细胞活力检测方法大盘点，CTG 法放大招？

细胞活力检测产品大 PK 

常用的细胞活力检测试剂主要有 MTT、CCK8 等检测方法 (图 1)。

MTT法：又称 MTT 比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中，但死细胞无此功能，后经 DMSO 溶解，于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需经 DMSO 溶解后才能检测，增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性，且该溶剂对人体具有明显毒性。

CCK8法：相较于 MTT，无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多。CCK8 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 CCK-8，让细胞活性检测 So Easy!)。但在实验时，一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅”，但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办？痛点！痛点！痛点！

 科研汪 ：MTT 作为“元老”级别的检测方法，虽然“老练”，Paper 无数，但麻烦是真麻烦，CCK8 法倒是便捷很多！

 小 M：那你是还没用过更便捷的...

 科研汪 ：莫非你说的是细胞活力检测的“金标准”？

 小 M：CTG 细胞活力检测，简单、灵敏、快速的均质检测方法，反应 10 分钟即可得到“Bling Bling”的检测结果，你就说“快不快”？

CTG 发光法：基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对三磷酸腺苷 (ATP) 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。该实验方法可用三个字简单概括 “快、准、狠”，比 MTT 的处理速度快近 20 倍，节省时间近 4 小时。CTG 特有的均质检测法即 “加样-混样-检测”，使用时，只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨，细胞活力检测为什么不能如此简单？

 图 1. MTT、CCK8 与 CTG 法的实验流程图

表 1. MTT、CCK8 与 CTG 法特点比较

CTG，适用于哪些实验 

首先，来了解实验 CTG 发光法的测定原理：ATP 作为细胞新陈代谢的一个重要指标，与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。ATP 生物发光的原理为：荧光素酶以荧光素、ATP 和 O2 为底物，在 Mg2+ 存在时，可将化学能转化为光能；在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系，即在光信号与酶反应体系中，发光值与 ATP 呈正比，ATP 与活细胞数成正比，CTG 发光法通过 ATP 含量来进行细胞计数或活力测定，且不受化合物自发荧光的影响 (图 2)，是细胞增殖测定，细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。

图 2. CTG 法检测原理 

■ 案例 1：细胞增殖测定

如图 3 所示，为了探究 SIPL1 对 TNBC 细胞增殖的影响，将 SIPL1 表达载体转染至 BT-549 与 MDA-MB-231 细胞， 并使用 CCK8 法与 CTG 法，进行细胞增殖检测。

CCK-8 检测：TNBC 细胞瞬时转染 shRNA 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。

CTG 发光细胞活力测定：TNBC 细胞在 37°C 下培养过夜。然后，将 100 µL CTG 溶液直接与培养基混合，在室温下培养 20 分钟。结果显示，转染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖显著降低 (图 3)。

图 3. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[1]

CCK-8 (a) 和 CTG 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。

■ 案例 2：细胞活力测定

如图 4 所示，为了探究外源 RRM2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中过表达或敲除 RRM2，通过 CTG 法检测其对细胞活力的影响。结果表明，过表达 RRM2 时，细胞活力明显增强，反之，敲除 RRM2 时，细胞活力明显降低[1]。

图 4. 通过 CTG 法测定 RRM2 对细胞活力的影响[2]

(a) 在体外表达或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或体外表达的 RRM2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 CTG 发光细胞活力测定法。

■ 案例 3：细胞毒性高通量筛选分析

如下图所示，作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qHTS)，旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物 (图 5)。使用 SYBR Green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制，共检测了 456,817 种化合物。

在 qHTS 之后，又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物，用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μM 和 1 μM 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 CTG 法评估了所有 4,253 种化合物对 HepG2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 HepG2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性，AC50 值 < 43 µM (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物，用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。

图 5. 针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。

CTG “得宠” 理由汇总

图 6. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 与同类产品（竞品）对比测试结果 a. 产品发光稳定性测试（293T 细胞)；b. 不同细胞数的线性范围比较 (293T 细胞)；c. 不同细胞系的检测结果比较 (293T、H4IIE、Jurkat 细胞)

对比测试结果表明：持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中，MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a)；不同细胞数的线性范围中，MCE 产品线性关系良好，与进口 竞品线性几乎一致 (图 5b)；且对于不同细胞系，MCE 产品与进口竞品检测信号值相当 (图 5c)。综上检测结果表明，MCE CTG 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。

表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 产品特性

实验小 Tips，附上 CTG 使用注意事项，希望你能早日发 SCI 啦。

1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感，反复冻融会致其逐渐失活，建议分装冻存，避免反复冻融。冻融时，可能会导致试剂中出现少量沉淀，可平衡至室温后观测沉淀溶解情况，如仍有残留，可离心后去除。

2. 本产品在使用或分装时所使用耗材应注意避免 ATP 污染。

3. 若待测药物的溶剂含量较高，荧光素酶反应可能会被干扰，致化学发光信号受到影响，可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。

4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板，可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。

5. 建议在避光环境下进行荧光检测。

6. 由于整个发光反应非常迅速，建议加入 CTG 试剂孵育 10 分钟后，立即检测荧光。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务

参考文献

1. Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.    2. Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587. 3. Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121.