第二代mRNA疫苗

和第一代mRNA疫苗相比，第二代疫苗着力改善效率低下问题，提升安全性、有效性。第二代mRNA疫苗优化制剂工艺，使其容易在室温下稳定保存，保持效力和安全性，减少对冷链依赖。

冻干mRNA疫苗

通常，mRNA脂质纳米颗粒（LNPs）疫苗必须在零度以下保存，以保持稳定性和有效性。使用冷链运输储存疫苗限制了在经济落后国家和新兴经济国家疫苗的可及性。

当LNPs作为水悬浮液存储时，由于观察到的物理和化学不稳定性，长期稳定性是LNPs开发的一个主要问题。

降解

化学降解包括mRNA分子中的化学键的改变，主要是水解和氧化。LNP中脂质的降解也会导致水解和氧化。

物理降解包括变性/聚集（二级和三级结构的丢失）、融合和被封装的mRNA的泄漏。LNP中脂质的降解也会导致水解和氧化。

水解主要发生在磷酸二酯键((mRNA分子的主干)。

氧化 会影响mRNA的碱基和糖基。氧化导致mRNA链的断裂、碱基的裂解和二级结构的改变，从而阻止抗原在体内的翻译。此外，LNPs储存过程中的脂质结晶和脂质多态转化导致了泄漏或药物排出。

储存条件是强烈影响mRNA-LNP疫苗稳定性的一个关键参数。mRNA-LNPs的长期存储尚未得到充分的探索。在长时间储存过程中，mRNA-LNPs可能发生结构变化。

由于mRNA-LNPs的降解反应是由水的存在引起的，因此冻干是一种广泛使用的干燥技术，用于包括mRNA-LNPs在内的纳米颗粒的长期存储，冻干mRNA疫苗可以方便地运送往世界各地，而不需要冷冻。

由于mRNA-LPN疫苗是由特定浓度和特定类型脂质制备的，因此在冻干和随后的储存过程中保留颗粒大小、多分散性和包封效率等物理化学参数是很重要的。因此，仔细选择冻干工艺参数、缓冲液、低温和溶液保护剂对确保稳定效果至关重要。

不同冻干保护剂的保护性能（Biol. Pharm. Bull. 2018）

冻结过程中的各种应力会影响LNPs的稳定性，包括晶体形成、界面效应、冻结浓度、缓冲液pH变化和相分离。

冷冻过程中晶体的形成了冰-液界面，从而导致蛋白质分子的胶体结构，包括mRNA。冻结增加了剩余液体部分中溶质物质的浓度，促进了颗粒间的相互作用，并导致颗粒聚集。

冻结浓度增加了脂质双分子层的渗透压，给膜施加物理应力，并导致膜破裂。此外，由于选择性的溶质渗透性，渗透稳定性取决于脂膜的组成。

核苷修饰 的mRNA-LNPs可以冻干，在室温12周和4◦C储存至少24周后，mRNA的物理化学性质（颗粒大小、封装效率）没有显著变化。然而，冻干核苷修饰的mRNA-LNPs在4◦C和25◦C下保存时，其RNA完整性分别下降了10-15%和30%。

水替代 假说和脱硝化作用是低温和溶酶保护剂（糖）在冻干过程中稳定生物系统的两种机制。据报道，海藻糖作为一种溶保护剂，在冷冻干燥过程中以及随后在−80、5、25和40◦C储存中可以稳定mRNA-鱼精蛋白复合物配方。存储期间分析的质量属性，包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压，均符合RNA药物的质量（稳定、安全）稳定性规范（WO2016165831A1）。

蔗糖 也是一种合适的低温保护剂，用于稳定ss可切割的质子活化类脂物质（fSS-cleavable proton-activated lipid-like material，ssPalm），这是LNPs的一个组成部分。通常，在冻结过程中，相互混溶性较低的分子会导致相分离，粒子会通过相互碰撞发生聚集/聚结。蔗糖与聚乙二醇（PEG）聚合物的LNP表面具有较高的混溶性。LNP表面蔗糖和聚乙二醇层之间的优先相互作用使颗粒稳定。

糖与磷脂头基团的相互作用降低了干燥状态下脂膜的熔化温度。糖减少了磷脂酰基链之间的范德华相互作用，并保持了头基间距。因此，糖减少了水和磷脂之间的相互作用，然后取代了水。

