新的肿瘤免疫治疗靶点：LAG-3

导读：在过去的十几年中，T细胞免疫检查点的发现以及CTLA-4和PD-1/PD-L1单克隆抗体抑制剂的开发彻底开启了肿瘤免疫治疗的大门。然而，由于肿瘤抵抗、缺乏肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和抑制性髓系细胞的存在，只有一小部分患者表现出长期，持久的反应。单独或联合使用均可显著提高生存率，但联合使用时也伴有严重毒性。此外，免疫相关不良事件（IRAE）的发生和获得性耐药也是巨大的障碍。因此，我们迫切需要寻找新的免疫检查点来解决这些问题。

背景知识

在慢性抗原刺激或炎症环境下，共抑制受体(IR)，如程序性死亡-1 (PD1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 (CTLA4)，在T细胞表面上调，并限制组织损伤和自身免疫介导的宿主反应。重要的是，这种IRs在抑制自身免疫方面发挥着重要作用，但反过来，这种免疫调节可以限制病毒清除和抑制抗肿瘤免疫。这些IRs在CD4+和CD8+T细胞表面的表达反映出了T细胞的耗竭表型。癌症免疫疗法就是拮抗IRs与其同源配体之间的相互作用，以逆转这种耗竭状态并重新激活抗肿瘤免疫反应。FDA批准的第三种免疫检查点抑制剂就是以LAG3为靶点的药物。在长期抗原刺激的环境中，如慢性病毒感染或癌症，LAG3也是一种在激活的CD4+和CD8+T细胞上表达的共抑制受体。目前来看，淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）已成为癌症治疗中最有前景和潜力的靶点之一。图1提供了通过FDA批准的LAG3的发现和临床开发时间表。

图1 LAG3的发展时间表

LAG3的作用机制

LAG3的表达模式及临床意义

与PD-1和CTLA-4一样，LAG-3在naive T细胞上不表达，但在抗原刺激下可在CD4+和CD8+T细胞上诱导表达。LAG-3的表达可以限制激活T细胞,防止自身免疫。然而，由于肿瘤内持续的抗原刺激，LAG3和其他IRs(包括PD1, TIM3和TIGIT)的持续表达导致T细胞功能障碍。LAG3也在CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)上表达,它可以控制T细胞扩张和抑制Treg本身的活性。然而，黑色素瘤和结直肠癌患者外周血、肿瘤相关淋巴结和肿瘤本身Treg上的LAG3表达与免疫抑制细胞因子(IL10, TGFb)的产生有关。除了CD4+和CD8+T细胞,人们还在γδT细胞、自然杀伤T细胞,浆细胞样树突细胞(pDC),和活化的B细胞上发现LAG3,但目前尚不清楚LAG3表达如何对这些细胞群体发挥抗肿瘤作用。另外，LAG3的表达受遗传、表观遗传、细胞表面裂解和胞内运输等多个水平的控制。

LAG3的结构和配体

Lag3基因由8个外显子组成，其染色体位置与第12号染色体远端CD4基因相邻，具有类似的内含子-外显子组织，可能是由于基因复制事件进化而来。LAG-3是一种Ⅰ型跨膜蛋白，具有四个Ig样结构域，称为结构域1到结构域4（D1-D4）。大约30个氨基酸的附加序列位于C和V链之间，形成一个环。但在CD4中观察不到这个环。生物化学分析表明，LAG3可以在细胞表面以单体、二聚体和高阶低聚体的形式表达，与配体无关。由于与CD4在结构上的同源性，LAG3的典型配体是MHC II类分子，图2也描述过LAG3的其他配体）。其他配体也可以通过聚糖与LAG3发生相互作用，包括半乳糖凝集素-3 (Gal-3)和肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)，它们都是具有carbohydrate-recognition识别域的凝集素。Gal-3是一种可溶性半乳糖结合凝集素，由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞分泌。LSECtin在肝脏中表达，但在黑色素瘤细胞表面也发现了LSECtin与LAG3的结合可以通过抗原特异性效应T细胞抑制IFNγ的产生。纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)由肝脏中的肝细胞分泌，在肿瘤中高度上调，也被认为是具有免疫抑制活性的LAG3配体。

