线粒体⁃NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体通路在急性肺损伤中的作用

申意茹1 王祥瑞2

1同济大学医学院，上海 200120；2同济大学附属东方医院疼痛科，上海 200121

国际麻醉学与复苏杂志,2023,44(02):216-220.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220729-00745

 基金项目 

国家自然科学基金（8217010632）

REVIEW ARTICLES

【综述】

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）通常指的是由于各种原因引起的弥漫性肺泡损伤，其特征为肺泡内皮和上皮细胞损伤，肺泡内出血以及肺水肿。急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是ALI发展至后期最严重的病理过程。其发病原因复杂，缺乏特效治疗手段，因此针对其发病机制的研究正逐渐成为近些年来的热点，特别是对于各种促炎信号通路的调控，以期从根本上缓解或治疗ALI/ARDS。

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）炎症小体是细胞内的一类多蛋白复合物，已经被证实在ALI的发病过程中扮演重要角色。激活炎症小体的因素多种多样，而线粒体在其中发挥的作用正受到越来越多的关注，除了线粒体激活NLRP3炎症小体的独特机制，临床上各种原因所导致的肺损伤如何激活这一通路并介导后续炎症反应同样值得探究，现就NLRP3炎症小体的结构、激活以及线粒体⁃NLRP3炎症小体通路的研究进行综述，以阐明线粒体⁃NLRP3炎症小体通路在ALI中的作用。

1 NLRP3炎症小体的结构      

炎症小体的概念最初是作为胱天蛋白酶（caspase）的活化以及pro⁃IL⁃1β的加工过程的分子平台而被提出，其中，NLRP3炎症小体是目前研究范围最广的炎症小体，它由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis⁃associated speck⁃like protein containing CARD, ASC）以及caspase⁃1构成。其中，NLRP3隶属于NOD样受体家族，该家族成员都具有相似的特征性结构，即中心的NACHT结构域，除此之外，NLRP3还包括N⁃末端的吡啶结构域（pyrin domain, PYD）以及C⁃末端的富含亮氨酸重复序列（leucine rich repeat, LRR）。ASC是一种接头蛋白，包含caspase募集结构域（caspase recruit domain， CARD）和PYD，caspase⁃1包括N⁃末端的CARD以及C⁃末端由大亚基（p20）小亚基（p10）组成的催化结构域。NLRP3炎症小体被激活后，NLRP3和ASC通过PYD⁃PYD相互作用形成螺旋状的ASC簇，ASC再通过CARD⁃CARD相互作用募集caspase⁃1，全长的caspase⁃1被募集到炎症小体之后会产生有活性的p46二聚体，该二聚体通过自我加工产生p33/p10聚合体，该聚合体仍然与炎症小体结合并具有活性；随后的第二次切割去除了caspase⁃1的CARD并且将它以p20/p10的形式从NLRP3炎症小体中释放，这一过程会使其丧失二聚体结构并终止其蛋白酶的活性。

2 NLRP3炎症小体的激活机制      

经典的NLRP3炎症小体激活途径有两个步骤，第一步的启动以及第二步的激活。启动步骤主要涉及两方面，一是NF­κB途径的激活，二是NLRP3的翻译后修饰。NF­κB的激活主要依靠的是病原体相关分子模式和损伤相关分子模式与模式识别受体的结合，随之上调NLRP3和pro⁃IL⁃1β基因的转录和表达，使NLRP3炎症小体处于可以被激活的状态。除此之外，Song等研究发现，USP1相关因子1与泛素特异性肽酶（ubiquitin specific peptidase 1, USP）家族中的成员USP12/46分别结合形成的复合物也能激活NF⁃κB途径，从而促进NLRP3和pro⁃IL⁃1β表达的上调和NLRP3炎症小体的激活。但近年来也有实验证明NLRP3炎症小体可以独立于转录而被激活，Toll样受体（Toll⁃like receptor, TLR）能够同时激活NF­κB和c‑Jun氨基端激酶（c⁃Jun N⁃terminal kinase, JNK）中的JNK1，引起NLRP3在S194上的磷酸化，这种磷酸化能够为NLRP3接下来的寡聚和炎症小体的装配奠定基础。

