科研丨四川大学华西二院: 病毒组和宏基因组分析揭示了妊娠期人类胎儿肠道微生物群的独特分布(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

研究表明，胎儿免疫细胞的激活可能是由于潜在的微生物暴露所致，尽管胎儿中微生物的存在一直是一个有争议的话题。本研究结合宏基因组和病毒组技术来研究胎儿组织(小肠、盲肠和直肠)中细菌和病毒的存在。结果发现，胎儿肠道不是一个无菌环境，具有低丰度但代谢丰富的微生物群。其中，变形菌门和放线菌门是胎儿肠道的优势菌门。共检测到700种病毒，其中人类β疱疹病毒5型是最丰富的真核病毒。特别是，本研究首次在胎儿肠道中发现了Methanobrevibacter smithii。通过与成人肠道微生物群的比较，我们发现厚壁菌门和拟杆菌门在生长发育过程中逐渐成为肠道微生物群的主力。有趣的是，胎儿和成年人共有6个抗生素耐药基因(ARGs)。本研究结果表明，胎儿肠道中存在微生物，并证明了细菌、古菌和病毒的多样性，这为早期胎儿免疫相关研究提供了支持。本研究进一步探讨了胎儿肠道中病毒的具体组成以及胎儿和成人肠道微生物群之间的相似性，这对了解妊娠期人类胎儿的免疫发育有价值。  

论文ID

原名：Virome and metagenomic analysis reveal the distinct distribution of microbiota in human fetal gut during gestation

译名：病毒组和宏基因组分析揭示了妊娠期人类胎儿肠道微生物群的独特分布

期刊：Frontiers in Immunology

IF：8.786

发表时间：2023.1

通讯作者：张曜耀，范振鑫

通讯作者单位：四川大学华西第二医院

DOI号：10.3389/fimmu.2022.1079294

实验设计

图1 实验设计图解及流程图。  

结果

1 宏基因组分析鉴定的微生物组成

对胎儿小肠、盲肠和直肠的内容物进行宏基因组测序，共检测到486种细菌，包括8门238属(图2A-C)。其中小肠、盲肠和直肠共有120种，小肠特有种172种，直肠特有种55种(图2D)。如表1所示，小肠和盲肠中排名前3的门分别为变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。然而，厚壁菌门取代拟杆菌门成为直肠中的第三大门。在属水平上，小肠(特别是微杆菌属Microbacterium、伯克霍尔德氏菌属Burkholderia和根瘤菌属Rhizobium)和直肠(特别是Microbacterium、Rhizobium和Burkholderia)的前3位相似。盲肠发生了显著变化，盲肠前3个属分别为伯克霍尔德氏菌属、微杆菌属和Paraburkholderia。在物种水平上，小肠和直肠中相对丰度排名前3位的是Microbacterium sp. LKL04、Methylorubrum populi和Agrococcus sp. SGAir0287，而盲肠中相对丰度居前3位的是Agrococcus sp. SGAir0287、Paraburkholderia fungorum和Burkholderia multivorans。此外，还检测到极少量的病毒和古菌。为了进一步探索胎儿肠道微生物组的功能，我们通过HUMAN3进行了功能富集分析，结果显示未发现富集通路。

图2 肠道微生物群的宏基因组分析。

(A)胎儿肠道三个不同部位的前10个丰富门。(B)胎儿肠道三个不同部位的前10个丰富属。(C)胎儿肠道三个不同部位的前10个丰富物种。(D)胎儿肠道微生物群在物种水平上的Upset图和维恩图。上面的列表示该点所在行的几个样本的交集。

表1 在门、属和种水平排名前5位的细菌(宏基因组)。

2 通过病毒组分析鉴定微生物组成

为了探索病毒在胎儿肠道中的存在，并尽可能多地检测到其他微生物，我们进行了病毒组测序，并放宽了病毒序列的过滤条件。与宏基因组数据相比，检测到更多的病毒、细菌和古菌。共检测到700种病毒(包括14门432属，图3A-C)、267种古菌(包括8门118属，图3D-F)和5477种细菌(包括40门1475属)(图3G-I)。

