疫苗前沿 | DNA疫苗难以产生免疫原性？无针注射系统或能改善DNA疫苗接种效果！

DNA疫苗始于20世纪90年代，当时，Wolff等人将外源基因的DNA质粒直接通过肌肉注射入小鼠体内，注射后60天，在小鼠体内检测到外源基因的局部表达蛋白。Wolff等人和其他研究小组发现，由于注射的质粒DNA大多以非复制、未整合的环状形式存在，这些注射入体内的外源基因质粒被整合入宿主基因组中的占比可以忽略不计，甚至远远低于自发性突变的概率，也就是说，DNA疫苗并不会引发危险的基因突变。此外，在临床前和临床试验中，与病毒载体疫苗相比，DNA疫苗也未发现会诱发自身抗体的异常强化，从而消除了导致自身免疫性疾病的风险。

DNA疫苗的给药途径包括肌内注射（IM）、皮内注射（ID）、经黏膜或皮下注射（SC）、口服、静脉注射等。与其他类型的疫苗相比，DNA疫苗的优势包括接种方式和接种途径的安全性的提高 、良好的可调控性、生产过程的简化、成本效益的提高等。而DNA疫苗在一般环境温度下的稳定性质，也优于mRNA疫苗所需的超低温储存和冷链运输,更加易于储存和运输。

与减毒活疫苗相比，DNA疫苗具有安全的临床特征，DNA疫苗中含有的简化DNA序列，使抗原毒力缺乏恢复到病毒毒力的能力，也不会影响到接种者的正常基因。此外，DNA疫苗能够以不同的DNA序列为基础，激活接种者的自然体液免疫和细胞免疫，灵活地刺激机体产生不同抗原。加上DNA疫苗可以快速生产并广泛分配到资源有限的地区，将DNA疫苗应用在流行病爆发中进行的大规模疫苗接种措施中尤为重要。

目前，DNA已被用于传染病、癌症、过敏、自身免疫性疾病和基因治疗的疫苗和治疗方法。多种疫苗已获得兽医应用许可。最近在临床试验中调查的预防性DNA疫苗包括针对汉坦病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感、寨卡病毒（ZIKV）、WNV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2病毒。临床前研究或临床试验中的研究性预防性DNA疫苗的非病毒适应症包括金黄色葡萄球菌、结核病、副隐孢子虫、疟疾和弓形虫病。2021年，使用PharmaJet Tropis皮内无针注射系统（NFIS）的Zydus Lifesciences公司的COVID-19疫苗ZyCoV-D获得了印度药品管理局的批准，这是第一个应用于人类的DNA疫苗

DNA疫苗的作用   

DNA疫苗的作用机制是，机体接种含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA后，被接种者的体细胞摄取，随后经过转录、翻译，表达出相应的抗原，诱导机体产生免疫应答，故而DNA疫苗中所含质粒的选取尤为重要。

早期DNA疫苗中使用的质粒来源于细菌，但细菌的质粒序列有可能无法在哺乳动物细胞中产生良好的基因表达，也存在一定的安全问题，例如，选取的质粒中如果含有细菌的抗生素抗性基因，该基因可能影响宿主体内正常微生物群或诱导炎症反应。现在所应用的DNA疫苗则减少了细菌序列的数量，以实现抗原表达增加的同时减轻安全问题。而对DNA疫苗的研究越深入，需要人们着手解决的问题则越多，除了要筛选低风险、高表达的质粒外，如何提升DNA疫苗的作用效果的问题，仍然横在人们面前。

DNA疫苗的实际作用，取决于其内抗原能否被接种者的细胞高效摄取。要引起免疫反应，DNA疫苗必须穿透细胞外膜和细胞核膜的障碍，才能得到复制和表达 。此外，一旦疫苗中含有的质粒接触到机体内的核酸酶，质粒就会被迅速降解，甚至得不到表达的机会。因此，通过针头注射器（NS）注射的DNA疫苗中，只有少量质粒被细胞吸收，而大部分滞留在细胞外，这种低下的吸收效率影响了抗原的产生，使应该被表达出来的抗原无法呈现给免疫系统，直接导致抗原表达不佳与免疫反应无效。为了应对这些挑战，大量的研究致力于开发能够提高DNA疫苗接种后的免疫反应的技术。对于疫苗本身，已经有修改疫苗中基因序列（密码子优化、启动子选择、基因佐剂、添加APC或T细胞靶向序列、去除细菌序列）、添加铝盐佐剂、添加化学递送物质（脂质或PLGA纳米颗粒、PEI阳离子聚合物）等方法，也有许多研究团队将目光落在了最基本的疫苗接种方法上，探寻电穿孔、粒子介导的表皮递送、NFIS、微针等物理接种方法的有效性。近期，一篇发表在vaccines杂志上的文献，就总结了时下众多有关DNA疫苗物理接种方法的研究

