肺泡上皮糖萼在急性呼吸窘迫综合征中的作用

翻译 上海市公共卫生临床中心 麻醉科 俞立奇

摘要：肺泡上皮糖萼是一层由糖胺聚糖（GAG）和蛋白聚糖组成的致密阴离子层，排列在肺泡上皮的表面。肺内皮糖萼在血管稳态和脓毒症器官功能障碍中具有公认的作用，而肺泡上皮糖萼则鲜为人知。最近的临床前研究表明，上皮糖萼在多种小鼠急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型中降解，特别是那些由吸入性损伤（所谓的“直接”肺损伤）引起的模型，导致GAG脱落到肺泡气腔间隙中。上皮糖萼降解也发生在呼吸衰竭的人身上，通过分析从呼吸机热湿交换（HME）过滤器获得的气体来量化。在ARDS患者中，GAG脱落与低氧血症的严重程度相关，并可预测呼吸衰竭的持续时间。这些作用可能是由表面活性物质功能障碍介导的，因为小鼠上皮糖萼的靶向降解足以导致肺泡表面张力增加、弥漫性微扩张和肺顺应性受损。在这篇综述中，我们描述了肺泡上皮糖萼的结构及其在ARDS过程中降解的机制。我们还回顾了目前关于上皮糖萼降解在肺损伤发病机制中的可归因作用的知识。最后，我们将糖萼降解作为ARDS异质性的潜在介质，随后对GAG脱落的床旁监护量化的价值，以潜在地确定哪些患者最有可能对旨在减弱糖萼降解的药物产生反应。

介绍

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种灾难性的危重症，每年影响美国510000多名患者，与严重的发病率相关，死亡率为30-35%。这种复杂综合征的特征是肺血管渗漏、表面活性物质功能障碍、肺顺应性受损和低氧性呼吸衰竭。

不幸的是，尽管进行了几十年的临床前研究，但ARDS的临床试验在很大程度上未能确定改善患者预后的药物治疗方法。有希望的临床前数据无法转化为成功的临床试验，这越来越多地归因于ARDS中存在的实质性异质性。因此，随机研究通常忽略了将治疗分配与导致患者肺损伤的机制相匹配。有效的ARDS 治疗方法的开发和个性化实施既需要了解这些不同的肺损伤机制，也需要识别能够确定ARDS患者损伤主要驱动因素的生物标志物。

ARDS发病机制的一个潜在靶向机制是肺泡上皮糖萼的降解，这是一个由糖胺聚糖（GAG）、蛋白聚糖和肺泡表面糖蛋白组成的网状层。在肺损伤的动物模型中（如ARDS患者），上皮糖饿降解，将GAG片段脱落到肺泡空气中。在人类中，这种脱落的程度是高度异质的，一些ARDS患者几乎没有上皮糖萼降解的证据。然而，其他ARDS患者表现出大量的肺泡内GAG 脱落，这可以预测机械通气的持续时间和住院时间延长。GAG脱落可以在床边轻松快速地识别，使用非侵入性收集的空气空间流体样本的床旁分析。这种检测能够快速识别肺损伤的潜在靶向机制（所谓的“可治疗特征”），并可能促进ARDS个性化治疗策略的实施。

在这篇综述中，我们将描述肺泡上皮糖萼的结构。然后，我们回顾了关于肺损伤过程中上皮糖萼降解机制的现有文献以及糖萼降解对ARDS发病机制的可归因影响。最后，我们探索了肺泡腔GAG脱落作为ARDS中一种新的、潜在的归因生物标志物在床旁监护量化的潜在作用，这可能会识别接受旨在防止上皮糖萼降解或促进其再生的药物最有可能受益的患者。

