科研丨北京医院＆中科院微生物所: 系统性红斑狼疮患者中具有强干扰素特性的肠道病毒组紊乱(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

越来越多的证据表明，肠道菌群紊乱在系统性红斑狼疮(SLE)的发病中起着重要作用，但肠道病毒组对这一疾病的作用尚不清楚。本研究对76例未接受治疗的SLE患者和75名健康对照的粪便病毒样颗粒(VLPs)进行了肠道病毒组分析。结果显示，SLE患者肠道中噬菌体的比例显著增加，发生改变的病毒分类单元与临床参数相关。SLE患者的肠道病毒组和细菌组密切相关。肠道病毒和细菌标志物联合可以更好地区分SLE患者和健康对照。此外，未接受治疗的SLE患者的VLPs促进了上皮细胞系和人类免疫细胞中干扰素-α(IFN-α)的产生。有趣的是，治疗后SLE患者的VLPs的干扰素刺激能力减弱。综上所述，该研究结果可能为SLE发病机制提供新的见解，进一步深入了解肠道病毒组可能有助于开发未来的SLE患者生物标志物和治疗方法。  

论文ID

原名：Disturbed gut virome with potent interferonogenic property in systemic lupus erythematosus

译名：系统性红斑狼疮患者中具有强干扰素特性的肠道病毒组紊乱

期刊：Science Bulletin

IF：20.577

发表时间：2023.1

通讯作者：张烜，王军

通讯作者单位：北京医院/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院；中国科学院微生物研究所

DOI号：10.1016/j.scib.2023.01.021

实验设计

结果

1. SLE患者肠道病毒多样性和分类发生了变化

本研究包括76例未接受治疗的SLE患者和75名健康对照者(HCs)，进行肠道病毒组分析，附表1总结了研究人群的临床特征。在所有SLE患者中，32人在接受3至24个月的SLE治疗后，提供了另一份粪便样本，系统性红斑狼疮疾病活动度评分(SLEDAI)显著降低(−8.6±7.7，P<0.0001，附图1)。对肠道VLPs进行富集并进行肠道病毒组分析。本研究平均获得3128912±1703255条高质量双端读长，可用于contig组装和病毒注释。研究人员共鉴定出了3037个vOTUs，其中2143个vOTUs通过将其基因组与噬菌体的已知蛋白质进行比对而被鉴定为噬菌体，其余894个vOTUs是真核病毒。注释的vOTU来自3个病毒目，包括Caudovirales、Algavirales和Pithovirus。Caudovirales目的病毒的相对丰度最高(> 99.9%)。在注释的vOTUs中，丰度最高的病毒科是Siphoviridae(45.1%)、Myoviridae(35.0%)和Podoviridae(10.1%)。

为了探究未接受治疗的SLE患者和健康对照组的肠道病毒组的差异，研究人员首先分析了病毒群落的α多样性和β多样性，发现SLE患者和健康对照组的vOTU数量和Shannon指数(群落丰富度和均匀性的指标)没有显著差异(vOTU数量，图1a；Shannon指数，图1b)。在亚组分析中，SLE伴狼疮性肾炎患者的vOTU数量明显低于HC(附图2a和附表3)；而没有面部红斑的SLE患者的Shannon指数明显小于健康对照组(附图2b和附表3)。基于样本之间的Bray-Curtis距离计算β多样性，PERMANOVA分析发现SLE患者和健康对照组(图1c)以及由临床特征定义的SLE亚组(附表4)的病毒群落的β多样性没有显著差异。此外，作者比较治疗前后的SLE肠道病毒组，发现α多样性(vOTU数量P=0.832，Shannon指数P=0.224，图1d，e)和β多样性(R2=0.014，P=0.892，图1f)没有差异。

图1. 系统性红斑狼疮患者和健康对照组肠道病毒群落的多样性。

(a)箱形图展示了肠道病毒群落中的vOTU数量。(b)未接受治疗的SLE患者和健康对照组的肠道病毒群落的Shannon指数。(c)基于未接受治疗SLE患者和健康对照组不同样本肠道病毒组之间的Bray-Curtis相似性的PCoA图。(d)箱形图展示了SLE患者治疗前后肠道病毒组的vOTU数量和(e)Shannon指数。(f)基于SLE患者治疗前后不同样本肠道病毒组之间的Bray-Curtis相似性的PCoA图。Wilcoxon秩和检验（a，b）和配对Wilcoxon秩和检验（d，e）用于确定两组比较的显著性。  

