科研丨郑大一附院: 系统性红斑狼疮患者口腔微生物群的变化(国人佳作)

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   目前对系统性红斑狼疮(SLE)患者口腔微生物群的变化的研究较少。本研究旨在比较SLE患者和健康对照者的口腔微生物组特征，并基于口腔微生物组构建SLE分类器。对未接受治疗SLE患者(n=182)和匹配健康对照组(n=280)个体的舌苔样本进行测序。对口腔微生物组进行了表征，在推导队列中构建了微生物分类器，并在验证队列中验证了结果。此外，对治疗后SLE患者(n=73)的口腔微生物组进行了表征。结果表明，SLE患者口腔微生物多样性增加，SLE患者与健康对照的微生物群落存在差异。SLE患者中Prevotella和Veillonella富集，Streptococcus和Porphyromonas减少。此外，27种预测的微生物功能有所增加，而34种其他功能减少。鉴定出39个操作分类单元(OTUs)与7个临床指标相关。筛选出了两个OTUs来构建分类器，其在推导组、验证组和跨区域验证组中的曲线下面积分别为0.9166(95% CI 0.8848–0.9483，p<0.0001)、0.8422(95% CI 0.7687–0.9157，p<0.000)和0.8406(95% CI 0.9677–0.9135，p<0.00001)。此外，随着疾病活动性的增加，Abiotrophia和乳杆菌增加，而Phyllobacterium和unclassifiedMicrococcaceae减少。最后，选择了9个OTUs来构建区分治疗后SLE患者与健康对照组的分类器，其诊断有效性为0.9942(95% CI 0.9884–1，p<0.0001)。综上所述，本研究全面表征了SLE患者的口腔微生物组，并揭示了口腔微生物组作为SLE无创诊断生物标志物的潜力。    

论文ID

原名：Alterations in the human oral microbiota in systemic lupus erythematosus

译名：系统性红斑狼疮患者口腔微生物群的变化

期刊：Journal of Translational Medicine

IF：8.44

发表时间：2023.2

通讯作者：刘升云，余祖江，任志刚

通讯作者单位：郑州大学第一附属医院

DOI号：10.1186/s12967-023-03892-3

实验设计

结果

1 研究设计和参与者特征

从中国不同地区前瞻性地收集了563份舌苔样本。经过严格的排除和诊断程序，对535个舌苔样本进行了分析，其中包括来自郑州的213名SLE患者(140名未接受治疗患者和73名治疗后患者)、来自郑州的280名HC和来自海口的42名未接受治疗SLE患者。基于随机数表，将郑州的未接受治疗样本随机分为推导队列(100 SLE vs. 200 HC)和独立验证队列(40 SLE vs. 80 HC)。在推导队列中进行了口腔微生物组的表征、关键微生物标志物的鉴定和SLE分类器的构建。在独立验证和跨区域验证队列中验证了SLE分类器的诊断有效性(海口42 SLE vs 80 HC)。进一步根据SLE疾病活动指数(SLEDAI)将来自郑州的140名SLE患者分为三组，并对这三组的口腔微生物组进行了表征。最后，我们比较了73名治疗后SLE患者和146名HC的口腔微生物组(图1)。

在推导队列和验证队列中，SLE和HC的性别、年龄和BMI匹配。与HC相比，SLE患者血清白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板和淋巴细胞计数显著降低，血清球蛋白水平明显升高，详情信息见表1。

图1. 研究设计和流程图。前瞻性地收集了来自中国不同地区的563个舌苔样本。经过严格的诊断和排除程序，共纳入535份舌苔样本进行分析，其中包括来自郑州的213名SLE患者(140名未接受治疗患者和73名治疗后患者)、来自郑州的280名HC和来自海口的42名未接受治疗SLE患者。根据随机数表将来自郑州的未接受治疗样本随机分为推导队列和验证队列。推导队列用于表征SLE的口腔微生物组，识别关键微生物标志物，并构建SLE分类器。验证和跨区域验证队列用于评估分类器的诊断效果。进一步分析了73名治疗后SLE患者和146名HC的口腔微生物组。HC健康对照，SLE系统性红斑狼疮，RFC随机森林分类器模型。