肺泡上皮糖萼结构

自从20世纪60年代的通过电子显微镜研究以来，肺泡上皮中连续层的存在已经得到了重视。Weibel 和Gil博士的这些基础研究指出，存在一层浅表面膜，现在已知由肺表面活性物质组成，覆盖在肺泡低相（an alveolar hypophase）或假设其由粘多糖（即GAG）和蛋白质组成的“致密基底层”上。在原始解剖学描述之后，对表面活性物质的结构和功能进行了几十年的深入研究，目前已知表面活性物质具有关键的生物物理和免疫调节功能。相比之下，肺泡低相（an alveolar hypophase），现在被认为是肺泡上皮糖萼，研究不足。新出现的研究表明，肺泡上皮糖萼是上皮表面的关键部分，其降解有助于解释多种不同肺部损伤后的肺损伤发病机制。肺泡上皮糖萼，与全身其他内皮和上皮细胞的糖萼一样，主要由长的无支链GAG组成，这些GAG通过跨膜或糖基磷脂酰肌醇-蛋白聚糖锚定在肺泡表层细胞膜上。构成该结构的主要GAG物种是硫酸乙酰肝素（HS，一种由N-乙酰葡糖胺和己糖醛酸的重复单元组成的线性多糖，葡糖醛酸或其差向异构体，碘酸）、硫酸软骨素（CS，一种线性多糖由N-乙酰半乳糖胺和己糖醛酸的重复单元构成），和透明质酸（HA，一种由N-乙酰基氨基半乳糖和葡萄糖醛酸组成的无硫酸盐线性多糖）（图1）。HS和CS是通过一系列复杂的步骤在高尔基体的蛋白质主链上合成的，包括链聚合（由外泌体-1和-2介导）、硫酸化和（由磺基转移酶如N介导-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶-1和-2）和差向异构酶。这些硫酸化GAG链连接的蛋白主链，包括HS蛋白多糖（HSPG）或CS 蛋白多糖，如多配体聚糖，被转运到细胞表面，在那里它们形成糖萼。一旦进入细胞外，糖盏HS可能会通过细胞外硫酸酯酶如sulf-1和-2进行额外的修饰；HS 硫酸化的这种合成后控制表明糖萼硫酸化稳态的重要性。事实上，HS和CS在特定位点的硫酸化赋予这些分子负电荷的地理结构域，允许静电结合到同源的带正电荷的蛋白质残基。GAG结合改变蛋白质功能，使GAG能够调节下游细胞信号传导。与HS和CS相比，HA是非硫酸盐的，不与蛋白聚糖结合。HA由透明质酸合成酶合成，透明质酸合酶是具有多个跨膜结构域的酶，位于细胞膜内表面。在合成过程中，生长的HA 聚合物通过膜挤出到细胞外空间，然后在那里通过与HA合成酶或细胞表面受体如CD44 结合而锚定在细胞表面。细胞外HA还与其他GAG形成复合物，从而增强糖萼的结构稳定性。这种网状阴离子层共同支持全身内皮细胞和上皮细胞的许多稳态功能。Ochs及其同事在一篇出色的综述中提供了上皮糖萼结构的详细示意图。

图1: 肺泡上皮糖萼的结构。上皮糖萼是排列在上皮表面的糖胺聚糖（GAG）层。硫酸乙酰肝素（HS）是一种线性多糖，由葡糖胺和己糖醛酸（葡糖胺或其差向异构体，碘酸）的重复单元组成。硫酸软骨素（CS）是一种线性多糖，由氨基半乳糖和己糖醛酸的重复单元组成。HS和CS都是连接到蛋白多糖主链上，并且可以在特定的位点被硫酸化，如图所示。透明质酸（HA）是一种线性多糖，由氨基半乳糖和葡萄糖醛酸组成。它与CD44结合，并且不与上皮表面的蛋白多糖共价连接，并且不被硫酸化。硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）、透明质酸（HA）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-酰氨基半乳糖胺（GalNAc），葡萄糖醛酸（GlcA）、糖醛酸（IdoA）、半乳糖氨基（Gal）、木糖（木酮糖）、分化抗原簇44（CD44）。

