染色质修饰突变在膀胱癌表观遗传调控中的意义

染色质失调是癌症发病机制中的一个新兴主题，而膀胱癌在许多其他癌症类型中脱颖而出，它们的表观遗传调控基因经常发生突变。染色质水平调控的缺陷可以在多个层面表现出来，例如 DNA 甲基化、组蛋白甲基化模式和非编码 RNA 的变化。膀胱癌染色质修饰基因突变，如KDM6A、KMT2D、KMT2C、ARID1A、EP300, 已经在膀胱细胞系模型中进行了研究。此外，还有一些研究描绘了膀胱癌的主动调控格局和组蛋白修饰谱。总的来说，现有文献强调了透彻了解膀胱癌表观遗传失调的重要性。可以通过表观遗传药物或其他基因组编辑工具靶向膀胱癌的表观遗传特征，最终为这种癌症带来特定的治疗选择。本章概述了膀胱癌的表观遗传修饰，以及表观药物治疗膀胱癌的潜力。

介绍

癌症是一种具有许多特征的复杂疾病 ( 1 )。在过去十年中，人们付出了巨大的努力来表征基因组景观并识别不同癌症类型的分子亚群 ( 2 – 4 )。所有这些分子研究都清楚地表明，表观遗传失调是与肿瘤发生有关的一个共同主题。很明显，适当的表观遗传调节对于正常细胞稳态至关重要，任何偏离这种严格调节的平衡都会破坏细胞状态，并可能导致肿瘤形成 ( 5 , 6 )。在所有其他癌症中，膀胱癌具有异常高的染色质修饰突变率（7)，因此被认为是一种表观遗传放松管制机制发挥根本作用的疾病。膀胱癌主要起源于尿路上皮，每年导致超过 200,000 人死亡 ( 8 )。它的主要分类是基于组织病理学作为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）。最近的研究对 MIBC 和 NMIBC 的突变情况进行了表征，并进一步确定了共有的分子亚群，从而提供了关于膀胱癌发病机制的基本见解 ( 9 – 12). 然而，仍需要进一步的研究来详细表征膀胱癌的表观遗传失调，并将这些信息用于膀胱癌的特异性诊断和治疗。本章主要关注膀胱癌中经常发生突变的染色质修饰物、被破坏的主要调节机制以及表观遗传疗法在膀胱癌中的潜在用途。

表观遗传调控与癌症

为了理解和解释癌症的起源和特征，多年来提出了几种理论。Hanahan 和 Weinberg 提出的“癌症标志”将这些原则概念化并组织在一个逻辑框架中 ( 1 )。所有标志和特征都定义了正常细胞以从正常状态逐渐转变为肿瘤状态的方式获得的功能特性 ( 6 , 13). 特征的获得取决于基因组的改变、表观遗传重编程和微环境重塑。除了遗传改变外，表观遗传修饰也会导致癌症中的基因表达失调。表观遗传机制的异常，如 DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA（miRNA、lncRNA）的失调，在肿瘤发生中起着重要作用，导致癌症的不同特征 (14 ,15 )。这些表观遗传失调可能导致基因表达的不适当激活或抑制。

DNA 甲基化发生在 CpG 二核苷酸的胞嘧啶残基处。虽然 CpG 二核苷酸遍布整个基因组，但 CpG 岛 (CGI) 位于 5' 调控区域，例如基因的启动子。启动子 DNA 甲基化与转录抑制有关 ( 16 , 17 )。在人类细胞中，3 种不同的 DNA 甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A 和 DMT3B）催化甲基转移到胞嘧啶残基 ( 18 )。维持 DNA 甲基化的异常对肿瘤发生至关重要。全局低甲基化和启动子高甲基化是癌症表观基因组的特征，分别导致原癌基因的过度表达和抑癌基因的沉默 ( 19 ,20 ). 致癌信号通路还指导全局甲基转移酶的活性，这有助于从正常甲基化模式转变为癌症特异性甲基化模式 ( 15 )。DNA 甲基化的改变被认为是膀胱癌发展的早期事件，并被认为是癌症的标志 ( 21 )。

