SLC26A1是人类硫酸盐稳态的主要决定因素

Pfau A, López-Cayuqueo KI, Scherer N, Wuttke M, Wernstedt A, González Fassrainer D, Smith DE, van de Kamp JM, Ziegeler K, Eckardt KU, Luft FC, Aronson PS, Köttgen A, Jentsch TJ, Knauf F. SLC26A1 is a major determinant of sulfate homeostasis in humans. J Clin Invest. 2023 Feb 1;133(3):e161849. doi: 10.1172/JCI161849. PMID: 36719378; PMCID: PMC9888379.

硫酸盐在人体的许多生理过程中起着举足轻重的作用，包括骨骼和软骨健康。阴离子转运蛋白SLC26A1（Sat1）在肾脏中硫酸盐重吸收的作用得到了Slc26a1敲除小鼠中低硫酸盐血症和高硫酸盐尿症的观察支持。SLC26A1对人类硫酸盐稳态的影响仍有待确定。通过结合临床遗传学、功能表达测定和群体外显子组分析，我们将SLC26A1鉴定为人类的硫酸盐转运蛋白，并通过实验验证了几种功能丧失等位基因。对一名表现为疼痛性软骨炎、低硫酸血症和肾硫酸盐消耗的患者进行的全外显子组测序显示，SLC26A1 存在纯合突变，据我们所知，该突变以前尚未描述过。对5，000多人的全外显子组数据分析证实，罕见的，假定具有破坏性的SCL26A1变体与人群水平的较低血浆硫酸盐显着相关。功能表达测定证实，我们患者的SLC26A1突变以及群体研究中检测到的其他变异的硫酸盐转运显着减少，我们认为这是新的。总之，来自3种互补方法的综合证据支持SLC26A1活性是人类硫酸盐稳态的主要决定因素。鉴于最近有证据表明硫酸盐稳态与背痛和椎间盘疾病有关，我们的研究将SLC26A1确定为调节肌肉骨骼健康的潜在靶标。

介绍

硫酸盐参与人类的许多代谢过程。然而，它不是常规临床化学测试的一部分，很少有专业实验室提供这项服务。因此，与硫酸盐紊乱相关的临床数据必然很少（1，2）。肾脏在维持血浆硫酸盐在其生理浓度约为300μM（2，3）中起主要作用。硫酸盐在肾小球中自由过滤，然后通过近端小管上皮细胞重新吸收。跨细胞硫酸盐重吸收由顶膜硫酸钠共转运蛋白SLC13A1与基底侧定位的SLC26A1（硫酸阴离子转运蛋白1，Sat1））串联介导。

硫酸盐稳态紊乱已被描述为引起骨关节炎和软骨病。例如，狗的隐性遗传形式的骨软骨发育不良已被证明是由于SLC13A1突变导致的低硫酸血症。此外，最近的一项全基因组关联研究表明，椎间盘疾病是疼痛性软骨疾病的一个非常常见的例子，也与低血浆硫酸盐浓度和SLC13A1的罕见功能丧失变异有关。

相比之下，SLC26A1遗传变异在人硫酸盐稳态中的病理生理作用不太清楚;SLC26A1是硫酸盐和碳酸氢盐的pH敏感阴离子交换剂，其也介导草酸盐转运。在Slc26a1敲除小鼠中，已经报道了低硫酸血症和高硫酸盐尿症，而Slc26a1对草酸盐稳态的影响导致高草酸尿症和尿石症仍然存在争议。 在26例草酸钙肾结石患者中描述了SLC1A2的双等位基因突变），但未评估对硫酸盐平衡的影响。本工作旨在通过家族病例的遗传分析和功能分析，以及在近26，1名参与者的大型队列中的人群水平来阐明SLC5A000在人类硫酸盐稳态中的作用。

结果

在低硫酸血症和肾硫酸盐消耗患者中检测纯合子SLC26A1突变。

一名在我们诊所就诊的 33 岁患者一直患有从肋软骨关节放射的间歇性胸痛，这种疼痛无视诊断超过 6 年。症状发作时进行的磁共振成像 （MRI） 显示与第三和第四右肋脊关节软骨炎一致的变化，左侧发现较少（图1).尽管反复咨询代表不同专业的众多医生，包括在 3 个不同的学术医疗中心进行广泛的风湿病学检查，但软骨炎仍然无法解释。另一个值得注意的发现是在右肾的上花萼中有一个直径为13毫米的肾结石。她的肾功能正常。她的家谱显示，她的父母是堂兄弟（图2).她的两个兄弟姐妹没有表现出类似的症状。鉴于未解决的临床表现和父母的血缘关系，进行了全面的基因检测。