在病毒方面，小肠、盲肠和直肠共有11种，小肠特有种为189种，直肠特有种为1种(图4A)。小肠和直肠中前3个门分别为Uroviricota、Nucleocytoviricota和Peploviricota，而在盲肠中只检测到Uroviricota。小肠的前3个属为Lillamyvirus、Muminvirus和Inovirus，直肠的前3个属为Pahexavirus、Muminvirus、Lillamyvirus。盲肠中没有检测到病毒属，这与物种水平一致。在物种水平上，Clostridium phage phiCT453A是小肠和直肠中最丰富的物种，在直肠中检测到人类β疱疹病毒5型(表2)。

图3 病毒组检测胎儿肠道不同部位微生物群的分布。

(A)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10个病毒门。(B)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10个病毒属。(C)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10种病毒。(D)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10个古菌门。(E)胎儿肠道三个不同部分中最丰富的10个古菌属。(F)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10种古菌。(G)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10个细菌门。(H)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10个细菌属。(I)胎儿肠道三个不同部位中最丰富的10种细菌。

表2 在门、属、种水平排名前5位的病毒(病毒组)。

如图4B所示，在古菌方面，小肠、盲肠和直肠共有19种，其中2种为小肠特有种。

小肠、盲肠和直肠的前3个门基本相同，主要包括Euryarchaeota、Thaumarchaeota和Crenarchaeota。在属水平上，Halorubrum、Methanosarcina和Methanobrevibacter是小肠的前3个属，Halorubrum、Methanosarcina和Thermococcus是直肠的前3个属，盲肠中仅检测到Halovivax和Methanobacterium。在物种水平上，小肠的前3个物种分别为Methanobrevibacter smithii、Salinadaptatus halalkaliphilus和Salinigranum rubrum，直肠的前3个物种分别为Salinadaptatus halalkaliphilus、Halopiger xanaduensis和Methanobrevibacter smithii，盲肠中仅检出Halovivax ruber (表3)。

图4 病毒组检测到的胎儿肠道微生物群的Upset图和维恩图(物种水平)。

(A)胎儿肠道病毒在三个不同部位的Upset图和维恩图。(B)胎儿肠道古菌在三个不同部位的Upset图和维恩图。(C)胎儿肠道细菌在三个不同部位的Upset图和维恩图。

表3 在门、属和种水平排名前5位的古菌(病毒组)。  

在细菌方面，小肠、盲肠和直肠共有1963种，其中21种为小肠特有种(图4C)。变形菌门、放线菌门和厚壁菌门是胎儿肠道三个不同部位的优势门。小肠和直肠中相对丰度居前3位的属为劳尔氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。盲肠中相对丰度居前3位的属依次为假单胞菌属、劳尔氏菌属(Ralstonia)和中生根瘤菌属(Mesorhizobium)。在物种水平上，小肠、盲肠和直肠的前3位均由Ralstonia pickettii、Cutibacterium acnes和Mesorhizobium terrrae组成(表4)。

事实上，功能富集分析结果显示，小肠和直肠微生物主要富集在氨基酸的合成和代谢途径以及能量代谢途径，如L-缬氨酸生物合成、脲类生物合成、乙醛酸旁路和TCA超通路、L-酪氨酸降解I和TCA循环I原核生物(图5A、B)。此外，抗生素耐药基因(ARGs)的鉴定结果显示，共检测到25个ARGs，其中小肠检出8个，直肠检出24个，盲肠未检出ARG(图5C、D)。