然后，作者对肠道病毒组的分类学变化进行了探索。SLE患者中噬菌体的比例明显高于健康对照组(图2a)。SLE患者和健康对照组的烈性噬菌体(virulent phages)和温和噬菌体(temperate phages)的相对丰度没有差异(附图3)。采用LEfSe分析鉴定组间具有显著差异的分类群（P<0.05），LDA值大于2.0(附表5)。SLE患者的肠道病毒组中，病毒科Demerecviridae和Phycodnaviridae的丰度比健康对照组高(图2b)。在亚科水平上，与HC肠道病毒组相比，SLE肠道病毒组中的Slopekvirinae和Ermolyevavirinae丰度增加，而Rakietenvirinae丰度较低(图2b)。在属和种水平上，SLE患者中最具鉴别性的病毒是Drulisvirus、Thermoanaerobacterium phage THSA-485A、Caeruleovirus和Bacillus virus JBP901，而健康对照组中最具鉴别性的病毒是crAss-样病毒和其中一种病毒：Cellulophaga phage phi14:2 (图2c)。接下来，作者进一步分析了丰度发生改变的病毒属或物种与SLE相关临床指标之间的关系。SLE患者中富集的Drulisvirus的肠道丰度与血清抗核抗体滴度呈正相关(图2d)。此外，SLE患者富集的Staphylococcusphage phiRS7的肠道丰度与SLEDAI以及C-反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)等炎症指标呈正相关。

图2. SLE患者肠道病毒组的分类学特征及其临床意义。

(a)箱线图展示了SLE患者和健康对照组肠道噬菌体的相对丰度。Wilcoxon秩和检验用于评估两组比较的显著性水平。*P <0.05。(b, c)条形图展示SLE患者与健康对照之间肠道病毒组中丰度具有差异的病毒科/亚科和属/物种。每个柱的长度表示每个分类单元的LDA效应大小。图中仅展示组间病毒分类群的显著变化。(d)热图展示差异丰富的肠道病毒属或种与临床数据之间的Spearman相关性。与任何临床指标无显著相关性的分类单元已从热图中剔除。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001，****P <0.0001。WBC，白细胞；LYM，淋巴细胞；HGB，血红蛋白；PLT，血小板；ALT，丙氨酸转氨酶；ALB，白蛋白；TBIL，总胆汁酸；DBIL，直接胆汁酸；Cr，肌酐；CRP，C反应蛋白；ESR，红细胞沉降率；ANA，抗核抗体；SLEDAI，SLE疾病活动指数。  

2. 肠道病毒组和细菌组之间的相互关系及联合诊断SLE的价值

此前，研究人员已经分析了该队列中相同受试者的肠道宏基因组，本研究也纳入了肠道菌群的信息，用于与肠道病毒组进行配对分析。Procrustes分析结果显示，肠道微生物组中病毒和细菌群落之间存在显著的跨界关联(图3a)。作者进一步分析了SLE患者肠道发生改变的病毒属/种与改变的细菌属之间的相关性(图3b)，一些细菌噬菌体与不是它们宿主的细菌属具有相同的改变模式，这表明肠道病毒组和细菌组之间存在复杂的相互作用。例如，上述Drulisvirus与SLE患者肠道中富集的Atopobium呈正相关，但与SLE患者中丰度减少的Eubacterium和Collinsella呈负相关。此外，crAss样病毒与SLE患者肠道中丰度减少的Desulfovibrio呈正相关，但与SLE患者中富集的Lactobacillus和Eikenella呈负相关。

图3. SLE患者肠道病毒组和细菌组之间的相关性。

(a) PCoA图，展示SLE患者和健康对照组肠道病毒组和细菌组Procrustes分析结果。(b)热图，展示SLE患者和健康对照组之间差异丰富的肠道病毒属或种与差异丰富的肠道细菌属之间的Spearman相关性。*P < 0.05。  

接下来，作者尝试利用随机森林算法建立基于病毒属/种和细菌种肠道丰度的SLE诊断模型。为了进行模型构建和测试，作者随机选择70％的受试者作为训练组，其余作为测试组。通过十倍交叉验证，18个病毒属/种和19个细菌种具有最佳预测性能(图4a，b)。然后，作者为每个模型构建ROC曲线(接受者操作特征曲线)，并计算相应的AUC(曲线下面积)以衡量模型的准确性(图4c-e)。无论是训练组数据集还是测试组数据集，病毒和细菌标志物在区分SLE患者和健康对照组方面没有显著差异。然而，在训练组中，联合肠道细菌和病毒标志物进行诊断，比单独使用肠道病毒组（AUC，0.948 vs. 0.853；P=0.022）和单独使用肠道细菌（AUC：0.948 vs. 0.929；P=0.056）更能区分SLE患者和健康对照。联合模型在区分32名随访SLE患者和75名健康对照方面也表现出良好的性能，其AUC为0.978(附图4a)。因此，在32例SLE患者中，通过联合模型计算的每个受试者诊断SLE的概率在治疗前后没有差异(附图4b)。

