其CAR改造效率为4%-95%，放大时有难度。并且NK-92癌细胞系在输注前需要照射，增加步骤和安全性风险。因此开发能够满足cGMP大规模生产的iPSC来源NK细胞依然是有需求的。

不同来源NK细胞优劣

Front Immunol. 2021 Dec 1;12:732135.

参考资料：

1.https://ash.confex.com/ash/2022/webprogram/Paper163871.html

2.Heipertz EL, Zynda ER, Stav-Noraas TE, Hungler AD, Boucher SE, Kaur N, Vemuri MC. Current Perspectives on "Off-The-Shelf" Allogeneic NK and CAR-NK Cell Therapies. Front Immunol. 2021 Dec 1;12:732135. doi: 10.3389/fimmu.2021.732135. PMID: 34925314; PMCID: PMC8671166.

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来源：闲谈 Immunology 2022-12-09

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