急性肾损伤中的 MicroRNA 表达谱分析

本研究的目的是鉴定调节AKI的miRNA，并开发其作为诊断生物标志物和治疗剂的应用。首先，通过微阵列分析后定量RT-PCR对两种不同AKI小鼠模型的肾组织，即由引起败血症的脂多糖（LPS）诱导的AKI（LPS-AKI小鼠）和由肾缺血再灌注损伤诱导的AKI（IRI-AKI小鼠）相比，详尽筛选其miRNA表达的变化。初步分析新鉴定了miRNA-5100，其在LPS-AKI小鼠和IRI-AKI小鼠肾脏中的表达水平显着降低。接下来，通过尾静脉施用与非病毒载体聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）偶联的miRNA-5100-模拟物显着诱导miRNA-5100在肾脏中的过表达，并通过抑制体内几种细胞凋亡途径来阻止IRI-AKI小鼠的发展。此外，AKI患者的miRNA-5100血清水平被确定为明显低于健康受试者。ROC分析显示，血清miRNA-5100表达水平可识别AKI（临界值0.14，AUC 0.96，灵敏度1.00，特异性0.833，p<0.05）。这些结果表明，miRNA-5100调节AKI，可作为AKI的新型诊断生物标志物和治疗靶点。

引起的急性肾实质损害，药物的不良反应以及尿路结石或肿瘤阻塞尿流。AKI的早期诊断和干预可带来更好的结局，因为AKI与高发病率和死亡率相关（2）。因此，已经建立了肾脏疾病：改善全球结果（KDIGO）指南，以指导AKI的诊断和治疗。这些指南建议通过血清肌酐水平升高或尿量减少来诊断 AKI。然而，当遵循KDIGO标准时，可能会错过治疗干预的窗口，因为有时可能无法实现早期诊断。 为了克服这个问题，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂胱抑素C、肾损伤分子1（KIM-1）以及胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP-7）和金属蛋白酶2的组织抑制剂（TIMP-2）等几种分子已被证明有望作为AKI的诊断标志物。 ;然而，它们尚未在临床实践中建立。关于 AKI 的治疗，推荐使用输血、透析或治疗引起 AKI 的基础疾病等支持性方法，但尚未建立治疗 AKI 的特异性药物。在这种背景下，迫切需要研究和开发AKI的诊断生物标志物和治疗剂。MicroRNA（miRNA）是短的非编码RNA，由大约18-25个碱基组成，这些碱基是从编码的基因组DNA序列转移而来的。据报道，MiRNA通过RNA干扰调节其靶信使RNA（mRNA）的表达来调节各种疾病状况。 此外，据报道，miRNA的表达水平会根据疾病活动度而变化。据报道，几种miRNA可作为癌症和炎症性疾病等各种疾病的诊断生物标志物。最近的研究报告说，血清和尿液中几种miRNA的表达水平在AKI中发生了变化，使其成为这种情况的潜在有用生物标志物。以前的研究还报告说，miRNA表达水平的变化可能有助于AKI的治疗。 这一证据表明，miRNA可能在AKI的发展中起关键作用，并且可能是这种情况的有用生物标志物和治疗剂。为了澄清这些问题， 结果

两种不同AKI小鼠肾脏中miRNA的谱分析

首先，在2种不同AKI小鼠模型的肾组织中进行微阵列分析，即肾缺血再灌注损伤诱导的AKI小鼠（IRI-AKI小鼠）和给予脂多糖（LPS）诱导脓毒症的AKI小鼠（LPS-AKI小鼠）。与对照小鼠相比，175，1个筛选的miRNA中881个miRNA在IRI-AKI小鼠肾脏中的表达水平显着改变1.2倍以上（图1A和表I）。此外，与对照小鼠相比，LPS-AKI小鼠肾脏中76种miRNA的表达水平在LPS-AKI小鼠肾脏中的表达水平发生了1.881倍以上的显着变化（图1B和表II）。接下来，根据微阵列分析的结果，我们选择了两种不同的AKI小鼠模型（IRI-AKI和LPS-AKI小鼠）的肾脏中表达水平通常改变的miRNA，以减少人为影响，例如由于操作或施用毒素本身，除了AKI。在这两组miRNA之间，有2个miRNA重叠（图1C）。最后，这项研究的目的是找到可以开发为人类AKI生物标志物和治疗方法的miRNA。在这36种miRNA中，有1种被排除在进一步分析之外，因为它们在人类中的表达尚未报道。然后，通过qRT-PCR确认肾脏中剩余36个miRNA的表达水平。在这19种miRNA中，通过qRT-PCR鉴定了17种（miRNA-17a-6p，-21b-5-29p，-1-5p，-132-3p，-212-3p，-223），其表达水平在IRI-AKI和LPS-AKI小鼠中与对照小鼠的水平相比显着改变（图3，A和B）。

