【论肿道麻】抑制髓系细胞内造血细胞激酶的表达，限制胰腺肿瘤的生长和转移

胰腺导管腺癌是一种侵袭性疾病，5年生存率低，治疗反应差。研究人员在胰腺导管腺癌中观察到髓系细胞特异的造血细胞激酶表达升高，与患者存活率降低相关。2022年10月，Ashleigh R.Poh等人在《Cell Reports》(IF:9.995)杂志上发表了一篇题为《Inhibition of HCK in myeloid cells restricts pancreatic tumor growth and metastasis》的文章，旨在确定髓系细胞中异常表达的造血细胞激酶是否与胰腺导管腺癌的生长和转移有关。现介绍如下：

背景  

胰腺导管腺癌是一种侵袭性疾病，5年生存率低于10%。虽然化疗可以使30%的患者肿瘤一过性消退，但在接受手术的10名患者中，仍有9名因局部复发和/或转移而死于肿瘤。同样，包括抗(α)PD1或αCTLA4在内的免疫检查点疗法也未能在大多数胰腺导管腺癌患者中转化为有意义的改善。

胰腺导管腺癌对免疫细胞相关的治疗反应不佳可以由两个屏障来解释。第一个是肿瘤固有屏障，与有限的免疫原性突变和癌症新表位的呈现所导致的免疫激活不足有关，所以目前的临床建议仅将αPD1限制为<1%的患有DNA错配修复缺陷疾病的胰腺导管腺癌患者的二线治疗。第二个是肿瘤外源性屏障，来自免疫抑制和促结缔组织增生性微环境，其特征是肿瘤相关成纤维细胞(CAF)、髓系来源抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的大量涌入，将细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)效应细胞排除在肿瘤之外。因此，能够同时激活肿瘤免疫和缓解免疫抑制的治疗方法，才有希望更好地控制胰腺导管腺癌进展和转移。

研究人员在大多数人类实体恶性肿瘤（包括胰腺导管腺癌）中观察到了髓系SRC家族激酶造血细胞激酶的高表达，其中超过95%的造血细胞激酶表达发生在免疫细胞中，并与患者较差的生存相关。作者之前已经通过促进免疫抑制的肿瘤微环境证明了髓系造血细胞激酶信号在胃癌和结肠癌中的外源性作用。相反，基因消融或药物抑制造血细胞激酶可减少肿瘤生长。在这里，作者确立了在胰腺导管腺癌中靶向造血细胞激酶的治疗益处，以减少免疫抑制，减弱促结缔组织生长反应，并重新激活适应性抗肿瘤免疫。

结果  

宿主体内造血细胞激酶基因消融可减少胰腺导管腺癌生长和转移  

为了探索造血细胞激酶在胰腺癌中的潜在促肿瘤作用，作者研究了胰腺导管腺癌患者中造血细胞激酶的表达水平，并观察到与正常组织相比，肿瘤样本中的表达上调(图1A)。作者还分析了人和小鼠胰腺导管腺癌肿瘤的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集，证实造血细胞激酶在肿瘤相关的髓系细胞中表达最显著(图1B和1C)。

为了确定宿主体内异常的髓系造血细胞激酶信号是否参与了胰腺导管腺癌的生长和转移，作者将同系的KPC胰腺肿瘤细胞原位移植到野生型(WT)和造血细胞激酶基因敲除(HckKO)宿主的胰腺远端，观察到HckKO宿主的胰腺肿瘤比WT宿主的胰腺肿瘤小得多(图1D)。为了更好地了解造血细胞激酶在胰腺导管腺癌转移中的作用，作者将KPC肿瘤细胞注射到脾内，然后切除脾，以保护宿主免受原发肿瘤过度生长造成的过早死亡。再一次，作者观察到HckKO宿主的肝转移发生率降低(图1E)。

图1 髓系细胞内造血细胞激酶基因消融对胰腺导管腺癌肿瘤生长和转移的影响  

造血细胞激酶基因消融增强髓系细胞的免疫调节内型并促进活化的细胞毒效应细胞进入肿瘤  

为了从功能上将髓系细胞中造血细胞激酶表达的减少与抗肿瘤免疫反应的改善联系起来，作者对从WT和HckKO宿主中发现的大量RNA测序的KPC肝转移进行了京都基因和基因组数据库(KEGG)和基因本体论(GO)通路分析。在HckKO宿主的肿瘤中，作者观察到与先天性和获得性免疫反应相关的通路显著富集，包括髓系细胞激活和效应细胞介导的细胞毒性(图2A)。