图1

MRI 显示第三和第四肋骨水平的软骨周围炎。

静脉注射造影剂（钆）后轴向脂肪饱和 T1 加权像：第三和第四肋骨（白色箭头）水平两侧肋软骨的线性对比增强，主要在肋软骨交界处，与软骨周围炎一致。还要注意右侧相邻软组织的微妙弥漫增强。

图2

临床病情检查显示血缘关系家族史。

指示患者的父母是堂兄弟。基因检测仅在4名家庭成员（患者，父母和1个兄弟姐妹）中可用。填充的符号表示临床受影响的个体（软骨病）。带有中心点的符号代表没有报告症状但在基因检测中与SLC26A1突变杂合的个体。E+标记检测到至少1个突变等位基因（c.824T>C）的个体。

经Sanger测序证实的全外显子组测序显示，该患者在阴离子转运蛋白824（SLC275A1）中存在突变（c.26T>C，p.Leu1Pro）纯合子。氨基酸列伊275位于SLC26A1的第四个跨膜结构域，并突变为脯氨酸，一种螺旋断裂残基。已鉴定的错义变化影响了不同物种之间高度保守的残基（图 3、A 和 B).在计算机预测工具中，SLC26A1变体一致地将SLC0A05变体归类为有害/有害（SIFT评分<2.0，PolyPhen-987得分= 15.<>）（<>）。据我们所知，这种突变以前没有被描述过。无症状的父母和她的兄弟是杂合子;剩下的妹妹选择不接受检测。

图3

SLC26A1变体在同源性模型上的映射。

(A）基于Prestin EMD-23334（43）的结构，利用瑞士模型服务器构建了SLC26A1同源模型。SLC26家族转运蛋白是二聚体;每种单体都以不同的颜色表示。第四个跨膜结构域突出显示，说明Leu的位置275.STAS结构域，硫酸盐转运蛋白和抗西格玛因子拮抗剂结构域。（B）SLC26A1在不同物种之间的部分对齐表明了高水平的保护。

如上所述，SLC26A1是一种阴离子交换剂，能够在异源表达系统中表达时介导硫酸盐和草酸盐转运（3，11）。如表1和补充表1（补充材料可在线获得本文;https://doi.org/10.1172/JCI161849DS1），与对照组相比，我们的患者的血浆硫酸盐明显降低，文献中报道的参考值，以及母亲，p.Leu275Pro的杂合携带者，其硫酸盐水平正常较低（2，16-18）。尽管存在低硫酸血症，但尿液中硫酸盐的排泄分数指数（FEI）（16）为0.24。据报道，硫酸盐的FEI在正常条件下为0.17-0.34（16），但已知硫酸盐排泄下降到非常低的水平，当硫酸盐消耗是由膳食硫酸盐的限制诱导的（10，17，19），或在硫酸盐需求增加的状态，如怀孕（20），即使血浆硫酸盐浓度正常。因此，观察到患者在血浆硫酸盐严重抑制时硫酸盐的平均FEI为18%，表明尿硫酸盐消耗，尿液中硫酸盐排泄分数异常高。24 小时尿液收集草酸盐排泄结果显示尿草酸值在 21.8-48.6 mg/天（平均 33.7 mg/天）之间，即正常至仅轻度升高（表1) (21）. 总之，这些观察表明，p.Leu275Pro突变明显影响了由于尿硫酸盐消耗而导致的血浆硫酸盐水平，对尿草酸盐水平的影响很小（如果有的话）。

表1SLC26A1纯合突变患者的血浆和尿液中测量的选定参数摘要（c.824T>C，p.Leu275Pro）

非洲爪蟾卵母细胞中检测到的SLC26A1突变（p.Leu275Pro）的功能分析证实硫酸盐转运减少。

为了确认SLC26A1突变（p.Leu275Pro）的功能相关性，我们在非洲爪蟾卵母细胞中表达了野生型（WT）SLC26A1和在我们患者中检测到的突变体。与WT蛋白（图 4、A 和 B).为了确定SLC26A1在细胞表面上的表达，将HA标签插入WT SLC26A1和Leu275Pro突变体的第二个细胞外环中（补充图1）。与WT相比，突变转运蛋白的细胞表面表达显着降低，如在非透化卵母细胞中进行的免疫荧光研究表明（图 5、A 和 B).使用针对HA标签或天然SLC26A1蛋白的抗体对表达WT和突变体SLC26A1的卵母细胞的膜蛋白进行蛋白质印迹，显示SLC26A1总体表达水平降低幅度相似（图 5，C 和 D分别）。这些发现表明，SLC26A1蛋白水平的降低，可能是通过部分错误折叠的转运蛋白的降解增加，对突变体的质膜转运活性降低有很大贡献。因此，这些研究证实p.Leu275Pro是一种人类功能丧失突变。