 doi: 10.3390/vaccines11020280. 

改善DNA疫苗效果的接种方法   

1、粒子介导的表皮接种（PMED）

粒子介导的表皮接种技术又称为 “基因枪 ”、“粒子轰击”，是使用特制的弹道装置，借助氮、氦等压缩气体动力产生的冷气体冲击波，将携带DNA的金粉微粒经由皮内或粘膜途径轰击细胞（图1）。研究表明，与其他递送方法相比，PMED方法诱导的免疫反应更主要基于Th2，因此诱导的细胞免疫水平较差。这种方法还因为每一粒金粉微粒只能携带少量的DNA，存在单次接种的疫苗剂量太少的关键缺陷，以至于必须在多个时间、对不同皮肤表面区域进行多次接种，才能获得合适的接种剂量。其他缺点包括药物产品难以储存、金粉携带DNA性质不稳定、接种过程和效果不可控等问题，故而PMED传递现在不再用于人群DNA疫苗接种。不过这项技术正在部分临床前研究中重新进行评估，也许会有新的发现。

2、电穿孔 （EP）

电穿孔技术主要用于在接种DNA疫苗后增加质粒在细胞内的传递，以增强免疫反应（图1）。

电穿孔技术的使用方法是：在用NS注射DNA疫苗后，通过一个或多个插在疫苗接种部位附近的针头施加电流，产生电脉冲，使接种部位的细胞打开临时通道，从而增加细胞膜的渗透性，使质粒高效进入细胞质并转入细胞核。这种方法可以使DNA疫苗的质粒转染率提高100-2000倍。产生的电脉冲还会引起局部细胞死亡和组织损伤，引起机体产生损伤相关分子模式的释放，算得上是一种“物理佐剂”；EP还能引起局部产生炎症细胞因子以及局部APC和T细胞的迁移。通过这种方式，可以将免疫反应增加10-1000倍。

EP最常见的不良事件是注射部位的疼痛和出血，其他缺点包括需要接入电源、设备昂贵笨重、肥胖患者使用困难、需要评估出具个体化电穿孔方案，以及引起组织损伤后可能产生的有害影响。最近，EP也已加入临床试验，以促进COVID-19、HPV、MERS和各种癌症的DNA疫苗研究。

3、无针注射系统 （NFIS）

NFIS的开发可以追溯到20世纪30年代，人们用这种方法防治天花、小儿麻痹症和麻等传染病的流行。NFIS器材开口狭窄，通过高压产生的高速喷射流，可以在零点几秒内穿过开口并有效刺穿皮肤，将注射液送入体内、IM或SC组织（图1）。NFIS的主要包括以气体或弹簧为动力的设备，不需要接入电源，也不需要使用针头，可以为每个接种者快速提供一次注射或连续多次注射。早期受生产力水平限制，多使用重复注射器，常造成交叉污染，到20世纪90年代，NFIS设备基本上全部更新为一次性注射器，解决了这一问题。

新一代NFIS相较以往有了很大的改进，更加便携、易于操作，并能够使用一次性的、可自动停止的注射器快速进行数千次的注射。现代研究展现出了NFIS的一个重要优势：与传统的疫苗递送方法相比，喷射接种疫苗可能会增强接种后的免疫原性，其中一部分原因是注射液在组织内的分散更广，使质粒可以更有效地呈递到细胞中。此外，研究人员还发现，用NFIS注射的疫苗还有节省剂量的效果，与使用NFIS或NS进行的全剂量注射相比，用NFIS注射的小剂量疫苗同样可以保证合适的免疫原性和保护效力。