图2 LAG3配体/受体的相互作用

LAG3信号传导和抑制功能

许多免疫IRs(检查点)，如CTLA4、PD1和TIM3，通过胞质抑制域(如免疫受体酪氨酸基抑制基序或免疫受体酪氨酸基开关基序)抑制T细胞活化，但这些在LAG3细胞内域并不存在。LAG3在细胞质尾部拥有三个保守区域:(i)一个“KIEELE”motif， (ii)一个酸性谷氨酸-脯氨酸(EP)重复序列，和(iii)一个保守的假性丝氨酸磷酸化位点(图2）。“KIEELE”motif已被证明是LAG3抑制T细胞杂交瘤活性所必需的。最近对LAG3突变体的研究表明，细胞质尾部的EP基序，特别是高度保守和重复的谷氨酸残基，是p56lck与CD4或CD8共受体分离的原因，从而中断协同受体介导的信号传导。虽然许多配体可能参与触发LAG3信号，这种信号在T细胞中的结果导致T细胞增殖和功能的减少。总的来说，配体与T细胞表面表达的LAG3结合会导致增殖抑制和T细胞效应功能的丧失。

可溶性LAG3作为生物标志物

虽然体外和体内研究都没有发现sLAG3与跨膜对应的功能，但患者血清中的sLAG3是几种恶性肿瘤预后的指标。虽然LAG3从T细胞表面脱落，但pDCs是体内sLAG3水平的主要来源，这使得我们需要进一步的研究来更好地理解LAG3在pDC上的作用。无论体内sLAG3的来源如何，通过增强ADAM10/17的活性可以促进LAG3的脱落活性，这可能会破坏LAG3介导的细胞内信号通路来增强T细胞功能

LAG3的临床意义

LAG3-Ig激动剂作为APC激活剂

LAG3的二聚体、重组、可溶形式被称为eftiLAGmod α，这是第一个进入临床的一类药物。eftiLAGmod α由四个与人-IgG1-Fc部分融合的LAG3胞外结构域组成，该制剂被临床开发为激活抗原提呈细胞(APC)的免疫佐剂。eftiLAGmod α的治疗的基本原理是通过可溶性LAG3-Ig融合蛋白直接刺激DCs上调共刺激分子并产生IL12和TNFα，在eftiLAGimod α联合紫杉醇治疗HR-阳性的转移性乳腺癌研究中，数据表明该联合用药耐受性良好，不良事件可控。eftiLAGmod α联合pembrolizumab(抗pd1)也在一项IIb期研究中启动，用于PDL1阳性的HNSCC和NSCLC患者。

抗PD1和抗LAG3阻断的原理

LAG3对CD8+ T细胞的抑制作用与PD1或CTLA4不同，这为阻断多个IRs提供了理论依据。PD1的信号通路表明，与TCR相比，PD1与PDL1结合后，共刺激受体CD28的去磷酸化程度更高。因此，与直接通过TCR驱动T细胞增殖的信号调节相反，PD1阻断可能通过驱动联合信号通路来重新激活T细胞。同样，CTLA4通过CD28辅受体的信号通路来降低T细胞活化。CTLA4也可能直接从APC中去除CD80/CD86。因此，阻断PD1和CTLA4可能导致不同亚群的T细胞扩增。此外，已有研究表明，LAG3也可能介导向APC的双向抑制信号。所以，LAG3可能通过减少TCR的信号传导来限制T细胞的激活。由于LAG3独特的机制，LAG3与PD1结合可能会增强抗肿瘤免疫，且毒性较小。