图4

表达突变体SLC26A1（p.Leu275Pro）的非洲爪蟾卵母细胞中的硫酸盐和草酸盐转运减少。

(A） SLC26A1介导的SO42−和（B）卵母细胞先前水注射或注射编码WT SLC10A26或Leu1Pro突变体SLC275A26的1ngcRNA，草酸盐摄取。从含有1mM SO的浴溶液中摄取42−或 1 mM 草酸盐 15 分钟。The SO42−使用来自4种不同青蛙（和3种不同的cRNA制剂）的卵母细胞进行摄取实验，总数为35 WT，30 Leu275Pro和33个水注射卵母细胞，草酸盐，6 WT，7 Leu275Pro和7个水注射卵母细胞。数据以平均± SEM 表示。***P < 0.001 乘以 1 因子方差分析与邦弗罗尼多重比较检验。

图5

非洲爪蟾卵母细胞中突变体SLC26A1（p.Leu275Pro）的细胞表面表达减少。

(A）定量非透化卵母细胞中免疫荧光的平均灰度值强度，携带HA作为WT SLC26A1[WT（HA）]或突变体SLC26A1[Leu275Pro（HA）]的第二个细胞外环上的标签。注射不含HA的SLC26A1的卵母细胞作为对照（WT）;注射10ng相应的cRNA。（B）代表性卵母细胞免疫荧光图片。比例尺：100 μm。WT n = 15， WT（HA） n = 17， Leu275Pro（HA） n = 16; 卵母细胞来自3种不同的青蛙（3种不同的cRNA制剂）。（C 和 D） 通过表达 HA 表位的卵母细胞膜免疫印迹定量 SLC26A1 蛋白表达 – 标记 （C） 或未标记 （D） WT 或 Leu275Pro 突变体 SLC26A1。C中使用了针对HA标签的抗体，D中使用了抗SLC26A1抗体（C末端）。蛋白质印迹包括来自WT SLC26A1的泳道或水注射卵母细胞作为特异性对照。对于这些实验，将10-15个卵母细胞注射10ng相应的cRNA合并，并使用肌动蛋白作为加载对照。用来自3种不同青蛙的卵母细胞重复蛋白质印迹至少3次（使用3种不同的cRNA制剂）。*P < 0.05;**P < 0.01 x 1 因子方差分析与邦弗朗尼多重比较检验 （A） 或非配对的 2 尾 t 检验（C 和 D）。

罕见的SLC26A1变体也会影响种群水平的血浆硫酸盐水平。

单个患者的临床遗传学研究通常需要至少一名其他无关患者或家庭的确认。人群水平全外显子组测序的最新进展现在为通过互补的人群水平分析对遗传发现进行正交验证提供了机会。因此，为了研究SLC26A1活性是否是人类硫酸盐稳态的主要决定因素，我们检索了罕见的编码SLC26A1变体之间的关联，这些变体被预测具有破坏性（见补充表2）与前瞻性德国慢性肾脏病（GCKD）研究的4，708名参与者中的血浆硫酸盐水平，该研究共招募了5，217名中度慢性肾脏病患者（22).我们在43个不同的参与者（以下简称携带者）中检测到130种罕见的编码变体（等位基因）。与130，4名未携带任何此类变异的GCKD受试者相比，578名携带者的血浆硫酸盐平均水平显着降低（P = 3.01 × 10–5，基因负荷测试）（图6和补充表2）。所有变异携带者均为杂合子。作为阴性对照，我们还重复了基因负荷测试，并在SLC26A1中仅纳入了同义变异，这些变异被认为是中性的（23），并且发现与血浆硫酸盐（P = 0.7）没有显着关联，正如预期的那样。

图6

GCKD研究中推定的破坏性SLC26A1变异体的携带者血浆硫酸盐中位数水平低于非携带者。

血浆硫酸盐水平（y轴）由SLC26A1罕见变异载体状态（x轴）显示。y 轴表示逆正态变换后的硫酸盐水平，单位对应于标准偏差。*表示代谢物对代谢物特性非常有信心，但尚未运行该代谢物的标准品。符号颜色表示观察到的罕见变体载体状态，以及符号形状变体结果（三角形、移码、圆形、误义）。盒子的范围从硫酸盐水平的第25个百分位数到第75个百分位数，中位数用一条线表示，晶须在距离盒子1.5×（四分位距）内的最后一个观测值结束。P < 0.001（来自聚合变异检验的 P 值 = 3.01 × 10–5).代谢物测量产生半定量而非绝对代谢物水平。