肺泡上皮糖盏降解的机制

最近的研究表明，肺泡上皮糖萼在多种小鼠肺损伤模型中降解，这表明它可能在ARDS的发病机制中发挥重要作用。Haeger及其同事发现，在气管内给予脂多糖（LPS）后，包括HS和CS在内的GAG 会进入小鼠的肺泡腔，但不会进入循环。这些结果得到了体外实验的支持，在体外实验中LPS诱导培养的A549上皮细胞中HS脱落。有趣的事，这些发现并非LPS独有，因为在博来霉素诱导的肺损伤小鼠模型中，HS也会流入支气管肺泡灌洗液中，其中观察到完整全长的和高度硫酸化的HS在最初损伤后在肺泡腔中持续3周。此外，流感感染后也会发生类似的上皮糖萼降解，这会诱导GAG向肺泡腔大量和长时间脱落。与在这些模型中观察到的肺泡腔大量GAG 脱落形成对比，这些模型的特征是初始上皮损伤（所谓的“直接”肺损伤），我们几乎没有观察到盲肠结扎和穿刺（CLP）后肺泡上皮糖萼降解的证据，该模型主要以肺内皮功能障碍（所谓的“间接”肺损伤）为特征（图2）。总之，这些实验室发现表明，直接形式的肺损伤诱导上皮糖萼降解，对肺内皮糖萼的影响最小。相反，间接形式的肺损伤诱导显著的内皮糖萼降解，对上皮糖萼的损伤最小。对危重患者的观察性研究支持了直接与间接肺损伤中糖萼降解的区别。

与糖萼脱落的这种区别一致，驱动内皮和上皮糖萼降解的机制是不同的。在败血症相关的内皮糖萼降解中，GAG的脱落是由乙酰肝素酶（一种HS特异性葡萄糖醛酸酶）的激活介导的，乙酰肝素蛋白酶直接降解HS并向血浆中释放小的八糖片段。这与直接肺损伤相关的肺泡上皮糖萼降解形成对比，在此过程中脱落的GAG基本上是完整的（长度>20 个多糖）并且高度硫酸化。肺泡间隙中全长GAG的存在表明，上皮糖萼降解是由切割将GAG锚定在上皮表面的蛋白聚糖的酶介导的，而不是葡萄糖醛酸酶（如乙酰肝素酶）或其他聚糖靶向酶直接将GAG切割成小片段。事实上，小鼠气管内博来霉素后乙酰肝素酶的诱导性缺失对博来霉素后持续的肺泡腔内GAG脱落没有影响。类似的，乙酰肝素酶成分的缺失并不能阻止气管内LPS后肺的严重损伤。值得注意的是，这些结果与Li及其同事的研究结果相矛盾，Li及其同事报告称，乙酰肝素酶的药理学抑制减弱了LPS诱导的A549细胞和小鼠LPS诱导的肺损伤的紧密连接损伤。此外，尽管已发表的文献中大部分都集中在HS脱落的机制上，但值得注意的是，CS 和HA在肺损伤期间也会脱落到肺泡腔中。CS脱落也可能是多配体聚糖脱落的结果，多配体聚糖可能具有CS侧链。或者， CS和HA的脱落也可能是多功能蛋白聚糖（含有通过核心蛋白与HA相互作用的大CS-蛋白多糖）脱落的结果。