表1. 参与者的临床特征。

SLE 系统性红斑狼疮，HCs 健康对照，F 女性，M 男性，BMI 体重指数，WBC 白细胞计数，RBC 红细胞计数，Hb 血红蛋白，Plt 血小板计数，Lyn# 淋巴细胞计数，Glb 球蛋白，C3 补体C3，C4 补体C4。a SLE和HCs之间的比较。b推导队列与验证队列中SLE之间的比较。

2 SLE患者口腔微生物多样性增加

在推导队列中，稀疏度分析显示，两组OTUs丰富度几乎达到饱和，SLE较HC显著增加(图2A)。稀疏度分析结果如附加文件1所示：图S1；通过Shannon和Simpson指数测量，与HC相比，SLE患者的口腔微生物多样性显著增加(均p<0.001)(附加文件2：数据S1，图2B，C)。

此外，进行了β多样性分析，以显示每个样本之间的微生物组空间。通过NMDS和PCoA分析估计，两组之间的OTUs分布有显著差异(图2D，E，附加文件1：图S2)。维恩图显示了SLE和HC之间OTUs的重叠。共有709个共享OTUs，而70个OTUs是SLE特有的(图2F)。两组间关键的46个OTUs如附加文件1所示：图S3；(附加文件2：数据S2)。值得注意的是，24个OTUs在SLE中显著富集，22个OTUs在HC中显著富集。

图2. SLE患者口腔微生物多样性增加。A，样本数量和OTUs数量之间的稀疏分析。随着样本量的增加，SLE(n=100)和HC(n=200)的OTUs数量接近饱和。与HC相比，SLE患者OTUs数量显著增加。B，通过Shannon指数测量，与HC(n=200)相比，SLE(n=100)的口腔微生物多样性显著增加(p<0.001)。C，通过Simpson指数测量，与HC(n=200)相比，SLE(n=100)的口腔微生物多样性显著增加(p<0.001)。D，通过NMDS分析估计，SLE(n=100)和HC(n=200)之间的OTUs分布存在显著差异。E，根据PCoA估计，SLE(n=100)和HC(n=200)之间的OTUs分布存在显著差异。F，Venn图显示，832个OTUs中有709个在两组中共享，而70个OTUs是SLE特有的(n = 100)。***p<0.001。HC健康对照，SLE系统性红斑狼疮，OTU操作分类单元，NMDS非计量多维标度，PCoA主坐标分析。

3 SLE患者口腔微生物组的系统发育特征

在推导队列中，比较了SLE和HC口腔微生物群的分类组成和变异。在门和属水平上，每个样本中口腔微生物分类群的相对丰度见附加文件1：图S4和S5(附加文件2：数据S3和S4)，两组分类群的平均组成和相对丰度分别如图3A和3C所示。拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是两组中最占优势的三个门。

进一步分析了细菌丰度，以确定两组之间关键的差异丰度细菌。如图3B所示，与HC相比，SLE患者表现出六个门的丰度增加，包括拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、Patescibacteria、Campilobacterota和Cyanobacteria，而变形菌门、放线菌门和未分类细菌的丰度降低(p<0.05)(附加文件2：数据S5)。图3D显示，在属水平上，SLE中观察到28种细菌的丰度增加，包括普雷沃氏菌属(Prevotella)、Veillonella、Leptotrichia、Alloprovotella和Lachnoanaerobaculum，22种细菌的丰度下降，包括链球菌(Streptococcus)、卟啉单胞菌(Porphyromonas)、Rothia、Haemophilus和Granulicatella(p<0.05)(附加文件2：数据S6)。此外，我们还在纲、目和科水平上分析了两组的口腔微生物群落。每个样本中分类群在纲水平上的组成和丰度如附加文件1：图S6所示，而在目水平和科水平上分别如附加文件1中：图S9和图S12所示。在纲水平上，拟杆菌和γ‐变形菌纲的相对丰度相对较高，在HC和SLE中均达到50%以上(附加文件1：图。S7)；在目水平上，Bacteroidales、Burkholderiales和Fusobacteriales在两组中的相对丰度较高(附加文件1：图S10)；而在科水平上，Prevotellaceae、Neisseriaceae和Veillonelliaceae在两组中的相对丰度较高(附加文件1：图S13)。在纲水平上，与HC相比，SLE有8个细菌种群显著富集(例如，Cyanobacteriia、Coriobacteriia和Campylobacteriia)，4个细菌种群明显减少(例如，Actinobacteria、Bacilli和Gammaproteobacteria)(附加文件1：图S8和附加文件2：数据S7)；在目水平上，SLE有13个细菌种群显著富集(例如，Campylobacterales、Flavobacteriales和Pseudomonadales)，12个细菌种群明显减少(例如，Micrococcales、Pasteurellales和Staphylococcales)(附加文件1：图S11和附加文件2：数据S8)；而在科水平上，SLE有17个细菌种群显著富集(如Campylobacteraceae、Sphingomonadaceae和Chloroplast)，18个细菌种群明显减少(如Micrococcaceae、Pasteurellaceae和Porphyromonadaceae)(附加文件1：图S14和附加文件2：数据S9)。