LAG3的单克隆抗体阻断药物

随着靶向PD1/PDL1的成功，临床试验开始从单一治疗转向联合免疫调节剂。这样做的原因是阻断单一的免疫调节IR不足以挽救CD8+T细胞的功能，而靶向多种共抑制途径将可以更有效地逆转肿瘤微环境中免疫衰竭。但是，由于LAG3的拮抗性阻断可以增强CD8+ T细胞功能，许多单克隆抗体已经被开发出来。目前为止，单克隆抗体治疗各种实体和血液类型肿瘤的临床试验已经取得进展。这些早期结果表明，与阻断抗CTLA4 /PD1相比，抗LAG3 /PD1治疗的毒性显著降低且疗效相似。

靶向LAG3的双特异性药物

除了单克隆抗体，几种双特异性药物也在临床开发中，这些药物以LAG3与抗PD1，或LAG3与PDL1为靶点。FS118是一种针对LAG3和PDL1的双检查点抑制剂，在临床前试验中被证明可以清除MC38(小鼠结肠癌细胞)，现在已经进入了一项I期临床研究，研究对象是一组之前对抗PD1单药治疗产生耐药性的患者。另一种被称为tebotelimab的PD1-LAG3双特异性试剂已经通过DART平台产生，tebotelimab的早期结果已经证明了其抗肿瘤的活性和可耐受的安全性。我们非常期待这些双特异性药物的进一步临床结果，以确定这些药物是否比拮抗单抗的联合治疗更有效。

思路扩展

LAG-3可预测患者是否能从ICB获益

癌症的免疫治疗让医生和患者都充满了希望。免疫检查点抑制剂的使用使患者平均生存期明显延长，治疗总体有效率也大幅提高。但我们仍然无法预测哪些人会从这些药物中受益，哪些人不会。研究人员发现血液中免疫细胞表面上标志物的特定模式或者说“signature”可能是免疫疗法反应的生物标志物。在这种免疫signature中，LAG-3分子可以识别预后较差的患者。

在一项新的研究中1，作者为了确定ICB治疗患者的临床结果与血液相关的因素。作者使用多参数流式细胞术对188例接受ICB治疗的黑色素瘤患者进行免疫分析，以表征预处理后外周血中的免疫细胞。作者确定了三种不同的免疫表型。其中，LAG+免疫型黑色素瘤患者ICB后预后较差，其中位生存期为22.2个月，而LAG-免疫型黑色素瘤患者中位生存期为75.8个月(P = 0.031)。94例接受icb治疗的尿路上皮癌患者的独立队列被用于验证，其中LAG+免疫型与缓解、生存和无进展生存显著相关。多因素Cox回归和分层分析进一步表明，与已知的临床预后标记物和ICB、PD-L1和肿瘤突变负担的临床活性标记物相比，LAG+免疫型是预后的独立标记物。预处理后的外周血LAG+免疫型可检测出不能从ICB获益的患者。

图3 文章研究概述

LAG-3与抗肿瘤疫苗

在肿瘤治疗中，免疫治疗已经成为继外科手术、放疗、化疗之后又一种具有临床疗效的抗肿瘤疗法。作为肿瘤免疫治疗的重要组成部分和研究热点，肿瘤疫苗产生的特异性肿瘤效应强，安全性较高，并能产生持续诱导免疫系统而发挥持久的抗肿瘤作用。研究表明，通过接种肿瘤疫苗可以预防和治疗肿瘤。目前已上市肿瘤疫苗的适应证有黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、颅内肿瘤、宫颈癌等。同时阻断不同检查点受体，尤其是PD-1和CTLA-4，对某些类型的肿瘤具有更强的抗肿瘤活性，而联合使用不同检查点受体抑制剂是临床研究的一个活跃领域。那么作为新一代的免疫检查点抑制剂和抗肿瘤疫苗之间能擦出什么火花呢？

