8+！骨肉瘤异常信号通路与肿瘤异质性相关研究

导语

骨肉瘤 (OS) 是青少年中最常见和最具侵袭性的原发性恶性肉瘤，化疗几十年来一直没有取得实质性进展。迫切需要对 OS 开发和治疗策略的新见解。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者探索了 OS 的异质性和潜在机制，并得出了有助于 OS 评估和选择最佳疗法的发现。文章发表在《Journal of Translational Medicine》上，影响因子为：8.44，文章题目为：Abnormal signal pathways and tumor heterogeneity in osteosarcoma。

数据介绍

本研究从GEO数据库获得了公共scRNA-seq数据，分别为GSE143753、GSE196678和GSE162454数据集，从GSE19743中下载了53份OS患者的表达谱和临床结果，从GSE84500的基因集数据获得显著差异表达基因。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析 

01   骨肉瘤起源于发育过程中的成骨不全症  

本研究整合了来自 8 周大的长骨 (GSE143753)、人类正常骨组织 (GSE196678) 和 OS (GSE162454) 的数据，以确定发育障碍是否与 OS 相关。经过质量控制和批次校正后，共获得了 60,553 个细胞用于下游分析。降维后，基于 UMAP 的细胞聚类鉴定了髓系、淋巴系、内皮细胞、生肌细胞和骨相关细胞群（图 1A）。基于谱系标记（图 1B），然后根据它们的组织来源将它们分开。结果本研究发现骨髓间充质干细胞 (BMC)、正常骨细胞和 OS 癌细胞映射在一起，表明癌细胞可能源自发育障碍的 BMSC（图 1C）。

图 1

接下来本研究比较了转录谱以识别发育过程中正常骨细胞和 OS 癌细胞之间的 DEG 。结果共确定了 349 个 DEG，其中 143 个在 OS 癌细胞中升高（图 1D）。本研究使用 MGI Mammalian Phenotype 和 Jensen DISEASES 数据库分析了上调的 DEG，以深入了解它们的功能相关性，结果发现在致密骨厚度减少、骨小梁体积减少、长骨长度减少和成骨不全症富集（图 1E 和 1F）。本研究分析了骨相关细胞的起源和发育轨迹（图 2A 和 2B），结果显示部分 BMSCs 处于发育轨迹的开始，这表明BMSCs可以发育成OS。

02   干扰素诱导的跨膜蛋白5(IFITM5)是OS发展中潜在的新驱动基因  

在功能本体论中，只有IFITM5在骨肉瘤发生过程中起着至关重要的作用，包括成骨缺陷、骨厚度、体积和长度减少(图2C)。此外，在正常骨细胞和骨肉瘤细胞之间的DEGs中，IFITM5和Metallothionein 2A (MT2A)分别是上调和下调最显著的基因(图2D)。轨迹分析也可以更清晰地了解单一路径上的基因动态，本研究发现IFITM5从骨髓间充质干细胞到OS显著增加，而MT2A则没有(图2D)。伪时间依赖的IFITM5基因随着细胞沿癌细胞轨迹的进展而改变。因此，了解IFITM5变化的顺序可以导致生成新的OS开发模型(图2E和2F)。

图 2

接下来本研究使用Simple ClinVar确认了IFITM5变体。共总结了IFITM5的多种突变类型，发现错义突变是最常见的类型(图2G)，根据Simple ClinVar数据集和现有文献，ITITM5的三种变异，包括点突变(c.-14C > T)、错义c.1C > T (p.S40L)和c.1A > G (p.N48S)可导致致病状态(图2H)。这些发现共同表明IFITM是OS发展中潜在的新驱动基因，值得进一步研究。

03 骨肉瘤的发生与发育过程中的异常信号通路的复杂调控有关  

本研究通过分析12个间充质干细胞、3个成骨细胞和84个骨肉瘤样本(GSE33383)的表达谱进一步研究了骨肉瘤的发展。利用WGCNA构建相关网络，识别共表达模块。使用Dynamic Tree Cut算法获得9个共表达模块，共4637个基因(图3A)。聚类树基于模块特征基因主要呈现两个分支(图3B)。模块与MSCs、成骨细胞、OS样本之间的相关性如图3C所示，热图显示MEgreen、MEblue模块与MSCs、成骨细胞呈负相关，与OS呈正相关，MEgery模块与间充质干细胞和成骨细胞呈正相关，但与OS呈负相关。

图 3

接下来本研究使用MEgreen、MEblue和MEgery模块中的共表达基因分析了BioPlanet通路，以深入了解信号通路的相关性。每个模块中三个最重要的通路，即细胞周期，抗原处理和呈递，以及TGFβ对细胞外基质的调节(图3D-F)。与OS相比，MSCs的模块相关系数与成骨细胞的模块相关系数一致(图3G和3H)。也就是说，OS归因于细胞周期和抗原加工和递呈通路的构成性激活，以及TGFβ对细胞外基质信号调控的缺陷，非典型信号通路在调节骨发育方面也有复杂的联系(图3I)。

