关于 RAS 靶向药物，这 9 个问题你都知道吗？

RAS 信号通路在驱动正常细胞增殖方面起着重要作用，该通路的任一组份改变，特别是 RAS 蛋白，均可能对多种癌症的发生、发展产生深远影响。在过去几十年里，科学家们一直致力于研发 RAS 靶向药，但因其特殊的球形结构、无明显结合位点，均以失败告终。 直到 2021 年，数十年的研究终于取得了成功。2021 年 5 月 28 日，首款高选择性 KRASG12C 抑制剂 Sotorasib （AMG510）获得 FDA 批准用于治疗携带 KRASG12C 突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者 ，打破了 KRAS「不可成药」的咒语。从此，RAS 靶向药物的研发开始进入井喷式发展。 2022 年 8 月 26 日，Salman R. Punekar 教授等人在线发表了题为「The current state of the art and future trends in RAS-targeted cancer therapies」（ RAS 靶向癌症治疗的现状和未来趋势 ） 的综述，系统阐述了 RAS 信号通路以及以 KRAS 突变为重点的 RAS 靶向治疗的进展及展望，同时讨论了 RAS 靶向治疗耐药的机制及对应措施。

问题 1、RAS 信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是真核生物中重要的级联磷酸化途径之一，在调控细胞增殖、分化、凋亡、血管生成等方面起着重要作用。RAS-RAF-MEK-ERK 通路便是其中研究最为透彻的通路之一。

RAS-RAF-MEK-ERK 通路大部分由生长因子、细胞因子、免疫受体以及许多整合素和趋化因子受体激活。首先，RAS 家族 GTP 酶（KRAS、NRAS、HRAS）在 GTP 加载的「开」状态和 GDP 加载的「关」状态之间循环，分别涉及到 RAS-鸟嘌呤核苷酸交换因子（RAS-GEFs）和 RAS-GTP 酶激活蛋白（RAS-GAPs）。

当 RAS 与 GDP 结合时处于失活状态，当 RAS 与 GTP 结合时处于激活状态。在这个激活-失活过程中，RAS 蛋白中被称为「Switch 1」和「Switch 2」的两个结构域构象发生改变，其中「Switch 2」对 RAS 抑制剂的研发至关重要。

RAS-GEFs 可通过促进 RAS 蛋白释放 GDP 或 GTP 来改变细胞内 GTP:GDP 比例。SOS1/2 作为由 RTK 和细胞因子受体激活的主要 Ras-GEFs 之一，通过富含 Pro 序列的 C 末端与 Grb2 的 SH3 结构域结合，促进 RAS-GTP 与下游的 RAF 激酶（ARAF、BRAF、CRAF）结合，活化的 RAF 激酶磷酸化激活 MEK1 和/或 MEK2，而 MEK1/MEK2 又可以磷酸化激活 ERK1 和/或 ERK2。

活化的 ERK 进入细胞核，通过磷酸化多种细胞质和核蛋白，包括其他激酶（如 RSK、MSK 和 MNK）、转录因子和细胞骨架蛋白，继而引起一系列的生理生化反应，对细胞表型产生多种影响。

RAS 信号通路的异常常见于各种恶性肿瘤中。该通路的异常可导致某些关键转录因子的激活，进而调控癌细胞的细胞周期、代谢重编程、细胞增值及肿瘤血管生成等。

问题 2、癌症中的 RAS 突变

RAS-RAF-MEK-ERK 通路中任一组份的突变，包括各种 RTK、SHP2、NF1、RAS 蛋白、RAF 家族成员或 MEK1/MEK2，均可导致该通路异常激活和肿瘤的发生发展。

人类癌症中最常见的是 RAS 突变或扩增，其中 KRAS 突变最常见于实体肿瘤，NRAS 突变主要见于黑色素瘤和许多血液系统恶性肿瘤，HRAS 突变主要发生在膀胱癌、甲状腺癌、宫颈癌和头颈癌中。