节省疫苗的接种剂量代表的是疫苗的“应急能力”，这样的效果可以使人们快速应对紧急公共卫生需求和危急情况，而不需要再焦头烂额地想办法提高疫苗制造能力和制造规模。与NS相比，NFIS能够以更快的注射时间提供稳定而准确的注射量，大大减少了疫苗的浪费。

NFIS的好处不止于此。顾名思义，无针注射系统最重要的优势就是减少了针头的使用量，降低了医疗废品处理成本，照顾了全球发病率高达32%的针头恐惧症患者的感受，以及消除了针头重复使用和针刺伤的风险。要知道，全世界56%以上的医护人员在职业生涯中都会出现被医疗针头刺伤的情况，面临着严峻的职业暴露危机，不得不说，这个优点对于一线疾控人员极为友好。

与传统的接种方法相比，患者自然而然更偏好NFIS，而且NFIS引起的不良反应可能更小。因此，在大规模疫苗接种活动中，NFIS被认为是NS的一种有吸引力的替代方法，尤其是在资源有限的偏远或农村地区，通过NFIS接种也比NS接种更具成本效益。最近，NFIS被用来提供预防性DNA疫苗的适应症，包括COVID-19、HIV、寨卡病毒、HPV、流感、登革 热、脊髓灰质炎、麻疹-腮腺炎-风疹病毒感染、葡萄球菌和结核病细菌感染，以及疟疾和隐球菌寄生感染。

当然，没有接种方法是十全十美的。NFIS的缺点包括：在不经常使用NFIS的地区，医护人员对其缺乏了解；较NS相比，NFIS的成本更依赖具体生产能力、卫生应用领域、需求量及生产规模，高收入与中低收入国家之间存在的差距造成普及推广NFIS有一定困难；由于人群和疫苗种类特性不同，注射渗透率存在差异；需要预先设定注射量；不适用于静脉注射，也不能以预填充的形式提供；可能会增加注射部位的疼痛和基于注射物类型的不良反应；由于包括疫苗剂量、给药途径、动物模型选择等各种复杂因素，与其他物理给药方法相比可能会降低免疫原性或临床疗效。

图1.用于DNA疫苗的物理传递方法概述

（A）四种类型的物理递送方法的描述。

（B）在注射过程中， DNA疫苗被插入皮内、皮下或肌肉组织层，

（C）然后DNA被运送到细胞中，

（D）并进入细胞核， 

（E）在那里DNA被转录成mRNA，

（F）然后在细胞质中被翻译成抗原肽，经过处理后

（G）在细胞表面呈现给各种免疫细胞，以诱发体液和细胞免疫反应。NFIS=无针注射系统；N/S=针头和注射器；EP=电穿孔；PMED=颗粒介导的表皮传递。

NFIS与EP、PMED的比较   

截至目前，在提高DNA疫苗的免疫原性和疗效的研究中，EP是研究数量最多的物理传递方法。与EP相比，NFIS具有不需要外部电源、使用简单便捷等优点，也消除了接种者感知到与插入针头和电脉冲有关的不良刺激等。

在将NFIS与这些先前建立的方法进行比较时，最初的临床前实验通常会测量接种前和接种后的免疫原性和临床反应，并评估便捷性和患者耐受性，最后再推进到临床试验。对于PMED，它的研究热度已经趋于消散，也不再被常规使用，因此对这一方法不再赘述。对于EP，现在已有许多研究报告称，NFIS方法接种疫苗后的免疫原性反应往往不逊于EP，并且更容易使用，也更容易耐受。相关的临床前研究摘要见表1。

表1.比较质粒DNA疫苗输送与NFIS、EP或PMED的研究

NFIS的应用   

1、传染病流行期间使用NFIS接种DNA疫苗

在传染病爆发期间，人们需要紧急生产和大规模使用疫苗，以减少病毒传播和疾病发病率。NFIS对包括COVID-19、流感和HIV在内的流行病毒的DNA疫苗投放的影响相关研究摘要见表2。

表2.用NFIS接种的流行病毒质粒

2、NFIS为新出现的传染病提供DNA疫苗接种

已有研究团队为多种新出现和重新出现的传染病或有可能作为生物武器使用的病毒制剂开发了基于DNA的疫苗。与前述结果类似的是，在临床前和临床试验环境中，与传统的NS接种相比，NFIS接种提高了接种后的免疫原性。相关的研究摘要见表3。

