快报 | 曲安奈德经SIRT1/FOXO3通路诱导Ag85B处理的人胚肺成纤维细胞自噬

作者：罗莉，周磊，罗林紫，冯丹，丁衍，卢志斌，聂赣娟，白丽琼，肖阳宝

第一作者及单位：罗莉，周磊，湖南省结核病防治所（湖南省胸科医院）

通信作者及单位：肖阳宝，湖南省结核病防治所（湖南省胸科医院）

Triamcinolone acetonide induces the autophagy of Ag85B-treated WI-38 cells via SIRT1/FOXO3 pathway

Allergol Immunopathol (Madr). 2023，51(2)：27-35.

doi：10.15586/aei.v51i2.775.

研究背景

结核性气管支气管狭窄（tracheobronchial stenosis of tuberculosis ，TSTB）是肺结核常见并发症之一。超90％的气管支气管结核（tracheobronchial tuberculosis，TBTB）患者即使在充分化疗后也出现不同程度的气道狭窄。目前国内外关于TSTB机制研究不多，可能与结核分枝杆菌的成份、抗结核分枝杆菌的免疫反应、遗传因素等造成成纤维细胞过度增殖、肉芽组织增生、胶原纤维合成增多和细胞外基质(ECM)沉积相关。同时，多种炎症细胞因子参与了抗结核分枝杆菌感染的防御机制，炎症细胞因子可促进成纤维细胞增殖等，进而引起TSTB。

自噬是由细胞应激触发的一种细胞自我降解和循环利用胞内组分的过程。雷帕霉素诱导自噬增强可改善卡介苗对溶酶体的传递，提高CD4和CD8 T细胞的抗原表达，并显著提高小鼠抗结核能力。自噬在兔气管狭窄模型中起着保护作用，激活自噬可能是一种有效的治疗方法。曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA）作为人工合成的糖皮质激素，具备强而持久的抗炎抗纤维化作用。TA联合5-氟尿嘧啶通过增加miR-192-5p的表达来抑制尿道瘢痕成纤维细胞的自噬和纤维化。曲安奈德联合皮质类固醇可改善兔气管狭窄模型的炎症及创伤。然而，自噬及TA在TSTB进展中的具体作用尚不清楚。本研究探讨TA对TSTB的影响及其潜在机制，为探索TSTB的防治策略提供新的理论依据。

研究方法

1.临床样本采集及检测：2020年8月至2021年9月，在湖南省胸科医院采集了无吸烟肺癌患者行肺叶切除术中正常支气管残端组织，以及结核性增生性气道狭窄（TPTS）和结核性瘢痕性气道狭窄（TSTS）患者的病变支气管组织样本。HE染色及免疫荧光染色检测SIRT1在组织中的表达。蛋白质印迹分析（Western Blot，WB）检测SIRT1、TGF-β1、VEGF、FOXO3a和ac-FOXO3a以及LC3 II/I、Beclin1和p62的蛋白质水平。ELISA法检测患者血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ的浓度。

2.建立TSTB体外细胞模型：人胚肺成纤维细胞WI-38培养于含有10%胎牛血清和1%链霉素-青霉素的Dulbecco改良eagle培养基中（37°C，5%CO2）。将WI-38细胞暴露于不同浓度的重组结核分枝杆菌主要分泌蛋白抗原85B（Recombinant Mycobacterium Tuberculosis major secretory protein Antigen 85B，Ag85B），计算细胞抑制率，得出浓度-抑制反应曲线，建立TSTB 体外细胞模型。WI-38细胞与不同浓度的曲安奈德共孵育24小时，为后续实验提供合适的药物浓度。CCK-8法测定细胞活性。流式细胞术检测细胞凋亡率。

3.观察TA对TSTB细胞模型的作用：WB检测 SIRT1、FOXO3a、ac-FOXO3a和FOXO3a、TGF-β、VEGF、LC3、P62、Beclin1的蛋白量；RT-qPCR检测WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的水平；免疫荧光染色检测LC3的表达水平；ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。

4.验证TSTB中TA和SIRT1之间的关系：使用Sirtuin1（SIRT1）小干扰RNA（siRNA）转染细胞48h使SIRT1沉默。通过RT-qPCR检测SIRT1和FOXO3a的水平。WB检测p65、ac-p65、FOXO3a和ac-FOXO3a、LC3 II/I、p62和Beclin1的水平。免疫荧光染色观察Beclin1。ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。