在真实世界中，KRAS 突变在 NSCLC 中占主导地位，约占 NSCLC 中发现的所有 RAS 突变的 78%。 其中 25% 的 KRAS 突变与 EGFR、BRAF、ALK 等突变为互斥突变，但在癌症中也常见 KRAS 突变与肿瘤抑制基因 STK11、TP53 或 CDKN2A/CDKN2B 的共突变。

约 95% 与癌症相关的 RAS 突变都会影响到密码子 12、13 或 61，并导致 RAS-GTP/RAS-GDP 基础比率显著增加以及 RAS 效应器的结构性激活。其中，KRAS 的 12 位甘氨酸残基（G12）突变最常见，其次是 13 位甘氨酸残基（G13）。

KRAS 密码子 12 突变最常导致 G12C、G12V 或 G12D 替换，分别占 NSCLC 中 KRAS 突变的 40%、19% 和 15%。其中 KRASG12C 突变在 NSCLC 中约占 14%，与吸烟密切相关，引起了广泛关注，但也发生于少部分结直肠癌（约 3%）、胰腺导管腺癌（约 1%）。

问题 3、KRAS 突变的生化特性

RAS 突变一度被认为锁定在 GTP 结合状态，不受 GAP 刺激或内源性 GTP 水解的影响，因此不可用药。然而，通过对不同的 RAS 突变进行了详细的结构和生化分析，发现这些突变与癌症和「RASopathies」相关，其中「RASopathies」是由 RAS-MAPK 通路中的胚系突变引起的发育障碍，进而进一步揭示了 RAS 突变和 GAP 催化的 GTP 酶活性的内在联系、RAS 突变和 SOS1/2 刺激的 GDP-GTP 交换的内在联系以及效应子结合谱的细微而重要的差异。

此外，突变还会影响 RAS 蛋白与其效应器的结合亲和力，例如 KRASG12D 与 RAF1-RBD 的结合强度大约是野生型 RAS 的 5 倍。

2020 年，Zafra 等人使用基于高保真 CRISPR 的工程技术创建了 KRAS 突变的肺癌、胰腺癌和结肠癌的小鼠模型，发现不同的 KRAS 突变对结肠和胰腺上皮细胞的转化有不同的影响。 此外，研究表明不同 KRAS 突变的致病作用，以及 KRAS 突变对直接或间接靶向治疗的敏感性，取决于细胞谱系和特定共突变的存在，以及特定等位基因变异的生化效应。虽然这些生化差异的生物学意义直到最近才研究清楚，但极大地推进了 RAS 癌症靶向治疗的药物研究。

问题 4、靶向 KRAS 的困难所在

问题 数十年的研究发现，RAS 突变具有三个关键的生化特征，阻碍了靶向 RAS 药物的发展：

RAS 蛋白与 GTP 的高度亲和力（皮摩尔数量级）；

细胞内高浓度的 GTP（约 500 nM）；

RAS 蛋白中缺少深层的或具有药理作用的小分子结合口袋。

上述前两个特征使得研发 GTP 竞争性 RAS 抑制剂几乎不可行。一方面，要想克服 RAS 对 GTP 的高度亲和力，需要具有特别高结合性能的小分子，这是前所未有的；另一方面，KRAS 蛋白的 GTP 结合位点在不同的 KRAS 突变体中有所不同，如 G12C、G12D、G12V、G13D、Q61H 等，使得 KRAS 抑制剂的设计更加复杂。