图3. SLE口腔微生物组的系统发育分析。A，两组细菌群落在门水平上的平均组成和相对丰度。B，与HC相比，SLE患者的六个门丰度增加，三个门丰度下降。C，两组细菌群落在属水平上的平均组成和相对丰度。D，与HC相比，SLE患者的28个属丰度增加，22个属丰度下降。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。HC健康对照，SLE系统性红斑狼疮。

4 SLE相关的关键细菌和微生物功能

为了确定导致SLE患者口腔微生物群改变的特殊细菌和关键细菌类群，进行了LDA和LEfSe分析，以确定SLE和HC之间的差异。揭示不同细菌分类群系统发育谱的分支图显示了两组之间的分类群最大差异，这意味着SLE患者口腔微生物群失调(附加文件1：图S15，附加文件2：数据S10)。在属水平上，根据LDA选择，SLE和HC之间存在显著差异。如图4A所示，与HC相比，SLE中Prevotella、Leptotrichia、Veillonella、Alloprevotella和Megasphaera等20个属的丰度增加，15种细菌的丰度降低，包括Bacteria_unclassified、Micrococcaceae_unclassified、Gemella、Bacilli_unclassified、和Pasteurellaceae_unclassified(p<0.01)(附加文件2：数据S11)。

两组之间的功能谱和关键微生物功能如附加文件1:图S16所示，表明SLE中功能模式的失调。与HC相比，SLE患者的27个功能模块(包括袢霉素生物合成、精氨酸和鸟氨酸代谢、组氨酸代谢)显著增加，而34个功能模块(包括氨基苯甲酸降解、不饱和脂肪酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢)显著减少(均p<0.05)(图4B，附加文件2：数据S12)。通过Spearman相关分析进一步分析了口腔微生物组与SLE临床数据之间的相关性。如图4C和附加文件1所示：39个OTUs与7项临床指标相关，包括性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、淋巴细胞计数和球蛋白(附加文件2：数据S13)。

图4. 与SLE相关的关键细菌和微生物功能。A,口腔微生物组中与SLE相关的关键细菌。基于LDA选择，与HC(n=200)相比，SLE(n=100)中20个属显著富集，而15个属显著减少(均p<0.01)。B,与SLE相关的关键微生物预测功能。基于LDA选择，与HC(n=200)相比，SLE(n=100)中27种预测的微生物功能显著增加，而34种功能显著降低(均p<0.05)。C，39个OTUs的相对丰度与临床指标(性别、年龄、WBC、Hb、Plt、Lym和Glb)的距离相关图。HC健康对照，SLE系统性红斑狼疮，LDA线性判别分析，WBC白细胞，Hb血红蛋白，Plt血小板计数，Lym淋巴细胞计数，Glb球蛋白。 

5 口腔微生物标志物对SLE的诊断潜力

为了评估口腔微生物标志物对SLE的诊断潜力，建立了一个随机森林分类器模型，以区分推导组中的SLE和HC。共有两个OTU标记被鉴定为最优标记集，包括OTU49(鞘氨醇单胞菌)和OTU71(放线菌)(图5A，5B)。每个样本中两个OTU标记的相对丰度显示在附加文件2:数据S14中。然后利用这两个OTUs计算推导组中每个样本的POD值(附加文件2:数据S15)。如图5C和5D所示，SLE患者的POD值高于HC(p<0.05)，其AUC为0.9166(95% CI 0.8848-0.9483，p<0.0001)，这意味着基于口腔微生物标志物的分类器在区分SLE和HC方面具有强大的诊断潜力。