5.验证TSTB中SIRT1及自噬和TA之间的关系：为过表达SIRT1（oe-SIRT1），使用lipofectamine 2000将神经胶质瘤细胞暴露于质粒克隆（pc）DNA3.1载体或pcDNA3.1-SIRT1。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞。通过WB检测LC3 II/I、p62、VEGF、TGF-β1和Beclin1的蛋白水平。ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。CCK-8法检测WI-38细胞的光密度（OD）。流式细胞术检测WI-38细胞的凋亡。

研究结果

1. SIRT1在TSTB中表达下调：在TPTS和TSTS中观察到显著的成纤维细胞和炎症浸润（图1A），免疫荧光染色证实TSTB中SIRT1降低（图1B）。与正常组相比，TPTS和TSTS中SIRT1和FOXO3a的表达显著降低。相反，TPTS和TSTS的ac-FOXO3a、TGF-β1和VEGF水平远高于正常组（图1C和D）。同时，使用WB检测自噬在TSTB中的作用。在TPTS和TSTS组织中，LC3B和Beclin1的表达均低于正常组，而p62的水平表现出相反的趋势（图1E）。TSTB的发展显著促进了促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IFN-γ；图1F）的分泌。

图1

TPTS和TSTS中SIRT1和FOXO3a水平下调（A） H&E染色观察组织损伤情况。（B） 免疫荧光染色检测SIRT1在组织中的表达。（C和D）通过WB检测SIRT1、TGF-β1、VEGF、FOXO3a和ac-FOXO3a的蛋白质水平。（E） 通过WB研究组织中LC3 II/I、Beclin1和p62的蛋白质水平。（F） ELISA法检测患者血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ的浓度* P＜0.05与正常人相比。

2.曲安奈德诱导Ag85B处理的细胞凋亡：使用Ag85B刺激WI-38细胞在体外模拟TSTB细胞模型。在图2A中，Ag85B使细胞活力受限，上调了WI-38细胞中TGF-β1和VEGF的水平（图2B），并显著上调WI-38上清液中的TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平（图2C）。由于Ag85B（2μg/mL）对纤维化和炎症的作用最为显著，因此选择其用于后续分析。经Ag85B处理的WI-38细胞的活力被TA抑制（图2D）。TA以剂量依赖的方式诱导Ag85B处理的WI-38细胞凋亡（图2E）。基于上述结果，选择了TA（20μM）用于后续研究。总之，TA显著诱导Ag85处理的WI-38细胞凋亡。

图2

在Ag85B处理的WI-38细胞中显著诱导细胞凋亡用0.5-、1-、2-、4-或8-μg/mL Ag85B处理WI-38细胞。（A） 用CCK-8法检测WI-38细胞的活力。（B） 通过蛋白质印迹分析研究了WI-38细胞中VEGF和TGF-β1的蛋白水平。（C） ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。（D） 用Ag85B（2μg/mL）、Ag85B（2μg/mL）和TA（5μM）、Ag85 B和TA（10μM）或Ag85 B（2µg/mL）和TA（20μM）处理WI-38细胞。用CCK-8法检测WI-38细胞的活力。（E） 流式细胞仪检测WI-38细胞的凋亡率。*与Ag85B（0μg/mL）相比P＜0.05，与Ag85B相比P＜0.05。

3.曲安奈德逆转Ag85B诱导的WI-38细胞纤维化和抑制自噬作用：为了研究TA在TSTB期间纤维化中的作用，进行了WB和ICC分析。数据显示，Ag85B显著上调了WI-38细胞中VEGF和TGF-β1以及p62的表达（图3A和B）。并抑制LC3，LC3II/I和Beclin1的水平，而这些现象被TA逆转（图3C和D）。此外，Ag85B显著上调WI-38细胞上清液中IL-6、IFN-γ和TNF-α的浓度，而TA可显著抑制Ag85B对这些细胞因子的影响（图3E）。总之，TA逆转了Ag85B诱导的WI-38细胞的纤维化、炎症和自噬的抑制作用。

图3

Ag85B诱导的WI-38细胞的纤维化、炎症和自噬反应被TA抑制（A） WB检测WI-38细胞中VEGF和TGF-β1的蛋白水平。（B） ICC染色检测WI-38细胞中VEGF的水平。（C） WB研究WI-38细胞中LC3 II/I、Beclin1和p62的蛋白质水平。（D）免疫荧光染色研究WI-38细胞中LC3的水平。（E） ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。*与对照组相比P＜0.05，与Ag85B组相比P＜0.05。