鉴于免疫抑制髓系细胞对胰腺导管腺癌生长和转移的贡献，作者接下来对WT和HckKO宿主的KPC肝转移中的髓系细胞进行了分析，发现造血细胞激酶缺乏并不影响TAMs的总体丰度。相反，作者观察到在HckKO宿主的肿瘤中，CD206+交替激活的巨噬细胞和MDSCs减少，CD103+常规1型树突状细胞(cDC1s)增加(图2B)，这表明造血细胞激酶基因消融促进树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞向激活的内型转变。

接下来，作者评估了cDC1s和TAMs在HckKO宿主增强抗肿瘤反应中的作用。在用cDC1缺陷小鼠(ItgaxCreIrf8fl/fl；称为cDC1KO)或cDC1正常(WT)小鼠的骨髓重建致死性照射的WT宿主后，作者用抗CSF1R的中和抗体处理每个队列中的一半，以在脾内注射KPC肿瘤细胞之前耗尽TAMs。在建立脾内KPC肿瘤后，小鼠接受小分子造血细胞激酶抑制剂RK20449或Captisol载体的治疗，直到临床终点。虽然与对照组相比，cDC1和TAM的耗尽都不会影响载体处理的宿主总体存活率，但cDC1的耗尽会降低RK20449处理的宿主的总体存活率，当TAM也同时耗尽时，这一点会进一步降低(图2C)。

然后，作者通过利用脾内KPC模型在WT、HckKO、Rag1KO&HckKO、Rag1KO，这四种小鼠中建立肝转移，阐明了获得性免疫对HckKO宿主中的抗肿瘤反应的增强起积极作用。为了解释NK和T细胞在HckKO宿主中的作用，作者分别耗尽了NK细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞，并观察到CD8+T细胞缺陷比NK或CD4+T细胞缺陷更有效地消除了在没有造血细胞激酶表达的情况下所产生的肿瘤抑制效应(图2D)。这些观察结果与WT小鼠相比，HckKO宿主肿瘤中CD8+T细胞和NK细胞的增加比例是一致的(图2E)。此外，从HckKO宿主肿瘤中分离的CD8+T细胞和NK细胞也显示出编码细胞毒活性的基因(即IFNG、TNF、GzmB、Prf1)的表达增加，这反过来又与HckKO宿主肿瘤中颗粒酶B和穿孔素的更丰富的染色有关(图2F)。综上所述，作者的研究结果表明CD8+T细胞是介导HocKO宿主增强的抗肿瘤反应的主要效应细胞群。

图2髓系细胞内造血细胞激酶基因消融增强细胞毒效应细胞的招募和激活      

髓系细胞造血细胞激酶基因消融可降低胰腺导管腺癌的促结缔组织再生反应  

肿瘤相关成纤维细胞产生并重塑胰腺导管腺癌中的大部分细胞外基质，并与髓系细胞相互作用共同放大和维持免疫抑制和纤维化的肿瘤微环境。与WT组相比，HckKO宿主的KPC肝转移瘤显示明显较少的细胞外基质，包括胶原和纤维连接蛋白(图3A)。因此，作者研究了与HckKO宿主肿瘤相关的细胞外基质是否在数量和质量上与来自WT宿主的肿瘤相关。免疫组织化学和流式细胞术显示，HckKO宿主的肿瘤含有较少的炎性、肌纤维母细胞和抗原呈递的细胞外基质(图3B和图3C)。同样，来自HckKO宿主的细胞外基质与来自WT宿主相比，与免疫抑制(即TGF-β，IL-10)、纤维化(即IL-11)和细胞外基质重塑(即Mmp3、Mmp7、Mmp9、Col1a1)相关的基因表达也降低(图3D)。

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图3髓系细胞内造血细胞激酶基因消融可减少促结缔组织增生性肿瘤微环境      

抑制造血细胞激酶可提高化疗和免疫治疗的疗效  

人类胰腺导管腺癌的免疫细胞排斥和纤维化转录特征与不良预后和对免疫治疗的抵抗有关。鉴于αPD1治疗的有效性受限于细胞毒效应细胞的耗尽以及免疫抑制和促结缔组织增生间质，作者首先研究了造血细胞激酶缺失是否会使难治性胰腺导管腺癌肿瘤对aPD1敏感。作者用aPD1治疗荷瘤的WT或HckKO宿主，发现HckKO宿主能够对aPD1免疫治疗产生反应，并阻止肝转移瘤的生长(图4A)。其生存时间也得到延长，远远超过所有其他治疗队列(图4B)。