表4 在门、属和种水平排名前5位的细菌(病毒组)。

图5 (A)小肠微生物群的通路富集分析。(B)直肠微生物群的通路富集分析。(C)小肠微生物的ARGs分析。(D)直肠微生物的ARGs分析。

3 成人肠道微生物组成

对于成年人的微生物群落，共检测到5385种细菌(40门1471属)、47种病毒(4门20属)和258种古菌(6门112属，图6A)。如表1所示，排名前3的门是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。在属水平上，排在前三位的是拟杆菌属(Bacteroides)、Phocaeicola和Faecalibacterium。排在前3位的物种是Phocaeicola vulgatus、Faecalibacterium prausnitzii和Bacteroides uniformis。由于在胎儿宏基因组测序中检测到极少量的病毒和古菌，我们将在成年人宏基因组测序中检测到的古菌和病毒与病毒组数据进行了比较。就病毒而言，排名前3位的门是Uroviricota、Hofneiviricota和Nucleocytoviricota。排在前三位的属分别是Toutatisvirus、Brigitvirus和Oengusvirus。在物种水平上，排名前3位的是Faecalibacterium virus Toutatis、Faecalibacterium virus Brigit和Faecalibacterium virus Oengus(表2)。如表3所示，排在前3位的门为Euryarchaeota、Crenarchaeota和Candidatus Thermoplastota。成年微生物群相对丰度居前3位的属分别为Methanosarcina、Methanobrevibacter和Thermococcus。排名前3位的菌种分别是Methanobrevibacter smithii、Methanosalsum zhilinae和Methanococcus maripaludis。此外，我们利用HUMAN3对成年人肠道微生物群的整体功能进行了表征。如图6B所示，成年人肠道微生物群的代谢途径主要富集在蔗糖生物合成II、糖酵解IV、dTDP&β；L-鼠李糖生物合成和L-缬氨酸生物合成途径。

为了进一步探索成年人和胎儿微生物群多样性和组成的差异，我们进行了α-多样性和β-多样性分析。本研究的结果显示，Chao1和ACE指数存在显著差异(p<0.05，图6C、D)。主坐标分析(PCoA)显示，胎儿样本和成人样本显著分离(p<0.05，图6E)。此外，在成年人的肠道微生物群中共检测到71个ARGs。其中，rsmA、tet(W/N/W)、adeF、tetO、lnuC和APH(6)-Id为胎儿和成人共享(图6F)。

图6 

(A)门水平细菌、古菌和病毒在每个成年样本中的分布。(B)成年人肠道微生物群的通路富集分析。(C)胎儿组和成人组之间的α多样性(Chao1指数)估计。(D)胎儿组和成人组之间的α多样性(ACE指数)估计。(E)基于Bray-Curtis距离的PCoA图。(F)所有ARGs在胎儿组和成人组中的分布。**表示p＜0.05，我们选择p值截断值0.05作为显著性水平。  

讨论

长期以来，胎儿肠道中微生物的存在一直存在争议。经过严格的实验条件和环境控制设置，本研究的结果表明，胎儿肠道中确实存在微生物，包括细菌、古菌和病毒。

宏基因组和病毒组的整合结果表明，在门水平上，变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是胎儿肠道中的优势门。在属水平上，假单胞菌属(Pseudomonas)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、微杆菌属(Microbacterium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)和劳尔氏菌属(Ralstonia)是胎儿肠道的优势属，最近的研究在环境对照组中发现了其中的Ralstonia和Burkholderia。然而，在另一项研究中，作为Ralstonia成员之一的Ralstonia insidiosa是母胎界面的居民。事实上，我们还在胎儿肠道中检测到高丰度的Ralstonia pickettii和Ralstonia insidiosa。本研究的结果证实，Mishra等人最近的一项研究分析了胎儿微生物，发现假单胞菌和慢生根瘤菌在胎儿样本中富集。