问题 5、KRASG12C 突变的突破

2013 年，K.Shokat 实验室在靶向 KRAS 研究方面取得重大突破。他们利用一种独特的基于二硫键片段的化学库方法，筛选了 480 种与攻击半胱氨酸亲核试剂偶联的系链化合物，并鉴定了与 KRASG12C-GDP 选择性共价结合的化合物。 X 射线结晶学显示，所选化合物可与由 KRASG12C-GDP 中谷氨酰胺 61（Q61）被半胱氨酸突变替换而产生的扩展 Switch 2 口袋结合，并将亲核弹头偶联到该半胱氨酸上。因此，此类抑制剂是特异性靶向 KRASG12C 的，不会影响正常细胞的 RAS 信号，至少在理论上靶向和非肿瘤毒性的风险都很低。 经过不懈努力，研究者们研制出最初的先导化合物 ARS-853、ARS1620，最终研发出可应用到临床的 KRASG12C 抑制剂，包括 Sotorasib 和 Adagrasib。

问题 6、KRASG12C 抑制剂的临床应用 

在 I/II 期 CodeBreaK 100 研究中，22 名晚期 KRASG12C 突变实体肿瘤患者接受了 Sotorasib 靶向治疗，初步结果显示出单药抗肿瘤活性，包括 6 名 NSCLC 中的 1 名部分缓解（PR）。 这项试验第一阶段 129 名肿瘤患者的后续数据显示，59 名晚期 NSCLC 患者的客观缓解率（ORR）为 32.2%，疾病控制率（DCR）为 88.1%，中位 PFS 为 6.3 个月；42 例结直肠癌（CRC）患者的 ORR 为 7.1%，DCR 为 73.8%，中位 PFS 为 4.0 个月。 此外，黑色素瘤、胰腺癌、子宫内膜癌或阑尾癌患者也表现出治疗反应。CodeBreaK 100 的 II 期部分包括 124 名可评估的晚期 KRASG12C 突变 NSCLC 患者，其 ORR 为 37.1%，中位缓解持续时间（DOR）为 11.1 个月，中位 PFS 为 6.8 个月，中位 OS 为 12.5 个月。基于该研究结果，2021 年美国 FDA 加速批准了 Sotorasib 用于晚期 KRASG12C 突变实体肿瘤患者。

174 名纳入 CodeBreaK 100 研究的 NSCLC 患者的最新数据显示，其 1 年 OS 为 50.8%，2 年 OS 为 30.3%。此外，来自 CodeBreaK 100 的 PDAC 队列（n = 38）的数据显示，在经过大量预处理的患者群体中，ORR 为 21.1%，DCR 为 84.2%；然而，在 CRC 队列（n = 62）中 ORR 仅为 9.7%。 目前 III 期 CodeBreaK 200 试验正在进行中，旨在探索 Sotorasib 单药或与多西紫杉醇联用在经免疫治疗和含铂化疗进展后的晚期 KRASG12C 突变 NSCLC 的疗效，主要终点为 PFS。 此外，已有多种 KRASG12C 抑制剂进入临床研发阶段，如 Adagrasib、GDC-6036、JDQ443、LY3537982、D-1553、JNJ-74699157、BI 1823911、JAB-21822、MK-1084 等，其中第二款 KRASG12C 抑制剂 Adagrasib 因其 I/II 期 Krystore-1 研究的突出疗效已获得 FDA 授予「突破性疗法」。

问题 7、KRAS 抑制剂耐药 

虽然 KRAS 不再是不可成药，但目前 KRAS 抑制剂单药的疗效远远不够。事实上，可塑性和遗传不稳定性可使肿瘤对所有单药靶向治疗产生抗药性，其中靶向 KRAS 治疗也不例外。例如，Sotorasib 在 KRASG12C 的 NSCLC 种 ORR 仅为 41%，中位 PFS 仅为 6.3 个月，两年 OS 率约为 30%。