在真核细胞核中，DNA 包裹在组蛋白八聚体周围形成核小体结构。核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4）的 N 末端尾部主要针对翻译后修饰 (PTM)，例如甲基化、乙酰化和磷酸化 (16 )。组蛋白尾部的修饰会影响对基因调控至关重要的染色质结构 ( 22 )。染色质结构是高度动态的，由染色质重塑复合物和组蛋白修饰酶协调。由组蛋白修饰酶和染色质重塑复合物活性缺陷引起的组蛋白修饰异常可能有助于肿瘤转化（23). 在许多癌症类型中经常检测到组蛋白基因或染色质修饰蛋白的突变，导致基因表达程序和基因组完整性受损 ( 24 )（图 1）。

图1

癌症表观遗传失调的景观。在肿瘤发生过程中，启动子区域的 DNA 甲基化被诱导，而全基因组 DNA 甲基化被下调。癌细胞表现出破坏的组蛋白尾部修饰和染色质（更多...）

染色质修饰剂在膀胱癌中经常发生突变

为了推进我们对癌症分子景观的理解，大规模全基因组研究，特别是 TCGA 项目，收集了基因表达、转录剪接变异、蛋白质表达、DNA 拷贝数改变、体细胞突变、DNA 甲基化和基因融合的数据，以及来自许多癌症类型的临床病理学数据，包括膀胱癌 ( 11 , 25 )。综合组学研究表明，与其他癌症类型相比，膀胱癌每兆碱基有五个或更多突变（10、11、25、26）). 膀胱癌中最常见的突变发生在组蛋白修饰和染色质重塑基因中起作用的基因中。这些包括ARID1A (25%)、KDM6A (24%)、KMT2D (27%)、EP300 (15%) ( 27 )。在全球范围内，几乎 80% 的膀胱癌患者在参与表观遗传调控的基因中发生突变，表明这种癌症存在高度的表观遗传失调（28). 同样重要的是要注意，膀胱癌中发生突变的染色质修饰物主要在活性染色质组织和基因表达激活中发挥作用。在这种情况下，可以推测膀胱癌中的染色质修饰突变导致染色质结构闭合，可能会抑制尿路上皮分化所需基因的表达，同时导致支持增殖和肿瘤发生的基因表达程序（图 2 ）。

图 2

染色质修饰突变有助于膀胱细胞的肿瘤转化。染色质修饰基因的突变指导染色质组织从活跃状态转变为抑制状态。DNMT，DNA甲基转移酶；HAT，组蛋白乙酰转移酶；（更多的...）

膀胱癌的表观遗传学概况

如前所述，表观遗传学异常是癌症的标志之一，DNA 甲基化异常、染色质修饰基因突变以及染色质修饰基因和非编码 RNA 的基因表达改变导致细胞特征发生变化并导致不良预后。膀胱癌表观遗传景观与基因表达之间的关联已在多项研究中得到解决（10 , 11 , 29). 一项研究定义了来自 TCGA（包括膀胱癌）的 23 种癌症类型的全基因组染色质可及性概况和癌症特异性 DNA 调控元件，并确定了基因表达和染色质可及性之间的显着相关性，整合了转录组学数据和 ATAC-seq（用于检测使用测序转座酶可及的染色质）。此外，这项研究证明了基于 ATAC-seq 的聚类与先前建立的基于 mRNA、miRNA、DNA 甲基化或拷贝数变异 (CNV) 配置文件的分类之间令人印象深刻的相似性。在这项研究中，还揭示了在膀胱癌的一个调节区域中观察到的体细胞突变增加了染色质可及性并改变了突变型膀胱癌中的基因表达 ( 29 )。

为了进一步扩展对膀胱癌表观基因组景观的了解，van der Vos 等人。( 10 ) 对 MIBC ( 10 )的全基因组组蛋白甲基化分析进行了研究。对 H3K27me3、抑制性组蛋白标记以及 H3K4me1 和 H3K4me3（基因激活组蛋白标记）ChIP-seq 和 RNA-seq 数据的综合分析表明，不同的增强子区域在 MIBC 的管腔和基础亚型的表征中起着关键作用。