此外，我们检测到700种病毒，它们与其他肠道微生物群落一起维持肠道的动态平衡，是调节肠道稳态和炎症的关键参与者，包括胎儿肠道中的130种细菌病毒(噬菌体)和570种真核病毒。在570种真核病毒中，人类β疱疹病毒5型(也称为人类巨细胞病毒)最为丰富，它是胎儿和新生儿先天性病毒感染的常见原因，也是先天性感音神经性听力损失和神经功能障碍的主要非遗传原因。人类是人类巨细胞病毒(HCMV)的唯一宿主，它可以在大多数类型的细胞中复制。HCMV可在母体感染期间通过垂直传播导致发育中的胎儿感染，在妊娠早期、中期和晚期的传播率分别为26%、28%和65%。在198种可以与细菌相互作用以调节细菌组成的噬菌体中，以梭菌(Clostridium)、埃希氏菌(Escherichia)和黄杆菌(Flavobacterium)属噬菌体为主。此外，我们检测到了crAssphage，它不仅是已知存在于人类中最丰富的病毒，而且几乎无处不在，这表明crAssphaage是在生命早期获得的，这与Lim等人的研究结果相反。

目前大多数研究都集中在细菌、真菌或病毒上，而古菌往往被忽视。然而，古菌和宿主之间的相互作用会以多种方式影响宿主，因为古菌被提议用于预防三甲胺尿症和心血管疾病；在人类皮肤上发现的古菌可能与年龄和皮肤生理有关；古菌参与促炎过程。产甲烷的古菌是古菌群的主要组成部分，包括Methanobacteriales和Methanomassiliicoccales。Methanobrevibacter smithii是人类肠道中最丰富的产甲烷菌，近40年前作为第一个代表被分离出来。利用病毒组测序的优势，在胎儿肠道中检测到262种古菌(包括8门117属)。广古菌门(Euryarchaeota)是最丰富的门，包含了大多数古菌(产甲烷菌、嗜盐菌和嗜热菌)。Methanobrevibacter smithii是最丰富的物种，这是有史以来首次在胎儿肠道中检测到M. smithii，这证实了Sereme等人的假设，即Methanobrevibacter smithii是子宫内肠道微生物群的成员。我们的研究结果反对母乳是早产新生儿中Methanobrevibacter smithii来源的假设。Grine等人的研究表明，仅在阴道疾病的病例中，阴道液中检测到Methanobrevibacter smithii，尽管胎儿通过阴道，我们研究的母亲没有细菌性阴道病。此外，在胎儿肠道中检测到更多的产甲烷菌，如Methanobrevibacter millerae、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium和Methanosphaera stadtmanae。

宏基因组和病毒组测序结果均表明，在不同的分类水平(门、属和种)上，直肠微生物种类高于小肠和盲肠。此外，小肠和直肠的组成和功能途径更相似。盲肠和其他两个部位之间的差异可能是由于盲肠的宿主污染比小肠和直肠的宿主污染更严重。

本研究将胎儿肠道微生物群与成年人的肠道微生物群进行了比较，发现成年人肠道微生物群的多样性显著高于胎儿组。两组之间的肠道微生物群组成有显著差异。具体而言，变形菌门和放线菌门是胎儿肠道中的优势菌门，而成年人肠道中的优势菌门是厚壁菌门和拟杆菌门，这表明厚壁菌门和拟杆菌门在生长发育过程中逐渐取代变形菌门和放线菌门成为肠道微生物群的主力。对于病毒和古菌，两组的优势门相似。此外，我们发现胎儿组中有6个ARGs与成人组一致，这表明携带ARGs的微生物可能在妊娠期间垂直传播。

综上所述，本研究通过宏基因组和病毒组测序检测到了胎儿肠道中的多种微生物，包括细菌、病毒和古菌。特别是，我们首次在胎儿肠道中发现了Methanobrevibacter smithii，它是最常见和最丰富的产甲烷菌。此外，通过比较胎儿和成人的肠道微生物群，我们发现肠道细菌组成在生长发育过程中发生了很大的变化，胎儿和成人中存在相同的ARGs。因此，我们认为胎儿肠道不是一个无菌环境，并且具有低丰度但代谢丰富的微生物组。本研究为了解妊娠期人类胎儿免疫发育提供了有价值的资源。