最近的研究强调，在直接肺损伤期间，上皮糖萼的降解可能是由多种冗余蛋白酶介导的。例如，LPS和博来霉素都诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，MMPs是能够裂解蛋白聚糖（如syndecan-1）的蛋白酶，将GAG锚定在上皮表面。LPS与MMP 9和（在较小程度上）MMP 2的诱导有关；有趣的是MMP 9的基因敲除不会减弱上皮糖萼脱落，这可能是由于MMP 2的代偿性上调的结果。类似地，博来霉素诱导肺泡MMP 2的早期激活，随后诱导MMP 9的后期激活。此外，Gill及其同事的研究表明，MMP7是一种重要的蛋白酶，可促进syndecan-1从上皮糖萼脱落。总之，这些发现表明广泛的MMP抑制对于减轻直接肺损伤中糖萼脱落可能是必要的。事实上，多西环素是MMPs和相关蛋白酶的广泛抑制剂，可减轻LPS、博来霉素或流感感染中上皮糖萼脱落和/或肺损伤的严重程度。其他蛋白酶，如去整合素样金属蛋白酶（ADAMs），也可能有助于肺损伤期间上皮糖萼降解的程度。Pruessemeyer和同事证明，ADAM17介导sunndecan-1和-4从上皮细胞表面脱落，以响应肿瘤坏死因子（TNF）α 和干扰素（IFN）γ。总之，这项工作表明，在直接肺损伤后，一个复杂的系统中，包括MMPs和ADAMs在内的蛋白酶的冗余诱导介导上皮糖萼降解。

图2：健康和肺损伤期间肺的上皮和内皮糖萼。（A） 在稳态期间，肺具有肺内皮糖萼和肺泡上皮糖萼。吸入性损伤引起的肺损伤（“直接肺损伤”）与肺泡上皮糖萼的降解有关。相反，全身损伤引起的肺损伤（“间接肺损伤”）主要以肺内皮糖萼降解为特征。值得注意的是，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者通常同时有多处损伤，这可能导致内皮和上皮糖萼的降解。（B） 小鼠的直接肺部损伤（脂多糖、流感、博来霉素）诱导HS脱落到肺泡液中（支气管肺泡灌洗，经尿素稀释校正）。（C） 小鼠间接肺损伤（CLP）不会诱导HS脱落到肺泡液中。（D）CLP确实诱导HS从内皮糖萼脱落到血浆中（每组n>5541只小鼠）*p＜0.05。脂多糖（LPS）、IT（气管内）、IN（鼻内）、病灶形成单位（FFU）、盲肠结扎和穿刺（CLP）。

ARDS期间肺泡上皮糖萼降解的后果

上皮屏障功能障碍

为了确定上皮糖萼降解在肺损伤中的可归因作用，我们的开发了一种靶向、酶促（细菌肝素酶诱导）降解上皮糖盏的小鼠模型。使用该模型，我们观察到靶向上皮糖萼降解足以诱导BAL蛋白含量的增加。令人惊讶的是，在没有肺泡炎症或肺水肿发展的情况下，肺泡对蛋白质的渗透性增加，这表明上皮硫酸乙酰肝素的降解不仅仅是对肺泡隔膜造成非特异性损伤。有趣的是，这些发现对HS降解是特异性的，因为软骨素酶对上皮CS的类似靶向降解不会损害小鼠的上皮屏障功能。尽管上皮糖萼脱落导致上皮屏障功能障碍的确切机制尚不清楚，但Brauer及其同事的研究表明，细胞膜syndecan-1通过促进细胞保护信号传导来调节对流感的反应，从而限制支气管上皮细胞凋亡并减轻肺损伤。这些发现表明，上皮糖萼降解可能通过增加上皮细胞凋亡而损害屏障功能，这可以解释在靶向上皮糖萼退化过程中没有显著炎症反应的情况下发现屏障通透性增加。此外，重要的是要注意，上皮糖萼对屏障完整性的重要性并不局限于肺，因为多个研究已经证明了糖萼对其他上皮界面（包括肠道和眼睛）屏障功能调节的重要性。