非编码 RNA，例如微小 RNA (miRNA)、长链非编码 RNA (lncRNA)、环状 RNA (circRNA)、piwi 相互作用 RNA (piRNA)、小核 RNA (snRNA) 和小核仁 RNA (snoRNA)，不会转化为蛋白质，但它们在每个细胞过程中仍然具有重要功能。NcRNA 还有助于促进膀胱癌发展和进展的表观遗传改变 ( 30 )。

DNA 高甲基化的预后生物标志物潜力已在膀胱癌中得到广泛研究 ( 31 , 32 )。然而，需要进一步研究以获得更敏感和特异性的生物标志物。已经确定富含 CpG 的转座子，例如 LINE1，在膀胱癌类型中甲基化不足。这会导致逆转录转座，从而导致基因组不稳定 ( 33 )。最近的一项研究调查了膀胱癌患者的整体组蛋白乙酰化水平及其预后价值，并报告与正常尿路上皮对照组相比，NMIBC 和 MIBC 患者的 H3 乙酰化水平均降低 (34 )。

组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 根据其与酵母 HDAC 的相似性分为不同的类别 ( 35 )。另一项研究报告说，尿路上皮癌中 HDAC-1、HDAC-2 和 HDAC-3 的表达水平升高。值得注意的是，HDAC-1 和 HDAC-2 水平升高与高级别肿瘤相关。此外，与低级别肿瘤相比，具有高 HDAC-1 表达的高级别肿瘤与更差的预后相关（36). 这一发现支持 HDAC 的治疗靶点潜力。另一项研究确定了 Hi-C 的染色质相互作用，将其与管腔型和基底型膀胱癌中的转录组和增强子谱相结合。尽管该研究以亚型特异性方式暗示了表观基因组景观和 3D 基因组结构之间的关联，但仍需要进一步研究以全面揭示分子基础和相关因素 (37 )。

膀胱癌染色质修饰突变的功能性结果

鉴于膀胱癌中染色质修饰基因突变率很高，已有许多研究调查了突变在不同模型系统中的功能影响（表 1）（38 – 46）。Polycomb 抑制复合物 2 (PRC2) 依赖性表观遗传调控对于膀胱尿路上皮的细胞分化和增殖至关重要 ( 47 )。SWI/SNF 复合物充当 PRC2 复合物的拮抗剂，促进被 PRC2 沉默的基因的表达 ( 48 )。ARID1A 属于 SWI/SNF 复合蛋白 ( 49 )，在原发性人膀胱癌中经常发生突变 ( 25)). ARID1A 在调节细胞周期进程和维持基因组稳定性的肿瘤抑制机制中发挥作用 ( 38 )。

ARID1A 蛋白丢失主要见于高级别和高分期的膀胱肿瘤，表明与较差的预后相关 ( 39 , 50 )。ARID1A 的潜在功能已在 ARID1A 敲除小鼠的尿路上皮细胞中进行了研究。研究表明，ARID1A 中的功能缺失突变会上调尿路上皮细胞增殖，强调 ARID1A 在膀胱癌发展中的抑癌作用 ( 39 )。此外，研究结果表明膀胱中 ARID1A 和 PRC2 复合体之间存在拮抗关系 ( 51 )。然而，ARID1A 的功能可能依赖于上下文，因为不同的研究解决了 ARID1A 在不同细胞过程和癌症类型中的相反作用（52).