04   OS中癌细胞的转录组学异质性  

本研究通过重新聚类 OS 中的骨相关细胞分析了 OS 癌细胞的转录组异质性，并发现了六个不同的转录组亚群（图 4A）。使用 inferCNV（以生肌细胞作为参考）估计拷贝数变异 (CNV)，以区分癌细胞和正常细胞（图 4B）。与参考细胞相比，来自 scRNA-seq 的 CNV 揭示了所有子簇中的许多改变（图 4C）。本研究确定了六个亚群中前 100 个差异表达的转录本，并在 Enrichr 数据集中定义了它们的细胞类型，热图显示了每个子簇中的中心基因（图 4D）。六个亚群被 UMAP 注释和可视化为神经元样、免疫原性、成纤维细胞、软骨母细胞、脂肪细胞样和成骨细胞癌细胞（图 4A）。使用 GSVA 评估每个亚群的前 100 个基因特征，并根据 53 个人类转录组学概况 (GSE21257) 估计癌细胞亚型丰度。 Kaplan-Meier 估计较高的免疫原性和脂肪细胞样评分与较长的无进展生存期相关，与预后不良相关，其他亚型没有显著的预后价值（图 4E）。

图 4

05   TGFβ信号通路的缺失导致发育过程中出现脂肪样OS亚型  

脂肪细胞样OS亚型与不良预后相关。本研究分析了人骨髓间质干细胞(hMSCs)中存在成脂/成骨因子(GSE84500)的基因表达，以评估脂肪细胞样OS亚型的发展。主成分分析(PCA)最初揭示了相关性(图5A)。本研究确定了469个上调转录本，其中240个在hMSC_BMP2 + IBMX组中升高，并在PanglaoDB扩增数据集中命名为Adipocytes, 229个在hMSC_BMP2 + IBMX + TGFβ组中大量表达并在同一数据集中被标记为软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞(图5B)。同时，BioPlanet通路证实在hMSC_BMP2 + IBMX + TGFβ组中激活了TGFβ对细胞外基质的调节。因此，本研究判断BMP2和IBMX导致hMSCs向脂肪细胞分化，TGFβ抑制这一过程并引导这些细胞向软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞分化。在OS发育过程中，TGFβ信号存在缺陷(图5C和5F)，没有TGFβ信号，脂肪细胞无法分化为正常的骨细胞。这阻碍了脂肪细胞的发育，导致了OS的脂肪细胞样亚型(图5D)。在临床翻译中，转移患者更有可能有高风险评分(图5E)。本研究应用Huvos评分系统来判断新辅助化疗对OS的有效性;在临床数据中，得分越高，坏死区域越大(GSE21257)。然而，脂肪细胞样亚型的风险评分在不同级别之间没有差异，表明脂肪细胞样亚型对新辅助化疗具有耐药性(图5F)。

图 5

06   依托泊苷通过影响OS亚型和纠正异常通路发挥有效的缓解作用  

与低风险评分相比，OS和高风险评分的免疫原亚型患者存活时间更长(图4E)，转移发生的可能性较小(图6A)。此外，Huvos系统将免疫原亚型与更高级别和对新辅助化疗的敏感性相关联(图6B)。本研究将免疫原亚型基因签名应用于DrugMatrix数据集，该数据集包含各种药物治疗下大鼠基因表达的全面信息。由硫鸟嘌呤和依托泊苷引起的转录变化被富集（图 6C）。

通过GSEA (GSE200845)对暴露于7种浓度依托泊苷的OS细胞(U-2 OS)的高通量转录组学筛选，以确定依托泊苷的潜在机制。GSEA富集图将DEGs与免疫原亚型标记的激活相关联(图 6D左)。热图还显示，免疫原亚型特征的前10个基因随着剂量的增加逐渐增加(图6D右)。同时，富集图和热图显示，脂肪细胞样亚型特征与依托泊苷治疗的剂量依赖曲线呈负相关(图 6E)。

图 6

本研究还使用GSVA来确定免疫原性亚型和脂肪样亚型特征之间的剂量依赖趋势，结果与GSEA分析结果相同(图 6F)。本研究鉴定出CHEK2和RB1，分别占OS驱动基因的46.15%和15.39%，在细胞周期通路中起着至关重要的作用，(图6G;3D)。在OS中，TP53的突变率也为15.39%(图6G)。依托泊苷可以抑制细胞周期通路，激活P53信号通路(图6H和6I)。免疫原性OS亚型起源于间充质干细胞，因为它与图3E中描述的抗原加工和提呈密切相关(图6J)。因此，依托泊苷通过促进免疫原性亚型、抑制脂肪细胞样亚型以及纠正异常细胞周期和 p53 信号通路，有望成为一种姑息治疗药物。

小编总结

本研究将 OS 的发生归因于 IFITM5 突变体、TGFβ 信号缺陷、细胞周期信号通路的持续激活以及发育过程中的 P53 信号抑制。在六种 OS 亚型中，免疫原性亚型对健康有益，而脂肪细胞样亚型对健康有害。依托泊苷可能是一种有用的缓和剂，因为它改变了 OS 亚型，抑制了细胞周期通路，并改善了 p53 信号通路。本研究缺陷在于仅限于生物信息学分析，要成功进行体外和体内研究，仍需要克服大量挑战。将来应考虑包括单细胞测序和临床结果在内的大规模样本。

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