因此，我们在这里专注于miRNA-5100，并在本研究中研究了其作为治疗AKI的生物标志物和药物的效用。

图1.IRI-AKI和LPS-AKI小鼠肾脏中改变的miRNA的基于微阵列的聚类分析。IRI-AKI小鼠肾脏A中改变的miRNA的基于微阵列的聚类分析，与假小鼠中的水平相比，IRI-AKI小鼠肾脏中表达变化最显着的miRNA，由微阵列确定（IRI为n = 4，假手术为n = 4）。与假小鼠的水平相比，175，49个筛选的miRNA中126个miRNA（1个上调的miRNA和881个下调的miRNA）在IRI-AKI小鼠肾脏中的表达水平显着改变超过1.2倍。LPS-AKI小鼠肾脏B中改变的miRNA的基于微阵列的聚类分析，与假小鼠中的水平相比，LPS-AKI小鼠肾脏中表达变化最显着的miRNA，通过微阵列确定（LPSn = 4，假手术n = 4）。与假小鼠的水平相比，LPS-AKI小鼠肾脏中76种miRNA（37个上调miRNA和39个下调miRNA）的表达水平显着改变超过1.881倍。C，表达改变的MiRNA在IRI-AKI和LPS-AKI小鼠之间重叠。与假小鼠相比，IRI-AKI小鼠的1个miRNA和LPS-AKI小鼠的2个miRNA表达发生了变化，其中有175个重叠的miRNA。miRNA，微核糖核酸;IRI-AKI，缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤;LPS-AKI，腹膜内给予脂多糖引起的急性肾损伤;LPS，脂多糖。

讨论

这是第一项表明miRNA-5100可能是AKI的治疗靶点的研究，并且可能可作为这种情况的诊断生物标志物。以前的研究报告，miRNA-5100通过抑制其靶mRNA（促进肿瘤生长30，31，32）。许多先前的研究也报道了各种miRNA可能调节AKI。然而，没有研究报告miRNA-5100调节AKI。这项研究首先发现，血清中miRNA-5100的表达水平是AKI的潜在有用生物标志物。此外，miRNA-5100的给药可以通过抑制体内肾脏中的几种细胞凋亡途径来预防和治疗AKI。

许多研究调查了使用肾小管细胞在体外的生理作用。

先前的一项研究报道，miRNA-107的抑制增加了双重特异性蛋白磷酸酶7的表达，从而减少了内皮细胞分泌的TNF-α，并抑制了培养的人肾2（HK-2）肾小管上皮细胞中LPS诱导的AKI的凋亡。另一项研究报告，miRNA-146a 过表达通过抑制核因子-κ β （NF-κB） 信号传导，抑制培养的大鼠肾小管细胞和 HK-2 细胞中 LPS 诱导的 AKI 中的细胞凋亡和炎症。其他研究报告，miRNA-194和miRNA-489的过表达也通过抑制脑中富集的Ras同源性和在培养的HK-1细胞中缺氧诱导的AKI中增加缺氧诱导因子-2的结合来抑制细胞凋亡。另据报道，miRNA-214的过表达通过在培养的大鼠肾小管上皮细胞中抑制缺氧诱导的AKI中的Dickkopf相关蛋白3来抑制细胞凋亡。

此外，一些研究报告了miRNA在体内AKI中的作用。例如，一项研究表明，顺铂诱导的AKI小鼠在顺铂给药前709小时腹膜内给予miR-709 antagomir来抑制miRNA-24抑制线粒体转录因子A的减少，并抑制近端肾小管细胞的凋亡和线粒体功能障碍，从而导致AKI的抑制。另一项研究报告，在LPS-AKI小鼠给予LPS前30分钟腹膜内给予miRNA-30b抑制剂和寡核苷酸来抑制miRNA-30b，通过抑制LPS-AKI小鼠肾脏中的Jun氨基末端激酶（JNK）和NF-κB信号传导来降低炎症细胞因子和凋亡。在其他地方，据报道，通过尾静脉给予腺病毒模拟的miRNA-590-3p在LPS-AKI小鼠中过表达miRNA-590-3p，通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子1来减少炎症介质，如TNF-α，IL-6β和IL-6。一项进一步的研究报告称，在双侧肾缺血前 668 天，通过尾静脉给予 miRNA-668 模拟物和寡核苷酸，在 IRI-AKI 小鼠中过表达 miRNA-2 通过抑制线粒体蛋白 18 kDa，减少了肾小管凋亡和线粒体功能障碍。

尽管这些研究清楚地表明，几种miRNA对AKI的发展具有预防作用，但它们是否可以用作治疗剂尚未明确，因为这些miRNA模拟物或抑制剂是在AKI在体内开始之前施用的。