此外，使用独立验证和跨区域验证组对SLE微生物标志物模型的诊断效率进行验证。附加文件2:数据S16和S17显示了两组中每个样本中两个OTU标记的相对丰度。图5E和5G显示，在独立验证组和跨区域验证组中，SLE的POD值显著高于HC(均p<0.05)(附加文件2:数据S18和S19)。独立验证组和跨区域验证组POD的AUC值分别达到0.8422(95% CI 0.7687-0.9157，p<0.0001)和0.8406(95% CI 0.7677-0.9135，p<0.0001)，这验证了基于口腔微生物标志物的分类模型对SLE的诊断潜力。

图5. 口腔微生物标志物对SLE的诊断潜力。A，通过五倍交叉验证，通过随机森林模型选择了两个细菌标记作为最佳标记集。B，模型中所选微生物标记的重要性分布图。C，推导队列中SLE(n=100)的POD值显著高于HC(n=200)。D，推导队列中SLE(n=100)与HC(n=200)的POD值AUC为0.9166(95% CI 0.8848–0.9483)(p<0.0001)。E，独立验证队列中SLE(n=40)的POD值显著高于HC（n = 80）（p < 0.05)。F，在独立验证队列中，SLE（n=40）与HC（n=80）之间的POD值AUC为0.8422（95% CI 0.7687–0.9157）(p<0.0001）。G，跨区域验证队列中SLE(n=42)的POD值显著高于HC(n=80)(p<0.05)。H，在跨区域验证队列中，SLE（n=42）与HC（n=80）之间的POD值AUC为0.8406（95% CI 0.7677–0.9135）（p<0.0001）。HC健康对照，SLE系统性红斑狼疮，POD发病概率，OTU操作分类单元，CI置信区间，AUC曲线下面积。

6 不同疾病活动性SLE患者的口腔微生物组变化

为了明确不同疾病活动性SLE患者中口腔微生物组的特征，将140例SLE标本分为轻度(n=68，SLEDAI≤6)、中度(n=58，SLEDAI7-11)和重度(n=14，SLEDAI≥12)疾病活动组。在这三组中，稀疏分析表明，OTU丰富度的数量随着疾病活动的增加而显著增加(图6A)。此外，分别有69个OTUs、78个OTUs和18个OTUs是具有轻度、中度和重度疾病活动性的组所特有的(图6B)。在属水平上，随着疾病活动性的增加，观察到Abiotrophia和Lactobacillales_P5D1-392的丰度增加，以及Phyllobacterium和Micrococceae_unclassified的丰度降低(p<0.05)(图6C，附加文件2：数据S20)。基于LDA分析，在严重疾病活动组中，Eubacterium_nodatum_group和Anaerovoracaceae显著富集，而在轻度疾病活动组中，Solobacterium、丹毒丝菌目和丹毒丝菌科显著富集(图6D，附加文件2：数据S21)。

图6. 不同疾病活动性SLE患者口腔微生物组的变化。A，样本数量和OTUs数量之间的稀疏分析。稀疏分析表明，随着疾病活动性的增加，三组中OTU丰富度的数量显著增加。B，Venn图显示，轻度、中度和重度疾病活动组分别有69个OTUs、78个OTUs和18个OTUs。C，在属水平上，随着疾病活动性的增加，Abiotrophia和Lactobacillales_P5D1-392富集，Phyllobacterium和Micrococceae_unclassified减少。D，基于LDA选择，轻度(n=68)和重度(n=14)疾病活动组中分别富集了2个和3个口腔微生物类群(均p<0.05)。*p<0.05；**p<0.01；OTU操作分类单元，LDA线性判别分析。