原发耐药性

从理论上讲，特异性靶向 KRAS 抑制剂的原发耐药性可能是由于肿瘤的突变异质性或存在特定的共突变所致。研究发现 CRC 不同部位之间存在 KRAS 突变异质性，这就部分解释了 CRC 患者对 EGFR 靶向治疗的不同反应。同样在 NSCLC 不同部位之间也存在突变异质性。 然而，在初始治疗前肿瘤内 KRAS 突变的异质性似乎并不常见。Zhao 等人评估了 8750 例治疗前 KRAS 突变肿瘤样本，仅在 304 例样本中发现了一种以上的 RAS 突变（3.5%）；在 KRASG12C 突变肿瘤中，发现 3% 存在继发性 RAS 突变。 目前，我们对 KRASG12C 抑制剂原发耐药的机制知之甚少，需要进行大规模队列的多组学分析来进一步明确有哪些因素可引起患者对此类药物无效。

突变逃逸引起的获得性耐药

突变逃逸是指在治疗前未检测到、在治疗过程中产生的耐药性突变。常用的 KRAS 抑制剂 Sotorasib 和 Adagrasib 的结合位点是由 KRASG12C 第 12、68、95 和 96 位的氨基酸残基组成；因此，影响这些残基的突变与耐药性密切相关。例如，KRASG12C 第二位点 Y96D 的获得性突变通过改变 Switch 2 口袋使得 Adagrasib 抑制剂无法结合 KRAS，从而产生耐药。 值得注意的是，KRAS 突变中继发性 G13D、R68M、A59S 或 A59T 突变的细胞虽然对 Sotorasib 耐药，但仍然对 Adagrasib 敏感；同样的，继发 Q99L 突变虽然对 Adagrasib 耐药，但仍对 Sotorasib 敏感。所以，虽然 Sotorasib 和 Adagrasib 是同类抑制剂，但不能简单的将其互换使用。

适应性耐药

适应性耐药是指 RAS-MAPK 通路在一定水平上快速重新激活，通常是由于 MYC 靶基因（如编码 RTK 及其配体的基因）的去表达抑制了 ERK 活性。KRASG12C 抑制剂适应性耐药的确切机制仍然存在争议，尚不清楚是由 KRAS 突变重新激活所致还是由其他野生型 KRAS、HRAS 和/或 NRAS 激活所致。 同样不清楚的是，适应性耐药是否最终可以导致 KRASG12C 突变肿瘤的重新生长，而不会出现继发性遗传和/或表观遗传学改变，或者这种耐药突变是否能够使肿瘤细胞存活到这种改变发生为止。

上皮-间质转化（EMT）和腺鳞状转化

上皮-间质转化（EMT）是 KRASG12C 抑制剂原发性耐药和获得性耐药的另一种潜在机制，但并非 KRAS 突变癌症所特有的。在 EMT 过程中，细胞可通过下调上皮基因的表达、上调间质基因的表达，从而获得更高的迁移率和侵袭性。 Singh 等人的开创性工作在 KRAS 突变细胞系中发现了 KRAS 依赖的基因表达特征，并证明了某些特征基因的表达缺失与 EMT 有关。并且，诱导 EMT 可减少细胞对 KRAS 的依赖。 此外，在 9 例 KRASG12C 突变 NSCLC 对 Adagrasib 产生获得性耐药的患者中，有 2 例（22%）观察到腺鳞状转化，即从腺癌到鳞癌的组织学变化。类似的组织学转化也与 EGFR 抑制剂的耐药有关。

