新角度：基于中性粒细胞胞外陷阱相关泛癌分析可发12+！

导语

中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)最初被认为是由中性粒细胞形成的，作为一种防御机制来捕获入侵的微生物。越来越多的研究表明，NETs在肿瘤的进展和扩散中起着关键作用。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者基于从多项研究中收集的69个NETs初始生物标志物的表达水平，使用最小绝对收缩和选择算子(LASSO) Cox回归模型构建了19个基因的NETs评分。文章发表在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上，影响因子为12.469，文章题目为：A signature for pan- cancer prognosis based on neutrophil extracellular traps。

数据介绍

本研究从相关文献中搜集了69个基因作为 NETs- 签名训练的初始生物标记物。

本研究从由四个独立平台组成的不同数据集中收集了泛癌数据：癌症基因组图谱程序（TCGA，n=8739）、中国胶质瘤基因组图谱（CGGA，n=651）、乳腺癌国际联盟分子分类学（ METABRIC，n=1868）和 Gene Expression Omnibus（GEO，n=2459）。

技术路线          

本研究技术路线如图所示。  

结果解析 

01   鉴定泛癌的19基因NETs相关特征  

本研究首先将69个NETs-初始生物标志物输入TCGA泛癌训练集中的LASSO回归分析（图1A），得到24个非零系数的NETs相关基因。随后，对这些基因进行了成对相关分析，结果发现其中一些基因具有相似的表达模式（图 1B）。其中CTSG与SELP、IL-6与IL-8、IL-6与FRP2、TLR4与FPR1、FCGR3B与FPR1、FCGR3B与FPR2、FPR1与FPR2的相关系数高于其他组，因此，本研究去除了 CTSG、IL-6、TLR4、FPR1 和 FCGR3B，并使用剩余的 19 个 NET 相关基因进行进一步的模型构建。

图 1

Cox 回归分析应用于 19 个 NETs 相关基因，并得出基于其标准化表达水平的分数（NETs 分数）。本研究还观察了每个基因对预后的风险比 (HR)（图 1C），结果发现MPO 作为 NETosis 倾向的重要代表，参与了该模型。

注：DNA 染色质通过瓜氨酸化解聚，然后从与瓜氨酸化组蛋白和含有颗粒酶的中性粒细胞胞质内容物复合的细胞中排出，这被称为“NETosis”

02   癌症中NETs评分的全景图  

NETs评分显示出明显的器官特异性 ，因为起源于脑和胃肠道的肿瘤通常具有较高的NETs评分，而来自某些分泌腺的肿瘤，例如前列腺癌、甲状腺癌和乳腺癌浸润性癌（BRCA），通常有较低的NETs评分（图 2A）。TCGA训练队列中的患者根据NETs评分是否高于人群中位数被分为高风险组或低风险组。与低风险组相比，具有较高 NETs 评分的泛癌患者与各种不良生存指标相关，包括 DSS、总生存期 (OS) 和无进展间期 (PFI)（图 2C）。用于表征 NETs 评分对各种预测预后的影响的单变量 Cox 分析的结果表明，NETs 评分与大多数类型癌症的不良预后相关（图 2B）。

图 2

为了检验签名的有效性和通用性，本研究首先在 TCGA 测试系列中验证了 NETs 评分的预后效果。与训练集结果一致，测试队列中患者的生存分析表明，较高的 NETs 分数对应较差的进展（图 2D）。本研究观察到 NETs 评分对多种肿瘤的预后具有非常强大的预测能力（图 2E），包括 KIRC、COAD和 LUAD，对于 NETs 评分相对较低的 BRCA，NETs 评分的预后预测值无法在测试队列中重现。本研究还发现 NETs 评分对同一器官的癌症有不同的影响，因为它与 LUAD 患者的不良预后显著相关，但对肺鳞状细胞癌 (LUSC) 患者没有影响，即使后者有NETs 得分高于前者（图 2B），这表明 NETosis 在肿瘤进展中的作用不仅受其宿主器官的影响，还与肿瘤的性质有关。