7 治疗后稳定SLE患者口腔微生物群的变化

为了评估治疗后病情稳定的SLE患者的口腔微生物群特征，进一步收集了73例治疗后SLEDAI＝0的SLE患者的舌苔样本，并与146个HC的口腔微生物群特征进行了比较。与HC相比，治疗后稳定SLE患者的口腔微生物多样性显著增加(图7A)。β多样性分析显示，两组之间的微生物组空间群落存在明显差异(图7B)。在属水平上，两组口腔微生物群的平均组成和相对丰度如图7D所示。与HC相比，在稳定SLE中观察到21种细菌的丰度增加，21种细菌丰度减少(图7C，附加文件2：数据S22)。显示前50个差异OTUs的热图显示，SLE中有22个OTUs富集，HC中有28个OTUs富集(图7E)。使用9个OTUs在73个SLE和146个HC之间建立了随机森林分类器模型，以确定口服微生物标志物对治疗后稳定SLE的诊断潜力(图7F)。SLE患者的POD估计值显著高于HC(p<0.05)(图7G，附加文件2：数据S23)，AUC为0.9942(95% CI 0.9884-1，p<0.0001)(图7H)，这表明基于口腔微生物标志物的分类器模型在区分治疗后稳定的SLE和HC方面具有强大的诊断潜力。

图7. 治疗后稳定SLE患者口腔微生物群的变化。A，样本数量与OTU数量之间的稀疏分析。随着样本量的增加，两组的OTUs数量均接近饱和，SLE(n=73)与HC(n=146)的OTU数量显著增加。通过Shannon指数测量，与HC(n=146)相比，SLE(n=73)的口腔微生物多样性显著增加(p<0.01)。B，未加权Unifrac图中，治疗后稳定SLE(n=72)和HC的口腔微生物群落的PCoA(PC1、PC2和PC3，33.61%、22.84%和13.2%)。C，与HC相比，治疗后稳定SLE患者中21个属显著增加，21个属显著减少。D，治疗后稳定SLE(n=73)和HC(n=146)中细菌群落的平均组成和相对丰度。E，治疗后稳定SLE(n=73)和HC(n=146)中各样本差异OTUs相对丰度的热图。热图显示，22个OTUs在SLE中富集，28个OTUs在HC中富集。F，选择9个OTUs作为最佳标记集，建立随机森林模型。G，SLE(n=73)的POD值显著高于HC(n=146)。H，治疗后稳定SLE(n=73)和HC(n=146)之间的POD值AUC为0.9942(95%CI 0.9884–1)(p<0.0001)。