表面活性物质的功能障碍

表面活性剂是由肺泡II型上皮细胞分泌到肺泡间隙的脂质（90%）和蛋白质（10%）的复杂混合物，用于降低气液界面的表面张力，以防止呼气过程中肺泡塌陷。肺泡上皮糖萼介于上皮细胞和表面活性剂之间；然而，上皮糖萼结构可视化方面的技术挑战限制了对这两种结构之间潜在相互作用的研究。我们最近报道，肺泡上皮糖萼的HS靶向降解会损害表面活性物质功能，导致微小的肺不张和肺顺应性受损。有趣的是，向未受伤的小鼠添加外源性GAG片段（HS或CS）并没有诱导顺应性丧失，这表明表面活性物质功能障碍是由天然糖萼损伤引起的，而不是肺泡腔中出现的GAG片段。

观察性人体研究支持了这些发现的临床相关性，其中肺泡腔GAG片段可以预测呼吸衰竭的持续时间。此外，患有溶酶体疾病（如IIIA型粘多糖病）的患者，表现出表面活性物质代谢受损和肺功能下降。尽管上皮糖萼支持表面活性物质功能的确切机制目前尚不确定，但我们观察到肝素，一种高度硫酸化的HS形式，可以直接与表面活性物质蛋白A、B和D结合。表面活性物质蛋白A和D都属于蛋白质的集合蛋白家族，其含有能够与聚糖结合碳水化合物识别的结构域。我们推测，完整的上皮糖萼可以将表面活性物质限制在上皮上，确保维持肺泡复张所需的最佳表面活性物质分布。

受损上皮修复

除了对肺部生理的这些急性影响外，肺泡上皮糖萼的降解阻碍了从肺损伤中恢复。在博来霉素诱导的肺损伤（一种模型，肺损伤后会有一段较长的恢复期）期间，HS片段在最初的损伤后在肺泡腔空间中持续3周。博莱霉素给药后7天开始使用广泛的MMP抑制剂多西环素治疗，减弱了GAG的持续脱落，改善了肺功能，这表明持续的糖额降解可能会阻碍上皮修复过程。尽管这些发现的确切机制尚不清楚，但Atlemeier及其同事的研究表明，syndecan-1对肺上皮的迁移和粘附很重要，这表明synndecan-1的脱落可能与上皮修复受损有关。此外，Parimon及其同事的研究表明，synndecan-1的脱落通过细胞外小泡调节上皮重编程，影响肺纤维化和肺肿瘤的发生，通过调节外泌体miRNA，影响肺损伤的进展或恢复。此外，考虑到上皮糖萼是屏障功能所必需的，这种延长的GAG脱落可能会延迟正常肺泡毛细血管完整性的恢复。最后，脱落的GAG片段在生物学上也是活性的，能够结合和螯合肺修复性生长因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）和肝细胞生长因子。

加剧继发性细菌性肺炎的严重程度

除了肺泡上皮糖萼降解对肺损伤和修复的直接影响外，上皮糖萼退化还可能影响宿主-病原体的相互作用。尽管众所周知，病毒性肺炎使肺部对严重的继发性细菌性肺炎的易感性增加，但发生这种情况的机制尚不完全清楚。最近有报道称，流感损伤了肺部微环境，诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）成孔细胞毒素A/B（LukAB）上调，这将增加继发性MRSA 肺炎的严重程度。有趣的是，在流感感染期间脱落的肺泡上皮HS结合并激活LukAB，导致流感后MRSA肺炎的严重程度。对syndecan-1在角膜感染中脱落的研究表明，上皮糖萼脱落可能通过其他机制促进继发性细菌感染，例如促进链球菌粘附到上皮表面的隐蔽纤连蛋白位点或螯合宿主保护性阳离子抗微生物肽。