经历了启动步骤的炎症小体若遇到第二种刺激，就可以迅速被激活，这个过程可由多种信号介导,目前最普遍为人所接受的有以下3种模型。首先，K+外流及胞质内K+浓度的降低能引起NLRP3炎症小体的激活以及pro⁃IL⁃1β的成熟，是多种刺激因素（如细菌成孔毒素、ATP、颗粒物等）活化NLRP3炎症小体的共同机制，但仅有K+外流并不足以诱导NLRP3炎症小体的激活。NIMA相关蛋白激酶（NIMA⁃related kinase, Nek）是一类促进细胞有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该家族中的Nek7和NLRP3的相互作用作为响应K+外流的下游机制，是K+外流引起NLRP3炎症小体后续组装和激活所必不可少的因素。其次，二氧化硅、明矾等晶体被吞噬以后能够诱导溶酶体的肿胀和破裂，从而导致溶酶体内的组织蛋白酶B释放进入胞质，刺激NLRP3炎症小体的激活，而在没有晶体物质被吞噬的情况下，破坏溶酶体仍然能够独立地激活NLRP3炎症小体，表明NLRP3炎症小体所感知的活化信号是溶酶体的破裂以及组织蛋白酶的释放。第三，依赖于活性氧（reactive oxygen species, ROS）的激活机制，硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin⁃interacting protein, TXNIP）在这个过程中发挥着重要作用，Zhou等研究证实静息状态下TXNIP和硫氧还蛋白处于结合状态，当ROS增加时，TXNIP从氧化的硫氧还蛋白中释放出来，进而与NLRP3结合，参与NLRP3炎症小体的激活。

总之，NLRP3炎症小体的激活途径是非常复杂的，除了上述已被提出的3种模型以外，仍有许多参与调控的因素等待被发现。众所周知，线粒体是细胞内的能量工厂，但越来越多的研究证明，线粒体的作用并不止于此，作为一个独立的细胞器，它在NLRP3炎症小体激活过程中发挥的独特作用也逐渐受到越来越多的关注。

3 线粒体⁃NLRP 3炎症小体通路的激活机制

3.1　线粒体相关活性因子

许多参与NLRP3炎症小体激活的因素都是通过线粒体释放相应的衍生因子从而被NLTP3炎症小体所感知。

3.1.1　ROS

线粒体是细胞内ROS产生的主要场所，而线粒体ROS能够通过线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）⁃TXNIP⁃NLRP3轴激活NLRP3炎症小体。通常认为，在病理条件下复合体Ⅰ是线粒体中ROS的主要来源，Zhou等使用鱼藤酮抑制复合体Ⅰ的正常功能，导致了ROS生成增加以及NLRP3炎症小体的激活。线粒体自噬是机体清除受损线粒体，减少ROS的重要途径之一，PINK1⁃Parkin途径已经被证实在线粒体自噬中起主导作用，Lin等研究发现，当线粒体自噬被抑制时，线粒体ROS的产生以及NLRP3炎症小体的激活会增加。同时，产生ROS的线粒体长期存在还会导致NLRP3炎症小体的自发性激活。这些结果都证明线粒体产生的ROS在NLRP3炎症小体激活的过程中发挥重要作用。

3.1.2　线粒体DNA（mitochondria DNA, mtDNA）

损伤后的线粒体会释放mtDNA，而mtDNA被ROS氧化后能与NLRP3炎症小体直接结合并将其激活。Xian等研究证明，抑制TLR诱导的mtDNA的合成，会明显阻断NLRP3炎症小体的激活和IL⁃1β分泌，减轻脂多糖诱导的小鼠ALI。胞苷单磷酸激酶2是线粒体脱氧核苷三磷酸合成过程中的一种限速酶，它的催化活性是激活NLRP3炎症小体所必需的。此外，Ning等研究发现，干扰素基因刺激因子在脂多糖诱导的ALI中起促进作用，而被释放进入胞质后的mtDNA能够增强干扰素基因刺激因子的表达和磷酸化，促进NLRP3的激活，从而引起细胞焦亡，导致了ALI的发生。因此，受损的线粒体释放mtDNA也是激活NLRP3炎症小体的重要因素。

3.2　炎症小体的装配位点

静息条件下，内源性ASC主要定位于线粒体、细胞质和细胞核中，而内源性NLRP3主要定位于内质网中。当NLRP3受到各种信号的刺激后，线粒体会靠近核周区域的内质网，导致线粒体上的ASC和内质网上的NLRP3共定位，随后NLRP3炎症小体在线粒体完成后续的组装并发挥作用。

3.3　线粒体自噬

线粒体损伤会造成ROS和mtDNA的释放，同时也会激活线粒体自噬机制（特别是ROS），从而清除受损的线粒体，降低ROS等NLRP3炎症小体激活因素的水平。因此，正常的线粒体自噬能够抑制NLRP3炎症小体的激活，对机体起到一定的保护作用，而线粒体自噬机制的异常则会造成NLRP3炎症小体过度激活。