然而，在这项研究中，miRNA-5100的过表达不仅清楚地显示出预防效果，而且显示出治疗效果，因为我们在不同的实验集中AKI发病前后过度表达miRNA-5100。这支持了miRNA-5100明确调节AKI的断言，并且miRNA-5100-mimic可用作AKI的治疗剂。在这项研究中，为了过表达miRNA-5100，PEI-NPs被用作非病毒载体。据报道，PEI-NPs是一种聚合物，可有效递送寡核苷酸以调节肾脏中的靶基因表达，并且在制备非病毒载体时被认为是优选的，因为它们具有长期安全性和生物相容性。在本研究中，PEI-NPs携带的miRNA-5100（miRNA-5100-PEI-NPs）的过表达对IRI-AKI小鼠体内具有预防和治疗作用。这种过表达导致体内IRI-AKI小鼠肾脏中许多不同mRNA的表达发生变化（53个mRNA上调和82个mRNA下调超过4倍）;然而，使用PEI-NPs控制miRNA几乎没有变化（4个mRNA上调，1个mRNA下调超过4倍）。这些结果表明，miRNA-5100的过表达以序列特异性方式抑制了AKI的进展。miRNA-5100的过表达改变了参与几种细胞凋亡途径的15个mRNA的表达（图7B）。细胞凋亡主要在AKI的肾小管细胞中诱导。因此，靶向细胞凋亡的疗法对于抑制AKI可能很重要。

AKI 中的细胞凋亡可能是由位于线粒体中的 B 细胞淋巴瘤 2 （Bcl-2） 家族蛋白调节的内在途径和由死亡受体（如 Fas、肿瘤坏死因子受体 1 （TNFR1） 和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 （TRAIL） ）的配体结合引发的外在途径引起的。

为了抑制细胞凋亡，据报道，抑制单一细胞凋亡途径不足以抑制AKI的发展。

值得注意的是，miRNA-5100的过表达抑制了几种细胞凋亡途径中的mRNA（图10）。在这些mRNA中，以前的研究报告Calcr，Cyp2e1，Lrp8，Slc25a25和XBP1参与AKI的开发。

这些结果与本研究的结果一致。

图10miRNA-5100抑制了各种途径的细胞凋亡。miRNA-5100通过15个mRNA抑制来自各种途径的细胞凋亡。*mRNA被TargetScan或miRbase报告为miRNA-5100的靶基因：miRNA，微核糖核酸;Acad11，酰基辅酶A脱氢酶家族，成员11;钙质，降钙素受体;卡普n6，钙蛋白酶6;Cdk7，细胞周期蛋白依赖性激酶7;辅酶Q9，辅酶Q9;Cyp2e1，细胞色素P450家族2亚家族e多肽1;Dfna5，耳聋常染色体显性遗传5;Lrp8，低密度脂蛋白受体相关蛋白8载脂蛋白e受体;Nek1，从未在有丝分裂基因a相关表达激酶1;PEI-NPs，聚乙烯亚胺纳米颗粒;Serpina7，丝氨酸肽酶抑制剂分支A成员7;Socs4，细胞因子信号传导抑制因子4;Slc25a25，溶质载体家族25成员25;Tac1，速激肽1;Tspyl5，睾丸特异性蛋白Y编码像5;XBP1，X-box结合蛋白1。（彩色版图可在线获取。

关于使用miRNA作为AKI生物标志物的可能性，以前的研究报告说，许多miRNA在AKI的肾脏中的表达水平发生了变化，这表明它们作为这种情况的诊断生物标志物的价值。然而，尚未报道 AKI 肾脏中的 miRNA-5100。这可能是由于研究之间使用的实验方法和临床环境的差异。在这项研究中，我们首先筛选了2种不同AKI小鼠模型中miRNA表达的变化，以减少操作，小鼠品系背景和AKI类型的影响。本期AKI患者血清中miRNA-5100表达水平早期下降，如AKI I期（82.4%，14/17）;然而，其他生物标志物如尿NGAL和L-FABP在不到一半的AKI患者中发生了变化[NGAL（41.2%，7/17），L-FABP（29.4%，5/17）]。先前报道的尿 NGAL 和 L-FABP 水平是 AKI 的生物标志物，比使用血清肌酐时更早。

这些结果表明，miRNA-5100的血清表达水平可能是AKI的敏感诊断生物标志物;然而，需要进一步研究大样本量。本研究无法稳定检测AKI患者尿液中miRNA-5100的表达水平。这可能是由于尽管存在一些尿量，但肾脏损伤导致 AKI 尿液中的溶质元素很小。此外，本研究中的一些AKI患者出现无尿。

这项研究有几个局限性。首先，对我们研究结果的分析可能受到样本量的限制。其次，由于本院是急症期医院，所有患者在初步诊断和选择治疗后均被转移到其他医院，因此无法调查AKI恢复后血清中miRNA-5100的表达水平。miRNA-5100的表达水平在从AKI中恢复后是否会发生变化，需要在未来的研究中进行调查。第三，先前的研究报告说，SLE患者血清中的miRNA-5100高于健康受试者。在这项研究中，我们没有来自发生AKI的SLE患者的血清样本。因此，在今后的研究中，应继续研究发生AKI的SLE病例血清中miRNA-5100表达的变化。最后，miRNA-5100-模拟PEI-NPs在其他器官中的作用也需要研究。综上所述，miRNA-5100可能是AKI的新型诊断生物标志物和治疗靶点。

Aomatsu A, Kaneko S, Yanai K, Ishii H, Ito K, Hirai K, Ookawara S, Kobayashi Y, Sanui M, Morishita Y. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Transl Res. 2022 Jun;244:1-31. doi: 10.1016/j.trsl.2021.11.010. Epub 2021 Dec 4. PMID: 34871811.

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