在无水条件下， 糖是水很好的替代品 。在脂质双分子层表面的糖和脂质之间形成多个氢键，而不改变脂质双分子层的结构。糖可以同时与不同的脂质相互作用，与磷脂极性基团（P=O和/或C=O）和脂质胆碱部分的甲基相互作用。

在玻璃化过程中，糖溶液在冷冻过程中变成冷冻浓缩，去除水后形成稳定的玻璃基质，具有低迁移率和高粘度的玻璃基体可以保护脂质双分子层免受冰晶引起的损伤。此外，糖玻璃基质抑制了脂质相变介导的构象变化。渗透效应和体积效应是玻璃化过程中的两个关键特性，当脂膜聚集在接近时，它们通过阻止相邻的双分子层的紧密接触来减少机械应力。

聚合物纳米载体疫苗

通常，与脂质载体类似，用于mRNA传递的聚合物载体利用静电引力（在聚合物的正电荷和mRNA的负电荷之间）进行mRNA多聚体的自组装。

mRNA多聚体由于其在雾化后结构的恢复，在 粘膜疫苗 接种的探索中很有吸引力。与脂基体系相比，mRNA多聚物形成更刚性的超分子结构，具有高分子量和较慢的聚合物链迁移率，这提供了优越的稳定性。

聚（乙烯亚胺） 已广泛用于mRNA疫苗的递送。多聚（乙烯亚胺）结构的优化提供了较高的基因转染效率。聚（乙烯亚胺）的性质，如在较宽的pH范围内的缓冲容量和在低pH范围内较高的氨基质子化比，有助于核酸络合。尽管聚（乙烯亚胺）的疗效极好，但其应用受到其毒性和与带负电荷的血清蛋白的相互作用的限制，从而导致蛋白质聚集。将聚乙二醇纳入配方，使用低分子量聚分子形式(聚乙烯亚胺约2kDa)、环糊精偶联和二硫键是一些可以减轻聚乙烯亚胺毒性的策略。

低分子量聚乙烯亚胺 已被用于将HIV-gag mRNA疫苗研究。在体内皮下注射后，形成的mRNA-低分子量聚乙烯亚胺复合物具有诱导抗原特异性免疫反应的潜力。鼻内注射一种基于2 kDa聚乙烯亚胺的mRNA疫苗，成功地传递了一种mRNA（编码的HIV gp120抗原），并诱导了系统免疫应答。人合成β-环糊精（β-CD）和支链聚乙烯亚胺（2 kDa）偶联物，用于传递mRNA疫苗。形成的复合物有效地封装mRNA，通过质膜从核内体逃逸提供高转染效率。

除聚乙烯亚胺外，其他聚合物载体，如聚（-氨基酯）、壳聚糖、聚酰胺胺和聚（2-丙基丙烯酸）也进行了研究。

聚（-氨基酯）s，一种可生物降解的聚合物，通过形成超支枝的树状球形大分子，有效地形成mRNA复合物。

以壳聚糖（CS）为基础的纳米颗粒在逃逸核内体的有限能力阻碍了mRNA的传递。壳聚糖是一种由几丁质衍生的生物相容性阳离子生物高聚物，可与核酸发生静电相互作用，并可进行化学修饰。电荷密度或去乙酰化程度、分子量和胺磷酸比（N：P）是壳聚糖的参数，它们会影响基于siRNA-CS的体系的转染效率。虽然壳聚糖纳米颗粒在体外和体内的传递效率很高，但其胶质稳定性和内吞体逃逸潜力不如脂质纳米颗粒传递mRNA。

聚酰胺（PAMAM） 树状大分子具有高度支化（丙烯酸甲酯和乙二胺，末端是胺和羧基末端）阳离子聚合物，具有生物相容性，允许被核酸包裹，用于RNA疫苗递送。改良的树突状分子纳米颗粒可以对广泛的致命病原体提供保护性免疫，包括H1N1流感病毒和埃博拉病毒。结果表明，修饰的树突状分子纳米颗粒通过在一系列疾病模型中在小鼠中提供多种抗原来诱导保护性免疫反应。

Poly（ε-己内酯） 是一种很有吸引力的聚合物，已获FDA批准。由聚（ε-己内酯）组成的纳米颗粒具有低体内外毒性，在生物液体中的高胶体稳定性，封装货物的受控释放，以及良好的细胞摄取。

参考资料

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来源：闲谈 Immunology 2023-03-22