在最新的研究中2，作者想要确定联合检查点阻断是否能进一步改善抗肿瘤疫苗接种。利用表达ova的小鼠肿瘤模型，作者发现CD8+T细胞在APC的存在下被激活，并表达多个检查点受体;然而，没有APC激活的T细胞单独表达LAG-3，这表明LAG-3可能是联合接种疫苗的首选靶点。利用三种不同的小鼠肿瘤模型，以及针对三种肿瘤抗原的多肽或DNA疫苗，作者评估了阻断PD-1和/或LAG-3的疫苗对肿瘤生长的影响。作者的结果表明，在每个模型中，PD-1和/或LAG-3阻断能提高疫苗的抗肿瘤疗效。然而，在MycCaP前列腺癌模型中，PD-1和LAG-3的联合阻断与疫苗联合时产生了最大的抗肿瘤效果，而PD-1单独阻断与靶向“自身”肿瘤抗原的疫苗接种的效果较差。这些结果表明，抗肿瘤疫苗可能最好结合同时阻断PD-1和LAG-3，以及的其他检查点受体。

图4 阻断PD-1或LAG-3可以提高活化的CD8+T细胞的抗肿瘤活性

LAG联合甲基化修饰

表观修饰一直是研究的热点，甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。然而，在表观遗传水平上，LAG3在癌症中的调控上仍然是未知的，可能涉及DNA甲基化。DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，涉及许多基本的生物学过程，即分化(包括T细胞分化)、X染色体失活和印迹。

甲基化已被证明可以调节PD-1和PD- L1在各种恶性肿瘤中的表达。因此，在下文中3，作者就假设LAG3的表达也可能通过DNA甲基化受到表观遗传学的调控，并且作者在TCGA的533例KIRC患者和160例正常相邻组织样本中证明LAG3甲基化水平与转录活性、免疫细胞浸润和总生存期相关。此外，作者还分析了外周血单个核细胞(PBMCs)和KIRC细胞系中LAG3的甲基化，通过免疫组化和PCR验证了独立KIRC队列中LAG3表达、免疫细胞浸润、生存和甲基化之间的相关性。总之，作者的数据表明，LAG3在肿瘤和免疫细胞中的表达是通过DNA甲基化的表观遗传调控。LAG3的表达和甲基化与与临床病程和免疫原性相关。

图5 LAG3甲基化位点分析概况及基因组组织

全文总结：

检查点免疫疗法彻底改变了癌症治疗，而LAG-3作为新一代发现的抑制性检查点，有望成为肿瘤治疗中极具前景的靶点。然而，我们对LAG-3的理解仍然非常有限，许多基本问题仍然没有得到解答。LAG-3的信号转导机制尚不清楚，其配体也很复杂。我们还需要研究LAG-3和其他共受体的功能差异、冗余和协同作用。通过本文更详细地阐明LAG-3的功能特性4，我们才可以合理地设计出关于LAG-3靶点的各种课题。

参考文献：

1.Shen, R. et al. LAG-3 expression on peripheral blood cells identifies patients with poorer outcomes after immune checkpoint blockade. Sci Transl Med 13, doi:10.1126/scitranslmed.abf5107 (2021).

2.Zahm, C. D., Moseman, J. E., Delmastro, L. E. & D, G. M. PD-1 and LAG-3 blockade improve anti-tumor vaccine efficacy. Oncoimmunology 10, 1912892, doi:10.1080/2162402X.2021.1912892 (2021).

3.Klumper, N. et al. LAG3 (LAG-3, CD223) DNA methylation correlates with LAG3 expression by tumor and immune cells, immune cell infiltration, and overall survival in clear cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer 8, doi:10.1136/jitc-2020-000552 (2020).

4.Andrews, L. P. et al. Molecular Pathways and Mechanisms of LAG-3 in Cancer Therapy. Clin Cancer Res, doi:10.1158/1078-0432.CCR-21-2390 (2022).

转自： 生物制品圈 2023-04-09

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