图4. 肠道病毒组和细菌组对SLE的诊断价值。

条形图展示了通过随机森林模型获得的最能区分SLE患者和健康对照的(a)肠道病毒属或种和(b)肠道细菌。每条柱的颜色代表每个分类单元的病毒科或细菌门。(c-e)基于肠道病毒标志物(c)、肠道细菌标志物(d)和两类标志物联合(e)的随机森林模型区分SLE患者和健康对照的ROC图。在每个ROC图中，黑色折线表示实际的ROC，周围的蓝色区域表示95％置信区间。  

3. 用未治疗SLE患者的肠道VLPs治疗可诱导IFN-α的产生

为了研究SLE患者肠道病毒组紊乱的临床相关性，研究人员分析了肠道病毒样颗粒(VLPs)诱导IFN-α(SLE中一种致病因子)的能力。为此，研究人员分别混合了随机10个未治疗SLE患者和随机10个健康对照的肠道VLPs，并将其感染Caco-2细胞。Caco-2细胞是一种人直肠腺癌细胞系，在解剖学和功能上与肠上皮细胞相似，具有产生IFN-α的能力。与健康对照组相比，未治疗SLE患者的肠道VLPs诱导的Caco-2细胞中IFN-α的mRNA和蛋白水平显著增加（P<0.001和P=0.004，图5a）。有趣的是，在患者接受了皮质类固醇和/或免疫抑制剂治疗后，SLE患者VLPs诱导Caco-2细胞中IFN-α表达的能力显著降低(图5a)，与健康对照VLPs诱导的IFN-α表达量相当。相比之下，未治疗SLE患者、治疗SLE患者或健康对照的肠道VLPs在诱导细胞死亡方面差异不大(附图5a)，表明SLE VLPs诱导的IFN-α表达上调不是由于细胞死亡的改变。

然后，研究人员进一步用肠道VLPs混合物刺激人体外周血中的不同免疫细胞。结果显示，与HCs相比，未治疗SLE患者的VLPs诱导中性粒细胞、T细胞和B细胞中IFN-α mRNA和蛋白水平显著更高(图5b)。与在Caco-2细胞中观察到的结果类似，治疗后SLE VLPs刺激的中性粒细胞和T细胞中IFN-α mRNA和蛋白水平低于治疗前。然而，这三组肠道VLPs感染的单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞中IFN-α mRNA水平有相似的趋势，但不具有统计学意义(附图5b)。综上所述，未治疗SLE患者的肠道VLPs在诱导IFN-α产生方面具有更强的能力，而在治疗后恢复到正常水平，这表明SLE肠道病毒组的这种促炎特性与疾病活动有关。

图5. SLE患者和健康对照组的肠道VLPs感染上皮细胞和免疫细胞。

(a)未感染肠道VLPs(mock)或感染了健康对照组、未治疗SLE患者或治疗后SLE患者肠道VLP的Caco-2细胞中IFN-α mRNA水平以及上清液中IFN-α的蛋白质水平。(b)未感染肠道VLP(mock)或感染了健康对照组、未治疗SLE患者或治疗后SLE患者肠道VLP的外周血中性粒细胞(左)、T细胞(中)和B细胞(右)中IFN-α mRNA水平以及上清液中IFN-α的蛋白水平。每组IFN-α mRNA水平是相对于mock组计算的。数据表示生物学重复的平均值±标准差(n = 3)。采用双尾非配对Student t检验。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。  

讨论

在本研究中，研究人员表征了未接受治疗的SLE患者肠道VLPs的病毒组特征，其特征是噬菌体相对于真核病毒数量异常增多，且具有潜在临床相关性的噬菌体受到扰动。肠道病毒组与肠道细菌组紧密相关，表明SLE患者肠道中两种生态群落之间存在动态平衡。将病毒标志物与SLE相关肠道菌群中的细菌标志物结合，可以提高SLE诊断模型的准确性。重要的是，研究人员发现SLE相关肠道VLPs具有异常的干扰素刺激倾向，表明异常肠道病毒组可能参与SLE发病机制。