图7表明检测到的潜在破坏性43个变体分布在整个编码区域中。对血浆硫酸盐负面影响最大的变体，如p.Pro237Leu、p.Arg314Cys和p.Pro461Leu映射到SLC26A1的硫酸盐转运域，与功能丧失机制一致。在测试其对硫酸盐水平的总体影响时连续省略已识别的变体支持存在几个独立的变异（补充图2）。所有43种变体及其频率、预测后果、效应大小以及它们与血浆硫酸盐的个体相关性的P值都列在补充表2中。它们对于进一步的实验研究以及将来发现其他不明原因的低硫酸血症患者（可能是任何变异的纯合子或复合杂合子）都是一种宝贵的资源。

图7

GCKD研究中合格的SLC26A1变异及其定位，频率，后果，效应大小和效应方向。

聚集变异测试中包含的所有合格的稀有编码变异均绘制在SLC26A1（Uniprot IDQ9H2B4） 在 x 轴上。蛋白质结构域基于 Pfam 35.0。y 轴表示 4，708 名 GCKD 研究参与者中每个变体的次要等位基因计数。变体棒棒糖的形状与其预测的结果相对应。我们患者的突变（Leu275Pro）的位置也被注意到。变体棒棒糖的大小表示具有逆正态转化血浆硫酸盐水平的单个变体测试的效应大小的绝对值（补充表2），颜色表示效应大小的方向：深蓝色表示负面效应大小，浅蓝色表示阳性大小。效应大小小于 –1 或 P 值小于 0.05 的所有变体都标有其预测的氨基酸交换，而 P 值小于 0.05 的变体标记为红色。STAS结构域，硫酸盐转运蛋白和抗西格玛因子拮抗剂结构域。

由于GCKD研究的所有参与者都患有慢性肾脏疾病，我们评估了他们的肾脏过滤功能（量化为估计的肾小球滤过率（eGFR））是否影响变异与血浆硫酸盐水平的关联。如补充图3所示，30名潜在破坏性SLC26A1变体的携带者，其eGFR为60 mL / min / 1.73 m2或更高，即更好的肾功能，平均血浆硫酸盐水平甚至低于eGFR降低（<60 mL/min/1.73 m2) (P < 0.001，未配对 t 检验）。当仅对同一变体的载体（即Asp636Tyr和Leu348Pro，其有足够数量的载体可用）重复子分析时，这一观察结果得到了证实。因此，检测到的SLC26A1变体对血浆硫酸盐水平的影响也可以在肾功能未降低的人群中检测到。

在GCKD队列中，在收集这些信息的6年访问中，在携带者状态与自我报告的肾结石之间没有发现关联（Fisher的确切测试，P > 0.1）。

功能分析显示GCKD研究中鉴定的SLC26A1变体的硫酸盐转运减少。

为了测试GCKD研究中鉴定的潜在破坏性SLC26A1变体是否损害硫酸盐转运，我们将WT SLC26A1的硫酸盐转运与卵母细胞表达系统中的变体p.Pro237Leu，p.Leu348Pro，p.Thr185Met和p.Ser358Leu进行了比较。根据补充表4选择2种变体：变体Pro237Leu对血浆硫酸盐水平的影响最大;Leu348Pro是唯一一种SLC26A1变体，其先前在人群研究中曾报道过人硫酸盐稳态紊乱，但未经实验验证（24）;以及Thr185Met和Ser358Leu，在先前的出版物中以化合物杂合状态在1名肾结石患者中报道（14），但在GCKD研究的携带者中单独检测到。

如图8，所有 4 种变体的硫酸盐转运均显著降低，Thr185Met 的减少幅度最大，Pro237Leu 的降低量最低。当与WT SLC1A1以每个卵母细胞的cRNA总量恒定总量26：1共表达时，具有最突出效应的突变体Thr185Met将硫酸盐转运降低至约25%（补充图4）。由于SLC26基因家族的转运蛋白可以组装成功能性二聚体（25），这预测WT与突变体25：50共表达时存在25%WT / WT，1%WT /突变体和1%突变/突变转运蛋白，因此转运减少75%与p.Thr185Met突变体的强显性负面影响一致。

图8

GCKD研究中确定的SLC26A1变异的功能评估。

SLC26A1介导的SO42−先前水注射或注射编码WT SLC10A26或指定突变体（Thr1Met，Pro185Leu，Leu237Pro和Ser348Leu）的cRNA的卵母细胞摄取。从含有358mM SO的浴溶液中进行摄取42−15分钟。实验使用来自4种不同青蛙（和3种不同的cRNA制剂）的卵母细胞进行，总数为36 WT，23 Thr185Met，41 Pro237Leu，41 Leu348Pro，33 Ser358Leu和40水注射。数据以平均± SEM 表示。***P < 0.001 乘以 1 因子方差分析与邦弗罗尼多重比较检验。