03   在其他独立数据集中验证NETs相关签名  

为了进一步确认 NETs 评分的预后价值，本研究将其应用于多个外部验证队列并获得了相似的结果。本研究从 CGGA 数据库中获得了 651 名神经胶质瘤患者的 mRNA 矩阵和临床信息，证明了 NETs 评分较高的神经胶质瘤患者预后较差，尤其是对于那些具有高级别疾病（III 级或 IV 级，图 3A）的患者。外部验证表明 NETs 评分不是乳腺癌可靠的预后预测指标，因为它在八个验证数据集中的七个中并不显著（图 3B），这与 TCGA 队列的验证结果一致。本研究收集额外的 NSCLC 数据集以确认 NETs 评分对 LUAD 和 LUSC 患者的不同预后影响。同样发现了 NETs 评分与 LUAD 患者的预后显著相关（图 3C），但与 LUSC 患者无关（图 3D）。

图 3

04   基于NETs评分建立临床预测泛癌生存期的列线图  

为了提供一个可读和定量的测量NETs特征，以临床预测不良事件的概率，本研究构建了一个综合列线图， 该图结合了 NETs 评分和几个临床病理学特征，包括患者的年龄和癌症类型（图 4A）。3 年 DSS 的校准曲线绘制在图 4B 中，几乎与标准曲线重合，一条通过坐标轴点的斜率为 1 的直线，表明诺模图特征非常接近实际生存概率。如图 4C 所示，本研究发现诺模图预测的 AUC 在训练集和测试队列中优于单独的 NETs 得分，表明诺模图签名的预测效率将综合多种临床因素后更好。此外，本研究发现单独的 NETs 评分和综合诺模图的净收益 (NB) 均高于 0，DCA 临床评估中的最大 NB 大于 15%（图 4D、E），表明NETs评分配合其他临床特征对预后预测的重要性。

图 4

05   NETs特征和肿瘤的恶性特征  

为了研究 NETosis 与肿瘤恶性特征之间的联系，本研究通过 z-score 算法量化了肿瘤在 NETs 促进、血管生成、EMT 和细胞周期中的能力 。结果发现在整个 TCGA 泛癌队列（图 5A-C）或大多数肿瘤类型（图 5D、E）中 NETs z-score与血管生成z-score、EMT z-score 和细胞周期z-score之间分别存在显著的正相关。换句话说，具有促进 NETosis 的强大潜力的肿瘤通常伴随着微环境中更活跃的血管生成和更具侵袭性的肿瘤细胞，这表明，肿瘤微环境中NETosis发生得越活跃，恶性细胞的活动就越活跃。

图 5

06   临床队列中NETs相关基因的再现  

基于几种转录本的表达水平，本研究构建了NETs评分来评估肿瘤中的NETostic潜能。为了更好地阐明NETosis与患者预后之间的关系，本研究将两种典型的NETosis标记物MPO和H3Cit纳入了涉及肿瘤类型的IHC验证，不仅包括KIRC、LUAD和COAD，其中NETs评分与患者预后显著相关，还包括不相关的TNBC样本。经证实，MPO 的染色模式主要在肿瘤浸润基质细胞的细胞质中强烈且清晰（图 6A），这在邻近的正常组织中非常罕见。因此，本研究采用 MPO+ 细胞在基质细胞中的比例得分（MPO 得分）来衡量肿瘤组织中的 NETosis 程度。结果表明，MPO 评分可以对 COAD、KIRC 和 LUAD 患者的结局进行分层（图 6B-D），但对 TNBC 患者的结局不显著（图 6E）。本研究对所有可用的临床指标进行单变量Cox分析，如性别、年龄、肿瘤、淋巴结、转移（TNM）分期、病理分化等，具有统计学意义的纳入后续多因素Cox回归分析，结果如森林图所示，MPO 评分是影响 COAD 和 KIRC 患者预后的独立因素（图 6F、G）。然而，本研究发现 MPO 评分与 LUAD IHC 队列中的 TNM 分期显著正相关，因此它不是多因素 Cox 模型中的独立预后因素（图 6H）。

图 6

小编总结

本研究发现肿瘤组织的 NETs 形成潜能与多种恶性特征高度协调，与泛癌患者的临床结局相关，评估和靶向肿瘤病变中 NETs 的形成可能有助于癌症的个性化治疗。本研究也有几个局限性。首先，评估的 NETs 代表基因的数量很少。此外，本研究仅验证了几种癌症类型，并且每个肿瘤组的样本数量有限。最后一点是，虽然 MPO 是 TAN 的可靠标记，但它不足以全面评估 NETosis，应与其他标记（如 H3Cit）结合使用。

本研究从中性粒细胞胞外陷阱的角度利用公共数据对泛癌进行了分析，分析思路和分析结果都值得我们学习！