为了确定抑制造血细胞激酶除了减少了aPD1介导的局部免疫抑制，是否还刺激了抗原启动，作者又评估了造血细胞激酶缺失的宿主体内对治疗性CTLA4抑制或CD40刺激的作用。与抑制肿瘤微环境中T细胞激活的PD1检查点不同，CTLA4信号控制着淋巴结中T细胞的启动。同时，CD40的刺激增强了cDC1s的交叉呈递，并通过表位扩散扩大了T细胞的反应。作者观察到，使用拮抗性αCTLA4或激动型αCD40抗体治疗可以保护HckKO宿主免受肝转移的影响，与WT宿主相比生存期得到延长(图4C-4F)。作者还观察到，吉西他滨也能够延长HckKO宿主的生存时间(图4G和4H)，且组织切片中没有肝转移的组织学证据。总之，作者的研究数据表明，抑制已建立肿瘤的宿主造血细胞激酶活性，可以获得免疫检查点依赖性抗肿瘤免疫，并为靶向造血细胞激酶作为辅助疗法以增强 PDAC对化疗和免疫疗法的反应提供了令人信服的理论依据。

图4髓系细胞内造血细胞激酶基因消融使胰腺导管腺癌肿瘤对免疫治疗增敏并增强化疗效果  

总结  

髓系细胞是胰腺导管腺癌肿瘤中最早的浸润性细胞之一，与疾病进展、复发、转移和总生存率降低有关。因此，旨在消除髓系细胞、抑制其渗透和/或将其重新编程为免疫刺激内型的治疗策略在临床前胰腺导管腺癌模型和临床试验中都显示出潜力。

在这里，作者发现造血细胞激酶是胰腺导管腺癌中髓系细胞介导的免疫抑制、转移和结缔组织发育的关键促进剂。从机制上讲，基因消融髓系细胞中的造血细胞激酶，使树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞向免疫刺激内型转化，并通过减少髓系来源抑制细胞的丰度来抑制原发和转移肿瘤的生长。这些变化与NK和CD8+T细胞向肿瘤中募集的增加以及向富含未耗尽效应细胞的肿瘤微环境的转变有关。虽然髓系细胞中过度的造血细胞激酶激活有一部分是通过T细胞依赖的机制促进肿瘤进展，但作者的发现也扩展了T细胞非依赖机制。在这里，作者将后者归因于过度的造血细胞激酶激活导致的免疫抑制和基质重塑的增加。同时，造血细胞激酶的高表达与免疫抑制巨噬细胞的丰度增加和T细胞信号的耗尽有关，这与胰腺、胃癌和结肠癌患者的总生存率降低有关。因此，作者推测，抑制造血细胞激酶信号，可以重新编程免疫抑制性髓系细胞，并激发抗肿瘤免疫。

作者的发现强化了髓系细胞在促进和维持促结缔组织增生性肿瘤微环境中的关键作用。对胰腺癌、动脉粥样硬化以及肾脏和肺纤维化的研究表明，过度的造血细胞激酶激活与结缔组织增生之间存在联系。作者观察到HckKO小鼠肿瘤中含有较少的抗原呈递肿瘤相关成纤维细胞，这表明它们对抑制造血细胞激酶信号所引起的抗肿瘤免疫反应的改善作用有限。作者的研究表明胰腺导管腺癌对免疫治疗的有限反应可能源于免疫抑制的肿瘤环境，而不是肿瘤细胞的新生抗原性不足，这也支持了高肿瘤抗原性不足以诱导T细胞在胰腺肿瘤中发挥免疫作用。事实上，作者的数据补充了以下观察结果，即CD40激活能够通过不依赖模式识别受体的树突细胞激活来启动T细胞，通过注射FLT3配体增强树突细胞功能可以对抗原肿瘤的逃逸。因此，靶向抗造血细胞激酶催化活性不仅克服了限制纤维化肿瘤治疗反应的主要免疫屏障，而且当与化疗或免疫治疗相结合时，它还能够实现持久的抗肿瘤反应。

编译：毛瑞；吴星

审校：张军；缪长虹

参考文献：  

Poh AR, O'Brien M, Chisanga D, He H, Baloyan D, Traichel J, Dijkstra C, Chopin M, Nutt S, Whitehead L et al: Inhibition of HCK in myeloid cells restricts pancreatic tumor growth and metastasis. Cell Rep 2022, 41(2):doi:10.1016/j.celrep.2022.111479111479.

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