讨论

我们的患者表现出我们认为是新型纯合子SLC26A1突变（Leu275Pro）导致尿硫酸盐消耗和低血浆硫酸盐，这与在Slc26a1空小鼠中观察到的低硫酸盐血症和硫酸盐排泄分数升高一致（10）。功能表达研究表明，突变的人类转运蛋白由功能丧失等位基因编码，导致硫酸盐转运能力的实质性缺陷。在一项大型观察性研究中，通过全外显子组测序检测到的罕见有害SLC26A1变异的杂合携带者的血浆硫酸盐水平显着降低，进一步证实了SLC26A1在硫酸盐转运中的重要性，该研究证实并扩展了先前的报告，即基因分型SLC26A1错义变异（Leu348Pro）与硫酸盐稳态有关（24 ).在群体研究中鉴定的等位基因（包括上述Leu348Pro）的功能相关性在表达研究中得到了实验验证。

最近，SLC13A1的罕见功能丧失变异已被证明与低硫酸血症，背痛和椎间盘疾病有关，这是疼痛性软骨疾病的另一个例子（7）。因此，下硫酸血症很可能是我们患者机械性高应力关节的无法解释的软骨炎的原因。值得注意的是，症状在患者第一次怀孕结束时开始，这种情况与硫酸盐需求增加（18，26）。正如转染突变体SLC26A1的卵母细胞的功能分析所证明的那样，转运活性并未被患者突变完全消除，这可能解释了为什么我们的患者没有表现出更严重的肌肉骨骼系统异常，除了在双能X射线吸收测定法中骨矿物质密度略有降低，与先前对硫酸盐水平较低的个体的报告一致（24）。

关于SLC26A1和人类硫酸盐相关疾病的数据很少（24）。在Slc26a1敲除小鼠中，硫酸盐稳态的紊乱被一致描述（10，11），但没有报告肌肉骨骼异常（4，10，11，13）。 然而，它们也没有被明确审查，可能很容易被忽视。

GCKD队列并非旨在评估潜在的低硫酸盐血症相关肌肉骨骼疾病，包括关节或背部疼痛，关节病或纤维肌痛。因此，我们的研究仅允许携带者状态与血浆硫酸盐水平的相关性。此外，低硫酸血症相关症状可能非常微妙，如早期关节病或关节疼痛，如果不积极筛查，在临床实践中可能很容易被忽视，这强调了后续临床研究的必要性，以确定SLC26A1与肌肉骨骼健康之间的关系更确定。

Gee及其同事在26名无关的草酸钙肾结石患者中检测到SLC1A2的双等位基因突变（14），其中尿草酸盐正常至轻度升高。在我们的患者中，无法对分离的肾结石进行分析，但尿液中草酸盐的重复测量未显示可重复的高草酸尿症。在这种情况下，硫酸盐排泄分数的增加也可能是肾结石形成的驱动因素（27）。不幸的是，在Gee等人描述的2例肾结石和SLC26A1突变患者中，未测量血浆和尿硫酸盐水平。最近的一项研究Slc26a1–/–小鼠证实低硫酸血症和肾硫酸盐消耗，但未能证明高草酸尿症和高草酸血症（13）。因此，SLC26A1的作用可能主要与硫酸盐稳态有关，而其在草酸盐稳态中的作用需要进一步研究。我们的研究结果得到了动力学研究的支持，这些研究得出结论，SLC26A1在生理条件下不会介导草酸盐的大量流入（28）。

在GCKD研究中，与非携带者相比，具有潜在破坏性SLC26A1变异的杂合携带者自我报告的肾结石患病率并不高（P > 0.1）。这一结果与Gee及其同事（14）的数据并不矛盾，因为GCKD队列中的所有变异携带者都是杂合子，而Gee等人报告的个体是双等位基因，我们的SLC26A1突变患者也是如此。因此，所提供的数据使SLC26A1仍然是肾结石的潜在危险因素。然而，潜在的病理生理机制，包括尿草酸盐和硫酸盐对结石形成的相对贡献，可能值得重新评估。

我们研究的优势包括支持SLC26A1作为生理上重要的人类硫酸盐转运蛋白的作用，这些作用来自2个独立的，互补的遗传证据系;虽然单个患者中无法解释的肌肉骨骼症状使我们鉴定出通过功能研究证实的基因中的纯合功能丧失突变，但SLC26A1在硫酸盐稳态中的生理作用得到了SLC26A1中罕见的杂合编码变异的总体效应的支持，这些变异在人群中共同丰富。后一项发现得到了我们的功能分析的大力支持，该分析揭示了其中几种变体的硫酸盐转运的显着损害。p.Thr185Met突变的主要负面影响证明了即使是破坏性变异的杂合载体也可能出现明显减少的硫酸盐转运，进而导致血浆硫酸盐浓度降低。