KDM6A (UTX)，赖氨酸组蛋白去甲基化酶，与染色质修饰酶发生物理相互作用，例如 KMT2C (MLL3) 和 KMT2D (MLL4) ( 53 )。KDM6A 蛋白包含四肽重复 (TPR) 结构域和 Jumonji C (JmjC) 结构域。JmjC 结构域催化从 H3K27me2 和 H3K27me3 中去除甲基 ( 53 , 54 )。TPR 域与 MLL3 和 MLL4 复合体的成分进行相互作用 ( 55 )。KDM6A 的功能一直是众多研究的主题。这些研究报告称，KDM6A 调节基因表达和细胞过程。作为 COMPASS 复合体的一个组成部分，KDM6A 参与基因激活的调节（56 – 58). 功能丧失和失活突变经常发生在几种肿瘤中，包括膀胱肿瘤 ( 59 – 62 )。KDM6A 表达减少和 KDM6A 突变与膀胱癌的不良预后相关 ( 40)。此外，KDM6A 在免疫反应中的潜在作用已通过 TIMER 和 CIBERSORT 算法得到证实。基因集富集分析表明，KDM6A 突变患者的免疫相关信号通路受到抑制。这些发现暗示了 KDM6A 突变与抗肿瘤免疫之间的关系 ( 40 )。在另一项研究中，Kobatake 等人。表明 KDM6A 的表达减少与促炎通路的激活有关 ( 41). 在两种不同的 KDM6A 敲除膀胱细胞系中观察到增殖增加 ( 42 )。值得注意的是，KDM6A 在保护膀胱癌细胞系中的管腔基因表达程序中发挥作用 ( 43 )。

专注于 KMT2C（MLL3，组蛋白赖氨酸甲基转移酶 2C）在正常细胞中的功能的研究确定了其在增强子活性调节中的作用，重点是 H3K4me1 标记的概况 (63 , 64 )。与其 H3K4me 活性无关，KMT2C 在转录调控中的作用已在最近的报道中得到证实 ( 65 , 66 )。已经报道了 KMT2C 对尿路上皮癌的肿瘤抑制作用。KMT2C 在 2 种不同的膀胱癌细胞系中的沉默已被证明直接或间接影响参与细胞周期控制、DNA 修复、DNA 复制和细胞凋亡的基因表达（44). 为了研究其进一步的影响，KMT2C 的全基因组结合谱已通过 ChIP-seq 绘制 ( 44 )。为了评估 KMT2C 对膀胱癌表观遗传景观的影响，Rampias 等人。( 44 ) 还研究了 KMT2C 沉默后 H3K4me3、H3K27ac 和 H3K9ac 组蛋白修饰的变化。KMT2C 的敲低影响膀胱癌细胞系中的增强子活性。与其在 H3K4me1 沉积中公认的作用平行，KMT2C 与活性增强子标记 H3K27ac 的共定位指出增强子活性增加 ( 44)。此外，KMT2C 缺失会影响对细胞粘附、细胞外组织和上皮分化至关重要的基因表达 ( 44 )。

KMT2D（也称为 MLL4）是一种组蛋白甲基转移酶，可能在膀胱癌的肿瘤发生和进展中发挥关键作用 ( 63)。KMT2D 调节 H3K4 甲基化的活性 ( 67 )。KMT2D 在膀胱癌中具有高突变率。低水平的 KMT2D 与淋巴结转移有关 ( 68 )。与正常膀胱细胞系相比，4 种膀胱癌细胞系（T24、J82、UM-UC-3 和 HTB-9）中的 KMT2D mRNA 和蛋白表达降低。KMT2D 的沉默诱导 T24 和 HTB-9 细胞系的侵袭，而其过表达会抑制。已经证明 KMT2D 调节膀胱细胞系中 H3K4me1 的水平 ( 68 )。有趣的是，虽然 Sun 等人 ( 68) 表明较高的 KMT2D 表达与较高的存活率之间存在关联，Ding 等人 ( 45 ) 暗示 KMT2D 突变与膀胱肿瘤的较好预后相关。基因集富集分析表明，KMT2D 突变也与细胞周期和 DNA 复制过程显着相关 ( 45 )。

CREB 结合蛋白（CREBBP 或 CBP）和 E1A 结合蛋白（EP300 或 P300）是转录共激活因子，它们还具有泛素连接酶活性和组蛋白乙酰转移酶活性 (69 )。CBP 和 EP300 在多种人类肿瘤中经常发生突变 ( 70 )。这些导致乙酰化失调和肿瘤转化的失活改变已经在肿瘤模型和膀胱癌系中进行了研究 ( 71 , 72 )。Duex 等人。定义这些突变主要富集在 EP300 和 CBP 的组蛋白乙酰转移酶结构域，暗示该结构域活性对肿瘤发生的潜在意义。他们还假设组蛋白乙酰转移酶活性的损伤更可能与侵袭性 MIBC 病例有关。还发现EP300中的突变促进了参与膀胱癌抗肿瘤反应的信号通路。

