SARS-CoV-2死亡患者尸检揭示病毒在全身及大脑的感染及持久定居

本文由“瑞金麻醉与围术期医学”授权转载

COVID-19是感染SARS-CoV-2病毒引起的呼吸系统和非呼吸系统疾病，危重病人可出现多器官功能障碍和休克。尽管早期的尸检研究已经证实SARS-CoV-2病毒可以感染人体的多种组织器官，但往往缺乏病毒介导的肺外器官的损伤或炎症的组织病理学证据。因此，为了更深入地了解SARS-CoV-2病毒在人体内的细胞亲嗜性、复制能力、持久性和演变特征，并在受感染组织中寻找该病毒感染相关的组织病理学证据，来自美国国立卫生研究院（NIH）的Daniel S. Chertow团队对44例感染过新冠的死亡患者展开了全面的尸检，该项研究成果发表于2022年12月14日的Nature杂志上。

研究队列

研究团队选择了2020年4月26日至2021年3月2日期间未接种疫苗的、患COVID-19死亡的44名患者进行尸检（图1），并对其中11例进行脑组织取样。44例死亡患者中，42例于死亡前、2例于死亡后PCR确认 SARS-CoV-2阳性；共有38例患者血浆SARS-CoV-2检测呈阳性，3例血浆检测呈阴性，3例无法获得血浆。30%的患者为女性，中位年龄为62.5岁。61.4%的患者有三种或三种以上合并症，患者从发病到住院和随后死亡的中位时间间隔分别为6天和18.5天，死亡后进行尸检的中位时间间隔为 22.2 小时。

图1. 感染过COVID-19的44例死亡患者尸检时间（2020年3月19日-2021年3月19日） 

主要研究方法

研究团队采用微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）检测并定量SARS-CoV-2核衣壳基因，并采用原位杂交（ISH）验证ddPCR 结果，以确定该病毒的细胞亲嗜性；利用免疫荧光（IF）和显色免疫组化（IHC）进一步验证大脑内是否存在SARS-CoV-2病毒；采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测亚基因组RNA，这是病毒近期复制的标志。进一步，作者利用高通量单基因组扩增和测序（HT-SGS）方法分析了来自6例个体总共46个组织的SARS-CoV-2刺突基因变异序列。

研究结果

1.    SARS-CoV-2病毒广泛感染及持续存在

研究团队根据患者病程时长（即从患病到死亡的时间）将尸检病例分为早期（≤14天）、（中期15-30天）和晚期（≥31天）。在84个不同的解剖位置和体液中均检测到SARS-CoV-2 RNA，并且与非呼吸道组织相比，在早期、中期和晚期的呼吸道组织中检测到的病毒载量更高，但是呼吸道组织的病毒载量下降速度远快于非呼吸道组织。在所有晚期病例中，虽然在血浆中检测不到SARS-CoV-2 RNA，但在多个组织中都检测到了该病毒RNA的持续存在。在10/11例（90.9%）中枢神经系统(CNS)组织中检测到SARS-CoV-2 RNA，包括5/6晚期病例的多数脑区，其中编号为P42的死者其死亡距发病时间长达230天。研究者在所有组织类型和多种体液类型（包括血浆、胸腔积液和玻璃体）中检测到SARS-CoV-2的亚基因组RNA。除了呼吸道，研究人员还在早期病例的心脏、淋巴结、胃肠道、肾上腺和眼睛等不同组织中分离出可在体外培养的Vero E6细胞中增殖的SARS-CoV-2病毒，即活的病毒。在55个用于检测活病毒的样本中，有25个（45%）样本分离出病毒。上述研究结果提示SARS-CoV-2感染的广泛性和持续性。（图2）

图2. SARS-CoV-2 在人体和大脑中的分布、量化分析和复制特征。（顶部横排为代表性病例编号，纵列为不同的受累器官/组织，底部横排为从感染到死亡的间隔天数，颜色代表病毒RNA载量）

2.新冠病毒基因组测序

作者利用高通量单基因组扩增和测序（HT-SGS）方法分析了来自6例个体的总共46个组织的SARS-CoV-2刺突基因变异序列。许多组织中的病毒序列是相同的，但在部分组织中出现变体，例如在其中一例（编号P27）的非呼吸道部位（左、右心室和纵隔淋巴结）检测到包含同义突变的两种病毒单倍型。