我们想强调的是，所提供的数据不符合 ClinGen 基因表型归因的标准。目前，没有足够的证据来定义孟德尔疾病。SLC26A1的双等位基因有害变异与潜在临床特征（尿石症和/或软骨或骨骼疾病）之间的相关性值得进一步澄清。然而，我们的工作为未来的研究铺平了道路，以确定与一般人群相比，这项工作中鉴定的各种SLC26A1变异的频率在软骨和骨病个体中是否更常见。

我们的研究结果表明，如果基因对表型的影响可以通过基于人群的研究的正交证据进行匹配，而不是需要识别第二个病例或家族，那么可能新的遗传发现的重要性可能来自单个病例。随着分子全基因组筛选（包括二代测序）的执行频率越来越高（15），这种方法可能是未来临床实践的有用工具。

总之，本研究表明SLC26A1是人类硫酸盐稳态的主要决定因素。鉴于最近有证据表明硫酸盐稳态与背痛和椎间盘疾病有关（7），我们的研究将SLC26A1确定为调节肌肉骨骼健康的潜在靶标。

方法

遗传信息

患者测试。 

在患者

及其家人的书面知情同意后，我们也在发表时，根据德国基因诊断法（GenDG）的要求，使用Sanger测序进行了全外显子组测序和三重分析（指示患者和父母）。

人口研究。

如前所述，GCKD研究从5年到217年招募了2010，2012名受试者（22）。简而言之，如果参与者的eGFR为30-60 mL/min/1.73 m，则符合条件2筛查时，或在存在较高 eGFR 的情况下有相关蛋白尿（尿白蛋白与肌酐比值 >300 mg/g 或蛋白尿当量）。该研究已在国家临床研究注册中心（DRKS 00003971）注册，并得到相关伦理委员会的批准。

基因检测

病人

全外显子组测序和三重分析（指示患者和父母）

使用PerkinElmer的Chemagic Star DNA血液400试剂盒从外周血中提取基因组DNA。对患者及其父母进行了全外显子组测序（SYNLAB MVZ Humane Genetik Munich）。使用人类核心外显子组试剂盒（TWIST Bioscience）在NextSeq 150平台（Illumina）上进行配对末端500 bp全外显子组测序。NGS原始数据处理，基因组学数据管理和变异解释，包括单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV））使用varvis基因组学平台（Limbus Medical Technologies）进行。通过三重分析生成NGS数据是假设常染色体隐性遗传模式和潜在的致病性新生变化。仅考虑在分析时具有小于0.1%的次要等位基因频率的变异，并且此外还具有与患者临床表型有因果关系的可能性。根据美国医学遗传学学会指南（29）对已鉴定的SNV和CNV的致病性进行评估。公共数据库（Decipher，ClinVar，ClinGen，LOVD）和不同的计算机预测程序（SIFT，PolyPhen2，Align GVGD，Mutation Taster，SpliceSiteFinder-like，MaxEntScan，NNSPLICE，GeneSplicer）用于解释已识别的变异。在患者中鉴定出的SLC26A1变体已存放在ClinVar中，提交ID为SUB12301997。可根据个人要求提供二代测序数据。

桑格测序（指示患者的兄弟）

在标准条件下，用热启动DNA聚合酶（赛默飞世尔科技）和引物SLC26A1-26：CTGACCTCGCAGCTCAAAC（正向引物）和SLC1A001-26：CACCACGATGACCAGCAAC（反向引物）对鉴定的致病变异定位的SLC1A002序列区进行PCR扩增。随后，进行桑格测序（SLC26A1参考序列NM_022042.4).在应用生物系统1xl DNA分析仪上使用大染料终止子化学v1.3730（应用生物系统）进行序列反应。使用序列导频算法v5.1.0（JSI医疗系统）分析序列。

研究人群（GCKD研究）

在入组访问时收集的血液样本中的基因组DNA在Human Longevity Inc.进行了配对末端100 bp全外显子组测序，使用Illumina NovaSeq 6000平台和IDT xGen v1捕获试剂盒。平均而言，超过97%的共识编码序列（CCDS）（30）版本22的覆盖率至少为10×，CCDS的平均覆盖率达到了141倍的读取深度。

外显子组序列在阿斯利康的未对齐FASTQ状态中在运行Illumina DRAGEN Bio-IT平台的定制云计算平台中进行处理，并采用种系管道v3.0.7将读段与GRCh38参考基因组对齐并进行变异调用（23）。