与肠道细菌组不同，通过α和β多样性评估，与健康对照组相比，SLE患者的肠道病毒组在群落水平或在皮质类固醇和/或免疫抑制剂治疗前后没有显著变化。然而，已有研究证明，健康人群中肠道病毒组的异质性高于肠道细菌组的异质性，所以这些结果并不一定意味着SLE相关肠道病毒组没有发生群落水平的变化。因此，研究SLE病毒组可能需要更大和更全的样本量来识别群落水平的差异。此外，肠道病毒组比肠道细菌组对宿主相关的内在和外在协变量有更高的响应性，这可能是其个体异质性高的原因。

作者还发现，在未经治疗的SLE患者的肠道病毒组中，噬菌体(肠道病毒的主要成分，可以感染细菌)相对丰度增加。该SLE队列中改变的病毒分类单元也大多是噬菌体。同样，在易患1型糖尿病的儿童中，随着时间的推移，发生变化的主要是噬菌体而不是真核病毒。此外，已有研究证明，噬菌体疗法在治疗一些病原体对抗生素有耐药性的细菌感染方面有效。考虑到失调的肠道细菌组与SLE发病有关，通过噬菌体疗法调节肠道细菌可能有治疗SLE的潜力。

据报道，在系统性红斑狼疮患者和健康对照组的肠道病毒群分类差异中，在SLE患者中富集的Drulisvirus能定植Klebsiella pneumoniae，并通过溶解成熟的生物膜来限制其感染。虽然在肠道中未见报道，但在SLE患者的皮肤病变中Klebsiella pneumoniae丰度降低。在SLE患者中富集的Staphylococcus phage phiRS7，其丰度与SLEDAI、ESR、CRP水平呈正相关，而其宿主Staphylococcus在SLE皮损处丰度增加，其唾液丰度也与SLEDAI呈正相关。crAss-样病毒是人体肠道中最丰富的病毒之一，在SLE患者中被发现显著减少，与类风湿性关节炎或炎症性肠病患者中观察到的结果一致，表明crAss-样病毒在这些自身免疫/炎症性疾病中可能具有有益作用。由于对人体微生物群和SLE的认识有限，目前很难就特定病毒在SLE发病机制中的作用得出确切的结论。未来的功能研究，至少在疾病模型中，迫切需要获得对肠道病毒组的机制见解。

从功能上讲，作者发现SLE肠道病毒组与促进IFN-α的产生之间存在联系，IFN-α是I型干扰素(IFN-I)的主要成分，具有抗病毒作用。在SLE中，IFN-I信号通路的持续激活促进自身抗体的产生、细胞死亡和器官损伤，这是一个关键的致病特征。在本研究中，作者发现SLE肠道VLPs诱导上皮细胞和原代人类免疫细胞中IFN-α显著升高，特别是在中性粒细胞、T细胞和B细胞中。有趣的是，有效治疗后，SLE VLPs的干扰素刺激特性减弱，表明其与SLE疾病活性同时变化。

通常，当人类细胞在病毒感染过程中通过模式识别受体（PRRs）感知真核病毒（如病毒RNA或DNA）的病原体相关分子模式（PAMP）时，诱导IRF3和IRF7等转录因子，下游IFN-I系统随之激活。有趣的是，宿主为细菌的噬菌体也可以直接驱动哺乳动物细胞产生IFN-α。例如，白细胞可以内吞能够感染铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的丝状噬菌体，并通过刺激TLR3（一种PRR）来驱动IFN-α的产生。在这种情况下，SLE患者粪便VLPs中失调的真核病毒和噬菌体都可能通过PAMP-PRR识别等机制参与促进IFN-α的产生。几种葡萄球菌和乳球菌噬菌体富集于SLE患者的肠道VLPs中，而已有研究表明葡萄球菌和乳球菌可以激活人体细胞中的IFN-I，这可能与它们所含的噬菌体有关。胃肠道IFN-α过量产生的确切SLE相关病毒贡献者值得进一步探索。

综上所述，本研究表明，SLE患者的肠道病毒组也受到干扰，这加强了在自身免疫性疾病中同时分析肠道病毒组和细菌组的重要性。本研究进一步表明，SLE中肠道病毒组失调可以激活IFN-I反应，从而为SLE发病机制提供了新的见解。对人体不同部位病毒群落的深入研究有望深入了解紊乱微生物群在SLE发病中的作用，这可能有助于开发未来的生物标志物和治疗方法。

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