4 线粒体⁃NLRP3炎症小体通路介导的ALI

NLRP3炎症小体介导ALI的下游通路主要依赖于肺泡巨噬细胞以及肺内皮细胞中IL⁃1β和IL⁃18的成熟和分泌。内皮细胞中的IL⁃1β能够通过使转录因子cAMP效应元件结合蛋白失活来抑制血管内皮细胞钙黏蛋白的转录，导致毛细血管通透性增加、肺内皮屏障受损以及ALI。此外，雷帕霉素能够增强自噬并抑制NLRP3的表达和NF­κB通路的激活，四环素也能够抑制ARDS患者中的炎症小体⁃caspase⁃1信号通路，它们均能减少成熟IL⁃1β和IL⁃18的产生，从而显著减轻肺损伤的程度。这些实验均表明，NLRP3炎症小体介导的IL⁃1β和IL⁃18分泌在ALI的发生、发展过程中起重要作用。临床常见的ALI类型包括感染相关的肺损伤、呼吸机诱导的肺损伤、氧化应激引起的肺损伤等。这些损伤因素会通过各种机制引起线粒体损伤并快速激活NLRP3炎症小体，从而引起IL⁃1β和IL⁃18的成熟和释放。

4.1　感染相关的肺损伤

感染是造成ALI的重要因素之一，细菌、病毒等病原体均可作为病原体相关分子模式与肺上皮细胞、内皮细胞与肺泡巨噬细胞的模式识别受体（如TLR4）结合，激活机体固有免疫反应，释放一系列细胞因子、趋化因子等，引起线粒体损伤，进而导致线粒体ROS和mtDNA的释放。李思源等研究证实，脂多糖能够诱导NLRP3炎症小体的激活及大量炎症因子的释放，导致内皮细胞损伤，血管通透性增加，进而发展为ALI。Zhang等研究发现，脂多糖能够诱导线粒体自噬从而清除受损线粒体，但过度的线粒体自噬同样能够造成ROS的积累以及NLRP3炎症小体的激活。

4.2　呼吸机诱导的肺损伤

NLRP3炎症小体已经被证实介导了呼吸机相关肺损伤的发生。吕洲等研究表明，NLRP3抑制剂对机械通气所致的小鼠肺损伤有保护作用。在机械通气过程中，肺泡巨噬细胞能够感知牵拉刺激引起NLRP3炎症小体的激活，这一过程同样依赖于线粒体ROS的释放。机械通气可以通过肌醇 1，4，5⁃三磷酸受体引起内质网的Ca2+流出，导致线粒体钙超载从而引起结构破坏和功能紊乱，增加线粒体ROS的水平。同时，高潮气量通气还能通过诱导线粒体损伤和过度的线粒体自噬造成mtDNA的释放，mtDNA水平的增加也能够进一步引起NLRP3炎症小体的激活。此外，机械拉伸不仅能够放大Nek7和NLRP3的相互作用，促进炎症小体的组装和激活，还能增加肺泡巨噬细胞中IL⁃18及其他炎症小体相关细胞因子的水平，而ARDS患者血浆中IL⁃18的水平与其肺损伤的严重程度以及死亡率呈正相关。这些均是导致呼吸机相关肺损伤发生、发展为ARDS的重要原因。

4.3　氧化应激引起的肺损伤

高氧通气是治疗ARDS患者的基石，但是过高的氧含量能破坏线粒体造成ROS释放增加，高氧会影响线粒体膜的蛋白密度，损害线粒体功能。Ma等研究还表明，肺内皮细胞中的线粒体在高氧条件下会发生断裂。此外，缺氧和缺血再灌注等病理条件也能诱发和肺损伤相关细胞的线粒体ROS生成增加，激活NLRP3炎症小体。

5 小结与展望

本文综述了线粒体⁃NLRP3炎症小体通路在ALI发生、发展过程中的作用，NLRP3炎症小体的经典激活信号已经被证实并普遍接受，包括K+外流、溶酶体破裂释放组织蛋白酶以及ROS，但独立于这三种模型之外的各种因素仍在不断被发掘，其中，线粒体的作用逐渐受到重视。除了被广泛研究的ROS和mtDNA以外，线粒体上的某些蛋白质（如线粒体融合蛋白2、动力学相关蛋白1等）均被发现可能影响NLRP3炎症小体的激活、转运、装配过程，但具体机制尚不完全明确。而目前针对NLRP3炎症小体的药物也多聚焦于抑制下游的细胞因子，少有直接抑制其上游激活途径的药物，因此，进一步阐明其上游激活机制能够为临床治疗相关疾病提供新思路，对ALI/ARDS靶向治疗药物的开发具有指导意义。