使用变异效应预测器（VEP）v101（31）对变异进行注释。使用标准设置，我们注释了规范转录本、基因符号，并包括了基因组聚合数据库（gnomAD v2.1;https://gnomad.broadinstitute.org/）。我们使用 VEP 插件添加了狂欢分数 （v2020-5） （32） 和 CADD 分数 （v3.0） （33）。功能缺失变体使用 LoFtee VEP 插件 （v2020-8） 降级 （34）。使用来自dbNSFP（v4.1a）（35）的信息添加了计算机分数的多个。

在样品级质量控制期间，估计的VerifyBamID自由混合（36）污染水平大于4%的样品，非欧洲血统的样品，重复的样品以及报告和遗传预测性别不匹配的样品被排除在外。

当GCKD研究于2009年启动时，招募仅限于欧洲血统的个体（22）。当时的理由是，在招募实践中，非欧洲血统的个体比例相当低，研究人员担心GFR估计中的潜在偏差，因为采用的估计方程包含一个种族术语。使用全基因组遗传数据，我们计算了遗传血统并排除了少数个体，因为它们在主成分分析的前10个主成分中的任何一个上都显示出离群值，以最大限度地提高样本同质性，如前所述（37）。此外，我们仅保留具有可用高质量DNA微阵列基因型数据的样本，从而产生了4，868个具有可用全外显子组测序数据的样本。

实验室参数

实验室参数的测量按照标准程序进行，但以下所列例外情况除外。

血浆草酸盐浓度的测量

如前所述（Trinity Biotech）（38），使用草酸盐氧化酶测定法酶促测量血浆草酸盐浓度。

血浆和尿硫酸盐浓度的测量

病人。

将静脉血液样品收集到Vacuette肝素化血浆管（Greiner Bio-One GmbH）中，立即放在湿冰上，并以10，1g离心800分钟。将上清液等分并储存在–80°C。为了测量尿硫酸盐，在收集血液的同时收集5mL尿液，放在湿冰上，然后储存在–80°C。解冻后，使用在负电离模式下运行的AB Sciex 4000 Q-TRAP或5000 LC-MS/MS系统测量血浆和尿液中的游离硫酸盐水平。通过流动进样分析引入样品，并监测通道m/z 97→80和m/z 99→82的硫酸盐（SO4） 和34所以4（作为内标，质量偏移分别为+2）。尿液样品是通过用蒸馏水将原始尿液初始稀释100倍来制备的。将2微升稀释的尿液与<>nmol混合34所以4，所得混合物通过10 kDa过滤器（Amicon）离心纯化。从最终滤液中，通过流动进样分析将10 μL引入质谱仪。通过将 20 μL 血浆与 2 nmol混合制备血浆样品34所以4和 180 μL 纯化水，然后使用 10 kDa 过滤器 （Amicon） 离心进行脱蛋白步骤。从最终滤液中，通过流动注射分析将 1 μL 引入质谱仪（用氨调节 pH 10.8 的 75 mM 甲酸）。使用已知硫酸盐量的水性校准品进行定量。然后使用获得的痕量硫酸盐与痕量内标相关的峰面积比来估计所检查体液中的游离硫酸盐水平。

人口。 

在GCKD研究入组访问中收集的血浆中测量硫酸盐，作为之前详细描述的代谢物的非靶向基于MS的代谢组学面板（代谢物HD4）的一部分（39）。硫酸盐水平作为LC / MS Neg平台的一部分进行定量，测定内变异系数为6.9%，可用于5，144名参与者。

非洲爪蟾卵母细胞中草酸盐和硫酸盐转运的测量

分子生物学

人体 SLC26A1 (NM_022042）亚克隆到非洲爪蟾卵母细胞表达载体pXT7（pXT7-SLC26A1）中，由Seth Alper（美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供。QuikChange II （Agilent） 定点诱变试剂盒使用特异性诱变寡核苷酸引入各种点突变（对于 Leu275Pro，正向 5′-GGCGGTGCTGCCAGCCGCGAAGG-3′ 和反向 5′-CCTTCGCGGCTGGCAGCACCGCC-3′;对于 Thr185Met，正向 5′-CGCCACCCCTCATGCTGATGATGACC-3′ 和反向 5′-GTCATCAGCATGAGGGCGGTGGCG-3;对于 Pro237Leu，正向 5′-CGTGCGGATCCTGCGGCACCAGG-3′ 和反向 5′-CCTGGTGCCGCAGGATCCGCACG-3′;对于 Leu348Pro，正向 5′-TGCCGTGGCCCCCCCCCCCTCGTGG-3′反向 5′-CCACGAGGGCCGGGGCCACGGCA-3′;对于Ser358Leu，正向5′-TGCCGCCTTCTCCATCTTGCTGGCGGA-3′和反向5′-TCCGCCAGCAAGATGGAGAAGGCGGCA-3′。通过PCR诱变将HA表位插入到Pro之后的第二个细胞外环中155WT SLC26A1和Leu275Pro突变体。通过对完整的开放式阅读框进行测序来确认所有构建体。