表3.用NFIS接种的新发传染病质粒DNA疫苗

NFIS的现状和前景   

通过NFIS递送的预防性DNA疫苗往往能诱导出不逊于电穿孔的免疫原性，而且与NS方法相比，更能增强免疫反应。无针注射系统（NFIS）可以诱导有效的免疫原性，增强保护效力，颠覆了传统NS接种的方式，是一个有吸引力的替代方案，2021年紧急批准使用完全通过无针注射系统提供的针对COVID-19的DNA疫苗后，疫苗接种技术和DNA疫苗的普及都取得了里程碑式的发展。

与传统的NS接种方法相比，新一代NFIS具有几个重要的优点。提高疫苗接种后的免疫原性是所有疫苗研发者共同的目标，而NFIS能更有效地将DNA送入细胞以产生所需的抗原，通常产生超过NS且与EP相当的免疫原性，毕竟NS有时也不能诱发有效的免疫原性。这种增加的免疫原性有望转化为更强的保护效力。

在比较EP和NFIS时，也可以看到NFIS有更多的优势，包括减少医疗废品处理成本，易于使用，以及更舒适的病人体验等。使用NFIS还可以有效地诱导体液和细胞免疫，COVID-19疫苗的Th1偏向反应研究显示，NFIS还可以产生独特类型的免疫反应。临床前动物模型也表明，在免疫抑制和怀孕期间等特殊临床状态下，用NFIS接种疫苗可以和其他接种方法一样有效。

NFIS具有节省剂量的作用，可以减少诱导有效免疫反应所需的质粒剂量，这在需要大规模快速生产DNA疫苗的某些传染病大流行中可能至关重要。腹腔皮肤有丰富的免疫细胞群，在该区域注射更能产生这种效果。事实上，NFIS已被用于针对其他病毒感染的大规模疫苗接种措施，并被证明比NS接种更具成本效益。

现在已有可以与NFIS相结合的其他技术，提高疫苗的免疫原性和保护作用。与传统的质粒DNA疫苗相比，合成的线性doggybone DNA消除了质粒DNA中的细菌基因，安全性又说提高，可以在GMP级别下更快速地生产。NFIS传递dbDNA疫苗并诱导出有效的免疫原性和保护作用的能力，使这项技术成为设计疫苗接种方案的一个有吸引力的选，比如，NFIS传递LNP配制的DNA疫苗能够以更快的速度和更少的DNA产生安全和更有力的免疫反应。另外，与佐剂（如CpG ODN）共同给药的DNA疫苗在NFIS中也是可行的，同样能提高免疫反应。

不过，NFIS并不总是成功的，根据DNA疫苗研发技术的不同，NFIS可能带有一定的局限性。与其他接种方法相比，导致免疫原性或临床疗效不佳的原因可能很复杂，包括所选择的动物模型物种、DNA构建体的序列和密码子优化、分子或传统佐剂的使用、注射途径（ID、IM、SC）、疫苗剂量、接种时间表、异源增效的使用、是否使用了LNP等免疫增效制剂，以及其他因素之间的相互作用。

总而言之，NFIS使用起来简单安全，通过临床开发项目和大规模免疫活动证明了其耐受性，同时提供了提高传统和现代疫苗平台性能的潜力。因此，在设计DNA和其他基于核酸的疫苗项目时，应考虑使用这种技术。

参考文献   [1]Wolff, J.A.; Malone, R.W.; Williams, P.; Chong, W.; Acsadi, G.; Jani, A.; Felgner, P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 1990, 247, 1465–1468. [2]Ledesma-Feliciano C, Chapman R, Hooper JW, Elma K, Zehrung D, Brennan MB, Spiegel EK. Improved DNA Vaccine Delivery with Needle-Free Injection Systems. Vaccines (Basel). 2023 Jan 28;11(2):280. doi: 10.3390/vaccines11020280. PMID: 36851159; PMCID: PMC9964240. 

撰写 | Vaccine前沿

校稿 | Gddra  编审 | Hide / Blue sea

编辑  设计 |  Alice