4.曲安奈德恢复Ag85B抑制WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的表达：通过RT-qPCR和WB检测TA在SIRT1/FOXO3a通路中的功能。Ag85B显著抑制WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的水平（图4A和B），TA显著逆转了这一现象。相反，在TA存在的情况下，Ag85B诱导的ac-FOXO3a的活化显著恢复（图4C）。总之，TA恢复的Ag85B抑制了WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的表达。

图4

TA恢复的Ag85B抑制WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a水平（A） 通过RT-qPCR检测WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的水平。（B和C）通过WB评估WI-38细胞中FOXO3a、ac-FOXO3a和FOXO3a的蛋白质水平。*与对照组相比P＜0.05，与Ag85B相比P＜0.05。

5.SIRT1的敲除逆转了曲安奈德介导的Ag85B处理的WI-38细胞自噬：通过RT-qPCR和WB进一步证实TSTB中TA和SIRT1之间的关系，。如图5A和B所示，在Ag85B处理的WI-38细胞中，TA诱导的SIRT1和FOXO3a的上调被SIRT1 siRNA显著消除。此外，TA显著降低了Ag85B处理的WI-38细胞中ac-p65的水平，而SIRT1沉默显著消除了TA的作用（图5B）。接下来，SIRT1 siRNA显著减轻了TA对Ag85B处理的WI-38细胞中LC3II/I、p62和Beclin1的影响（图5C–E）。此外，TA对Ag85B处理的WI-38细胞的抗炎作用被SIRT1的沉默显著破坏（图5F）。总之，SIRT1的抑制逆转了Ag85B处理的WI-38细胞中TA介导的自噬反应。

图5

在Ag85B处理的WI-38细胞中，SIRT1的敲除逆转了TA介导的自噬反应 （A） RT-qPCR检测WI-38细胞中SIRT1和FOXO3a的水平。（B和C）WB研究WI-38细胞中p65、ac-p65、FOXO3a和ac-FOXO3a的蛋白质水平。（D） WB研究WI-38细胞中LC3 II/I、p62和Beclin1的蛋白质水平。（E）免疫荧光染色观察WI-38细胞中Beclin1的水平。（F） ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。*与Ag85B.#相比，P＜0.05，与Ag85B+TA+si-NC相比P＜0.05。

6.SIRT1过表达通过诱导自噬增强曲安奈德对TSTB细胞模型的作用：为了进一步验证TA介导的TSTB进展中SIRT1和自噬之间的关系，进行了CCK-8测定。数据显示，TA略微抑制了Ag85B处理的WI-38细胞的活力，SIRT1过表达进一步增强了TA的作用（图6A）。然而，这种现象在3-MA存在的情况下得到了挽救（图6A）。此外，TA显著诱导Ag85B处理的WI-38细胞凋亡，pcDNA3.1–SIRT1进一步增强了凋亡作用（图6B）。然而，在3-MA存在的情况下，pcDNA3.1–SIRT1的作用部分恢复（图6B）。同时，SIRT1过表达进一步增强了TA对自噬相关和纤维化蛋白（LC3、p62、Beclin1、TGF-β1和VEGF）的作用，而3-MA逆转了这些现象（图6C）。一致地，pcDNA3.1–SIRT1进一步增强了TA的抗炎作用，而在3-MA存在的情况下，这种现象得到了部分缓解（图6D）。总之，SIRT1过表达通过诱导自噬增强了TA对TSTB的作用。

图6

SIRT1过表达通过诱导自噬增强了TA对Ag85B处理的WI-38细胞的作用（A） CCK-8法检测WI-38细胞的光密度（OD）。（B） 流式细胞术检测WI-38细胞的凋亡。（C） WB研究WI-38细胞中LC3 II/I、p62、VEGF、TGF-β1和Beclin1的蛋白水平。（D） ELISA法检测WI-38细胞上清液中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。*与Ag85B相比P＜0.05，*与Ag85B+TA+oe-NC相比，P＜0.05与Ag85B+TA+oe-SIRT1相比P＜0.01。

研究结论

曲安奈德通过SIRT1/FOXO3信号途径增强TSTB成纤维细胞模型的自噬反应。本研究为探索TSTB防治策略提供了新的理论依据。然而，是否可以作为一种潜在的抗TSTB新药还需要进一步探索。

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供稿：罗莉

编辑：于菲

审校：范永德

发布日期：2023-03-28

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