非洲爪蟾卵母细胞中cRNA的表达

在质粒与XbaI线性化后，根据制造商的说明，将卵母细胞注射用mMessage Machine T10试剂盒（赛默飞世尔科技）转录的cRNA（7ng）。注射10ngcRNA或水（作为对照）的卵母细胞在使用前在含有青霉素/链霉素（17μg/ mL）的ND5缓冲液中维持在96.100°C2天。

同位素流入

将卵母细胞在室温下在ND15浴液（mM）中孵育96分钟：96 NaCl，2 KCl，1.8 CaCl2， 1 氯化镁2和 5 个 HEPES，pH 7.40，含 1 mM （13 μCi/mL）35所以42−（生物趋势）或 1 毫米（2.5 微基/毫升）14C-草酸盐（ViTrax）。为14C-草酸盐内流实验，ND96浴液标称为Caa2+和镁2+自由。在冰冷的ND4中洗涤96次终止流入实验，然后在150μL2%十二烷基硫酸钠（SDS）中裂解卵母细胞。对照实验表明，在15分钟时，摄取仍处于近线性范围内。使用重复的10 μL等分试样的流入溶液（在150 μL 2% SDS中）计算放射性标记底物的特定活性。根据每分钟卵母细胞相关计数（cpm）和浴池特异性活性计算单个卵母细胞摄取量。所有样品均在三碳水化合物 2 TR β闪烁计数器 （PerkinElmer） 中使用 300 mL 闪烁混合物 Aquasafe 2810 plus（Zinsser Analytics）进行闪烁计数分析。

蛋白质印迹

将卵母细胞在含有（mM）的缓冲液中匀浆：20 Tris-HCl pH 7.4，140 NaCl，2 EDTA和蛋白酶抑制剂（4 mM Pefabloc，完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物，罗氏）。均质以10，1g离心000分钟两次，膜级分从澄清的匀浆中沉淀，以30，100g超速离心000分钟。将膜沉淀在50 mM Tris-HCl，pH 6.8，140 mM NaCl，0.5 mM EDTA，1%SDS （w / v）和1%Triton X-100（w / v）中与蛋白酶抑制剂超声重悬。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质（30μg）并印迹到硝酸纤维素膜上。用单克隆兔抗HA标签抗体（细胞信号技术，目录3724）或兔抗SLC26A1（Novusbio，目录NBP1-5908）探测蛋白质印迹。ImageJ（NIH）用于蛋白质印迹的定量。蛋白质水平标准化为肌动蛋白（兔多克隆;Sigma-Aldrich，目录A3066）在同一印迹上。

免疫荧光

注射编码WT的cRNA（10ng）或突变HA标记的SLC26A1两天后，将卵母细胞用1%多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定在10°C下4分钟，并用冷PBS洗涤3次。将卵母细胞在含有1%牛血清白蛋白（PBS-BSA）的PBS中在室温下封闭1小时，随后在PBS-BSA中与抗HA标签抗体（细胞信号技术，目录1）在室温下孵育3724小时，之后用冷PBS洗涤卵母细胞3次。然后将抗体标记的卵母细胞在室温下与Alexa Fluor 1（分子探针）偶联的二抗孵育555小时，用冷PBS洗涤3次，并在4°C下储存直至成像。使用ZEN软件用蔡司LSM880显微镜拍摄共聚焦图像。为了定量免疫荧光显微镜图像，使用ImageJ。

统计学

为了研究GCKD研究中SLC26A1中罕见的外显子遗传变异对血浆硫酸盐水平的综合影响，我们使用来自4，708名GCKD研究参与者的数据和所有可用数据进行了汇总变异测试。SLC26A1中汇总的合格变体是使用VEP v101（31）中的注释选择的。所有次要等位基因频率小于0.5%的变异，被预测为高置信度功能丧失变异或MetaSVM评分（40）大于0的错义变异或fathmm-XF编码评分（41）大于0.5的帧内非同义变异，均被纳入基于基因的测试（N = 43）。聚合变体测试是使用在SeqMeta R软件包版本1.6.7（42）中实现的负担测试进行的。血浆中硫酸盐水平基于秩，分析前呈逆正态转化，并根据年龄、性别、ln（eGFR）、血清白蛋白和前3种遗传主成分进行调整。负担测试的统计学显著性阈值设置为P值小于0.05，对应于1个候选基因的测试。

关于非洲爪蟾卵母细胞的实验，统计分析总是在图例中表示（1 因素方差分析与 Bonferroni 多重比较检验或 2 尾，不配对 t 检验，如适用）。P值小于0.05被认为是显著的。