透明质酸在上皮糖萼中的作用

如上所述，HA与HS和CS的不同之处在于，它既不被硫酸化，也不共价结合到上皮表面。考虑到这些结构差异，HA 在上皮糖盏中也具有不同的功能也就不足为奇了。与其他GAG一样，上皮 HA在多种形式的肺损伤中脱落，包括炎症性肺病和肺纤维化，通过透明质酸酶和炎症刺激物的作用，如活性氧。此外，在损伤后，肺产生临时HA糖萼，其可以以环境依赖的方式具有保护和有害作用。例如，HA产生增加和/或HA清除受损引起持续的先天炎症反应，该反应由HA结合蛋白介导，包括肿瘤坏死因子（TNF）刺激的基因6。在这里，HA的增加导致重链HA复合物的产生，其可以降解为较小的LMW 片段，这些片段可以与细胞受体（包括CD44、TLR4和TLR2）结合，并影响下游生物效应，包括炎症和纤维化。此外，最近的研究也表明，HA的失衡影响小鼠流感的结局，在此期间，HA与HA结合蛋白间α-抑制剂复合，最终导致持续的炎症和肺功能下降，这种作用可以通过给予外源性透明质酸酶来消除。Kratochvil及其同事最近的研究也强调了上皮HA在炎症性肺疾病中的临床重要性，该研究表明HA是新冠肺炎患者呼吸道分泌物的主要成分。最后，除了肺损伤过程中HA脱落的这些炎症后果外，HA片段和相关蛋白，如α间抑制剂，已被证明会影响上皮钠通道的活性，这可能会影响肺泡液清除和ARDS 的发病机制。

肺泡上皮糖萼降解作为ARDS异质性的介质

强有力的实验室数据未能转化为有效的ARDS治疗，越来越多地归因于这种复杂疾病的机制异质性。Calfee及其同事确定了ARDS的两种不同表型，每种表型都可能出现不同（可能相反）的治疗反应。这项工作激发了对ARDS精确医学方法的兴趣，其中基于生物标志物的快速识别导致肺损伤的特定机制将使个性化的靶向疗法成为可能。上皮糖萼降解可能是导致ARDS患者肺损伤的一种异质和潜在的靶向机制。有趣的是，ARDS中GAG脱落的异质性取决于损伤特异性因素（直接与间接）以及意外的患者因素（如性别）。

快速识别上皮糖萼降解引起肺损伤的患者亚组的能力将非常有用，因为这将能够丰富旨在确定预防糖萼降解治疗效果的临床试验的预测和/或预后。GAG是一种很有前途的生物标志物，部分原因是其稳定性：它们是不受蛋白酶影响，并且对冻融循环具有持久性。尽管具有多重反应监测的质谱是GAG定量的金标准，但这种方法成本高昂，并且依赖于高水平的技术专业知识。我们的团队最近优化了一种简单而便宜（每个样本2美元）的GAG比色测定法（二甲基亚甲蓝），该法在尿液（反映排泄的循环GAG，从而反映内皮糖萼降解）和HME液（反映肺泡上皮糖萼降解）。此类检测可能有助于确定亚组的患者，这些患者最有可能受益于旨在防止GAG 脱落的治疗策略，如MMP抑制剂或MMP阻断单克隆抗体。

结论

肺泡上皮糖萼是一种复杂且研究不足的结构，对肺稳态和肺损伤发病机制都具有重要性。在损伤过程中，多种炎症刺激激活MMPs和其他（可能是多余的）蛋白酶，裂解能够将糖萼锚定在上皮表面的HSPG和CSPG。上皮糖萼的随后脱落具有重要的后果，对于肺损伤的发生和发展至关重要，包括肺泡高渗透性、表面活性物质功能破坏、细菌毒力增加和上皮细胞修复受损。需要进行额外的观察性研究，以更好地了解上皮糖萼降解对肺损伤异质性的影响，从而有可能使上皮糖萼成为ARDS精确医学方法中的治疗靶点。

原文地址：

标题：The role of the alveolar epithelial glycocalyx in acute respiratory distress syndrome

作者：Alicia N Rizzo;Eric P Schmidt

出处：Am J Physiol Cell Physiol. 2023 Apr 1;324(4):C799-C806. doi: 10.1152/ajpcell.00555.2022. Epub 2023 Feb 27.

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