讨论

本研究通过16S rRNA MiSeq测序全面表征了中国人群大样本中未接受治疗SLE患者的口腔微生物群。确定了与SLE相关的关键细菌和微生物功能，并研究了口腔微生物群与临床收集的SLE数据之间的相关性。值得注意的是，本研究构建了一个微生物分类器，该分类器在区分SLE和HC方面显示出强大的诊断效力，并实现了跨区域验证。此外，还分析了不同疾病活动性SLE患者的口腔微生物组。最后，分析了治疗后SLE患者口腔微生物群的变化，并确定了最佳的微生物群生物标志物。这些结果表明，口腔微生物群失调可能与SLE的发展和恢复有关，并且微生物群分类器可能具有作为无创生物标志物的潜力，在SLE诊断中有价值。 本研究发现SLE患者的口腔微生物群失调，表现为口腔微生物组多样性增加和细菌群落改变。一项研究表明，在没有牙周病的受试者中，SLE患者的口腔微生物组多样性高于HC。另一项研究观察到SLE和原发性干燥综合征患者之间口腔微生物组多样性的差异，与原发性干燥综合征患者相比，SLE患者口腔微生物组的多样性增加。Li等人发现，与HC相比，SLE患者的口腔微生物组多样性降低。然而，该研究样本量很小，并且同时纳入了未接受治疗和治疗后的SLE患者，这可能会削弱研究结果的可靠性。此外，饮食和环境可能在一定程度上促成了不同研究之间的结果差异。此外，还发现SLE和HC之间口腔微生物组的分类群组成、关键细菌和预测的微生物功能不同。Zhang等人发现，RA和HC的口腔微生物群细菌群落和丰富度存在差异。最近，我们对COVID-19患者的口腔微生物组进行了表征，发现COVID-19患者的系统发育谱、关键细菌和预测微生物功能与HC有显著差异。此外，一项研究发现，在糖尿病小鼠中，受干扰的口腔微生物群具有增强的致病性。重要的是，研究还表明肠道微生物群的紊乱可通过多种途径触发和促进SLE的自身免疫和炎症反应。这些发结果表明，SLE具有其独特的口腔微生物组，而口腔微生物群的改变可能与SLE的发生和发病有关。 特定的口腔微生物组可作为诊断标志物，这已在许多疾病中得到研究。Zhang等人使用口腔微生物群开发了一种RA诊断模型，并在独立队列中验证了其强大的诊断效力。Flemer建立了一个基于口腔微生物群的诊断模型，该模型在从HC中识别结直肠癌方面显示出高度的特异性。在这项研究中，作者开发并验证了基于口腔微生物组的两个最佳OTUs的SLE分类器。计算了推导组、独立验证组和跨区域验证组中每个样本的POD，其AUC分别为0.9926、0.9809和0.9851。这项研究首次成功地进行了基于口腔微生物群的SLE分类器，并实现了独立验证和跨区域验证，这表明口腔微生物群有可能成为SLE的一种无创诊断方法。 此外，还进行了进一步的分析，以确定SLE患者口腔微生物群与临床指标之间的相关性。该分析揭示了口腔微生物群与七项临床指标之间的密切关联。我们在前期研究中发现，肠道微生物群中特定细菌的丰度与慢性肾脏疾病的临床指标相关。Ma等人还发现自身免疫性肝炎患者肠道微生物群和血清指标之间的强相关性。另一项研究表明，SLE患者肠道微生物群的变化与临床数据之间存在显著相关性。值得注意的是，本研究的一个重要发现是，不同疾病活动性SLE患者的口腔微生物组特征不同。随着SLE疾病活动性的增加，Abiotrophia和Lactobacillus_P5D1-392的丰度增加，而Phyllobacterium和Micrococcaceae_unclassified的丰度降低。这些结果表明，口腔微生物群的改变可能与SLE的进展和加速有关。当前研究发现肠道微生物群失调可能在SLE进展中发挥作用，益生菌、饮食干预和抗生素可以部分缓解疾病活动。我们假设，针对口腔微生物群的干预措施可能会缓解疾病活动，并在未来成为一种治疗SLE的方法。 据观察，随着疾病的恢复，微生物群发生了变化。一项研究发现，RA患者治疗后，紊乱的口腔微生物群部分恢复正常。在牙周炎患者中也观察到了类似的结果。我们之前的研究发现，口腔微生物群与COVID-19的疾病恢复有关。在这项研究中，评估了治疗后病情稳定的SLE患者口腔微生物群的特征。结果表明，尽管SLE患者在治疗后获得了缓解，但无论是临床还是血清学活动，其口腔微生物群都处于失调状态，这与HC不同。此外，还建立了一个基于口腔微生物群的诊断模型，该模型可以区分治疗后稳定SLE患者和HC。结果表明口腔微生物群可能参与了SLE的疾病恢复。 值得注意的是，抗氧化剂可能对SLE患者有潜在的治疗作用。研究表明，与健康小鼠或健康个体的T细胞相比，狼疮小鼠和SLE患者的T细胞持续被激活，因此线粒体超极化，这可能导致活性氧的产生增加。此外，SLE患者血清和外周血单个细胞核中的谷胱甘肽和半胱氨酸水平低于健康个体，表明存在氧化应激。抗氧化剂在自身免疫性疾病中具有特定的药理作用已经得到证明。

结论

综上所述，本研究首先在一个大队列中分析了SLE患者口腔(舌头)微生物群的特征性变化，鉴定出关键细菌，并预测了与SLE相关的特定微生物功能。此外，还发现SLE患者的口腔微生物群与临床指标相关，并且口腔微生物群随着疾病活动性的增加而发生改变。这些结果表明，口腔微生物群失调可能导致SLE的发生及发展。此外，我们首次开发了一种基于微生物的SLE分类器，并在中国多个地区的患者中验证了其诊断效率，为SLE提供了一种无创诊断工具。此外，本研究还对治疗后病情稳定的SLE患者的口腔微生物群进行了表征，这表明口腔微生物群可能与SLE患者的疾病恢复有关。然而，这些结果需要在不同种族的多中心队列中进行验证。最后，这些结果揭示口腔微生物群可能是未来探索SLE新治疗方法的治疗靶点。