3. 原位杂交揭示SARS-CoV-2的细胞亲嗜性

研究者在选定的早期、中期和晚期病例中，通过原位杂交（ISH）验证了呼吸道和非呼吸道组织中SARS-CoV-2 刺突RNA（编码病毒表面刺突蛋白）的微滴数字聚合酶链反应（ddPCR）结果（图3），涉及超过 35 种细胞类型和透明膜。并且，每纳克RNA的SARS-CoV-2 N基因（编码病毒核衣壳蛋白）的平均拷贝数与该病毒刺突RNA阳性细胞的中位数显著相关。

图3. 肺外组织中SARS-CoV-2的RNA原位检测

4. 中枢神经系统中SARS-CoV-2 N基因及蛋白的分布

为了进一步验证SARS-CoV-2在中枢神经系统中的分布，研究者开展了针对N基因（编码病毒核衣壳蛋白）的原位杂交分析，以及针对N蛋白的免疫荧光和显色免疫组化分析。在早期病例（编号P38）的下丘脑和小脑以及晚期病例（编号P40和P42）的颈髓和基底神经节中均能观察到SARS-CoV-2 RNA和蛋白，这与神经元染色结果相一致。（图4）

图4. SARS-CoV-2蛋白和RNA在人中枢神经系统组织中的表达

5. COVID-19的组织学发现

研究团队在本研究队列中的组织病理学发现与其他病例中报告的结果相似。在 44 例病例中，有38例确诊死于 COVID-19，其中35例 (92.1%) 在死亡时患有急性肺炎或弥漫性肺泡损伤。10例(23%)出现肺栓塞并发症，4例存在心肌浸润，包括1例实质性心肌炎。在淋巴结和脾脏中，他们观察到淋巴细胞耗竭以及淋巴滤泡和副皮质增生。其他非呼吸系统的组织学变化，主要与治疗的并发症或死者原有的合并症有关。

通过11例病例的脑组织分析发现，尽管脑组织病毒载量很大，但组织病理学改变甚微。此外，有一项不太常见的变化是血管充血，其病因不明，研究者推测可能与感染引起的血液动力学变化有关。有两例出现全身性缺氧缺血性改变，其中一例是患有癫痫的青少年 (编号P36)，在入院时发现 SARS-CoV-2 呈阳性，但有可能死于与病毒感染无关的癫痫并发症。

结论

该项研究通过对44例感染过新冠的死者展开全面的尸检，利用液滴数字聚合酶链式反应、原位杂交、免疫组化及高通量单基因组扩增测序等手段，发现新冠病毒广泛分布于全身，并且病毒复制存在于感染早期的呼吸道和多个非呼吸道组织中，包括大脑，甚至最长可持续7个月之久，揭示并量化了SARS-CoV-2的分布、复制和细胞特异性。

讨论

Chertow研究团队的这项研究是迄今为止对SARS-CoV-2病毒在人体和大脑内分布、定量及感染持久性最全面的分析。本研究与既往其他研究相比的优势在于，这项工作在死后较短的时间内取材，采用标准化的组织分离和保存技术，并运用液滴数字聚合酶链式反应和原位杂交进行高灵敏度检测和量化分析等。研究发现新冠病毒在感染早期广泛分布至全身，并且病毒可持续驻留，包括中枢神经系统也会受累。该项研究加深了我们对新冠病毒感染组织分布特征及持久性的认知，并为之后研究提供了强有力的证据，有助于明确新冠病毒持久感染的机制以及其急性后遗症。

本研究的局限性在于：首先，该项研究纳入的病例主要是年龄较大且未接种疫苗的个体，并且存在基础疾病，仍需要在年轻、健康或接种过疫苗的个体开展进一步研究；其次，该研究开展于新冠大流行的第一年，目前的病毒亚型是否也具备同样特征需要进一步验证；最后，该研究发现的病毒持续存在现象不能用来解释长期新冠后遗症。

参考文献：

Stein, S.R., Ramelli, S.C., Grazioli, A. et al. SARS-CoV-2 infection and persistence in the human body and brain at autopsy. Nature 612, 758–763 (2022).

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编辑：MiLu.米鹭

校对：Michel.米萱  

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