问题 8、克服 KRASG12C 抑制剂耐药 

纵向联合用药

适应性耐药通常涉及几个 RTK 和 RTK 配体的上调，但一个或多个 RTK-配体组合就可以在单个肿瘤中占据主导地位。在 NSCLC 和 CRC 中，KRASG12C 的抑制导致上游 EGFR 和/或其他 ERBB 家族成员的激活并积累，进而导致 KRASG12C 抑制剂单药无效。 目前多个临床试验正在研究 KRASG12C 和 EGFR 抑制剂的联合使用。如 CodeBreaK 101（NCT04185883）研究探索的 Sotorasib 与 EGFR/HER2 酪氨酸激酶抑制剂 Afatinib 或抗 EGFR 单抗 Panitumumab 的联合使用，2021 年公布的初步数据显示出可控的安全性，最常见的与治疗相关不良反应（TRAE）是腹泻（69.7%）和恶心（21.2%），其中 ≥ 3 级的患者分别为 21.2% 和 0%；在有效性方面。在两个剂量队列中 ORR 分别为 20.0% 和 34.8%，DCR 分别为 70.0% 和 73.9%。 SHP2 是 RAS-MAPK 途径的一个关键的「正」上游调节因子，是多种致癌驱动蛋白激酶信号传递的重要组成部分，也是免疫细胞信号传递的复杂正负调节因子。SHP2 在 KRAS 突变 NSCLC 的几种模型中是肿瘤发生发展所必需的，这表明 SHP2 抑制可能在 KRAS 突变癌症的治疗中起作用。 SHP2 在介导 JAK-STAT 信号方面可不依赖于 KRAS 的作用，这可能介导免疫检查点受体作用的某些方面。在 RAS 信号通路中，SHP2 在 RTK 下游和 SOS1/2 的上游发挥作用，有望成为逆转 KRASG12C 抑制剂适应性耐药的靶点。SHP2 和 KRAS 的联合抑制不仅改变了癌细胞的信号转导，而且也对肿瘤微环境（TME）产生重要影响。 临床前研究显示 SHP2 和 KRAS 联合抑制可提高疗效，目前正在进行多项临床试验探索 SHP2 抑制剂 TNO155 与 KRASG12C 抑制剂 Adagrasib（KRYSTAL-2/NCT04330664）、与 Sotorasib（CodeBreak 101 /NCT04185883）、与 JDQ443（KontRASt-01 /NCT04699188）的联合疗效。

横向联合用药

抑制 mTOR 已被认为是克服对 KRAS（或 MEK）抑制剂适应性耐药性的一种替代策略。在 PDAC 的几个临床前模型中，对 KRAS 或 MEK 抑制的耐药是通过整合素连接激酶（ILK）介导的 mTOR 复合体 2（MTORC2）的一个组成部分 Rictor 的磷酸化以及随后 mTORC2 介导的 AKT 的磷酸化而产生的旁路信号所介导的。 因此，联合抑制 KRASG12C 或 MEK 和 mTORC1/2 协同损害 ERK 和 AKT 的激活，导致持久抑制 PDAC 生长和小鼠模型中的转移。在 CodeBreak 101 试验中正在评估 mTOR 抑制剂 Everolimus 与 sotorasib 联合疗效。 细胞周期抑制提供了另一种与 KRAS 抑制剂协同作用的潜在水平联合用药策略。临床前研究表明，在 NSCLC 和 PDAC 模型中，CDK4/6 和 KRASG12C 联合抑制具有协同效应。此外，还可联合 Aurora 激酶（AURKA、AURKB 和 AURKC）抑制剂、有丝分裂检查点激酶 WEE1 抑制剂等。

免疫介导的逃逸和免疫治疗的组合策略

KRAS 突变除了改变癌细胞本身行为外，还可对周围 TME（包括淋巴上皮）中的免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞等产生影响。此外，KRAS 具有多种免疫调节作用。 KRAS 的激活可促进产生中性粒细胞趋化因子 CXCL1、CXCL2 和 CXCL5；通过上调细胞间粘附分子 1（ICAM1）的表达促进促炎性 M1 巨噬细胞的募集；通过分泌 TGF-β 和 IL-10 诱导免疫抑制调节性 T（Treg）细胞分化；通过依赖 GM-CSF 和 IRF2/CXCL3 的机制促进肿瘤对 MDSC 的侵袭。 所以，KRAS 抑制剂与 ICIs 联合也是一种有效策略。 目前，联合 KRASG12C 抑制剂与 ICIs 的多项临床试验（CodeBreaK 100/NCT03600883、CodeBreaK 101 /NCT04185883、KRYSTAL-1/NCT03785249、KRYSTAL-7/NCT04613596、GO42144 /NCT04449874、KontRASt-01/NCT04699188）正在进行中。

问题 9、RAS 抑制剂的展望

靶向 KRAS

其他亚型或其他 RAS突变

因为 KRASG12D 具有比 KRASG12C 更低的固有 GTP 酶活性，大多数 KRASG12D 蛋白将与 GTP 结合。因此，靶向 KRASG12D-GTP 以及其他 RAS 亚型的药物一直是药物开发的焦点。 此外，另一种新的靶向 KRAS 突变和/或其他 RAS 突变亚型的策略，使用了类似于免疫抑制剂环孢菌素、FK506 和雷帕霉素的机制。目前已经开发出了可与亲环素 A 结合并与各种 RAS 蛋白形成抑制性三聚体复合物的多种化合物。

RAS 降解和嵌合毒素

RAS 降解是靶向 RAS 突变恶性肿瘤的另一种新方法。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）通过结合并聚集目的蛋白和 E3 泛素连接酶进而促进疾病相关蛋白的蛋白酶体降解。 LC-2 就是一种针对 KRASG12C 设计的 PROTAC，LC-2 可促进 Adagrasib 和 E3 连接酶 VHL 结合，使 KRASG12C 蛋白降解，从而抑制 KRASG12C 突变细胞的增殖。同样的，类似设计的泛 KRAS 和其他突变特异性 KRAS 降解剂正在临床前开发中。 使用嵌合毒素也是 RAS 靶向的另一种替代方法。RRSP-DTB 是一种此类毒素，由创伤弧菌的 RAS/RAP1 特异性内肽酶（RRSP）和白喉毒素（DTB）的易位 B 片段（DTB）组成。 该毒素通过肝素结合 EGF 样生长因子（HB-EGF）介导的内吞作用进入细胞，随后裂解 Switch 1 区域内的 RAS 蛋白。更重要的是，RRSP-DTB 能够裂解 HRAS、NRAS 和 KRAS，而不受 GTP 或 GDP 的影响。

靶向 KRAS 的免疫疗法

过继细胞疗法（ACT）可通过分离免疫细胞如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）并在体外扩增，然后将其重新注入患者体内发挥抗肿瘤作用。这种方法目前也可应用到 KRAS 突变肿瘤。 2016 年，Tran 等人首次描述了针对 KRAS 突变癌细胞的内源性免疫反应，他们通过识别来自 KRASG12D 突变的 MHC I 的 T 细胞受体（TCR）来识别 CD8+ TIL；结果在 KRASG12D 突变 CRC 患者中的所有七个肺转移灶全部消退。 治疗性癌症疫苗是针对 KRAS 突变肿瘤的另一种基于免疫的治疗方法。目前已经开发出了一种以 KRAS 的 G12D、G12V、G13D 和 G12C 突变为靶点的 mRNA 新抗原疫苗（mRNA-5671/V941），并已进入 I 期临床试验。此外，也有研究者提出针对突变的 KRAS 多肽-MHC 复合体的抗体疗法。

小干扰 RNA（siRNA）

研究者已经开发了基于纳米颗粒的平台来传递 KRAS 特异性小干扰 RNA（siRNA）。该技术已被证明可充分传递至癌细胞，并有效降低其 KRAS 水平，从而产生抗癌活性。 Exosome 是一种天然的纳米粒子，已经被设计成能够传递特定的 siRNA 来下调突变的 KRAS（iExosome），目前正在 KRASG12D 突变 PDAC 换种进行临床试验。

作者：黄玉庭；审核：齐晓光；排版：景胜杰；

参考文献：

Punekar, S.R., Velcheti, V., Neel, B.G. et al. The current state of the art and future trends in RAS-targeted cancer therapies. Nat Rev Clin Oncol 19, 637–655（2022）