控制染色质修饰突变以治疗膀胱癌

需要新的诊断和治疗膀胱癌的策略和选择来增加药理学结果。将表观遗传学用于诊断标记和治疗靶点是一个快速发展且前景广阔的领域。表观遗传变化的可逆性作为膀胱癌的治疗靶点具有巨大潜力。表观药物的改进对于表观遗传失调起关键作用的癌症或疾病具有很大优势（图 3）（73）。

图 3

癌症治疗的表观遗传治疗选择。Epidrugs 可以单独使用或与其他治疗组合使用。表观基因组编辑技术也是癌症治疗的新兴替代方案。DNMTi，DNA甲基转移酶抑制剂；EZH2i，（更多...）

抑制 DNMT 酶，可以逆转基因沉默，进而恢复抑癌基因的表达。已揭示 5-Aza-2'-脱氧胞苷 (DAC)、DNMT 抑制剂可诱导细胞周期停滞，并增加膀胱肿瘤对化疗的敏感性 ( 74 )。5-aza-2'-deoxycytidine 和 5-azacytidine 被 FDA 批准用于治疗骨髓增生异常综合征和骨髓性白血病。目前正在进行用于膀胱癌治疗的临床试验 ( 75)。

几种 HDAC 抑制剂在泌尿系统癌症中显示出前景 ( 76 )。已经证明，在用 HDAC 抑制剂伏立诺他、罗米地辛和曲古抑菌素 A 处理膀胱癌细胞后，细胞生长和增殖受到抑制 ( 77 , 78 )。进一步的分析表明，蛋白质表达的变化主要与细胞凋亡、细胞周期调节和 DNA 损伤修复机制有关，以响应这些 HDAC 抑制剂的治疗 (78 )。HDAC 抑制剂 Romidepsin，已被 FDA 批准用于治疗皮肤 T 细胞淋巴瘤 (CTCL)，而 Belinostat 和 Panobinostat 被批准用于治疗 T 细胞淋巴瘤 ( 79)). 与其他化疗药物联合使用时，HDAC 抑制剂可协同影响恶性细胞的细胞周期停滞、凋亡和分化 ( 30 , 80 )。已经表明，DNMT 抑制剂和 HDAC 抑制剂的组合对癌细胞也具有协同作用 ( 76 )。

已在膀胱癌中检测到 G9a、H3K9 甲基转移酶的表达水平升高。在膀胱癌中抑制 G9a 可抑制膀胱癌细胞中诱导自噬性细胞死亡的增殖 ( 81 )。用 G9a 抑制剂小分子 UNC064 处理膀胱癌细胞系会降低细胞活力，同时诱导细胞凋亡 ( 82 )。

作为 PRC2 复合物的催化亚基，组蛋白甲基转移酶 EZH2 调节 H3K27 (H3K27me3) ( 83 )的三甲基化。该组蛋白标记对于抑制基因表达至关重要。越来越多的证据表明，EZH2 决定了不同类型肿瘤的发展和进展。EZH2 表达失调与细胞增殖、侵袭和转移增加有关 ( 84 )。值得注意的是，据报道，EZH2 也与化疗耐药性有关 ( 85)。EZH2 的上调表达在膀胱癌中起致癌作用。由于它影响基因表达并调节多种细胞机制，EZH2 具有作为治疗靶点的巨大潜力（86). 目前，EZH2 抑制剂 Tazemetostat 正在临床试验中用于治疗尿路上皮癌、淋巴瘤和其他实体瘤 ( 87 – 89 )。

表 2总结了目前正在进行临床试验的表观遗传修饰剂的治疗靶向。在一篇评论中，Ozgun 等人。( 28 ) 评估了 EZH2 抑制剂或 HDAC 抑制剂与类视黄醇在膀胱癌中的组合。他们指出了视黄酸及其衍生物的潜在治疗选择，并强调了调查类视黄醇与表观药物联合使用的临床试验 ( 28 )。

另一种类型的表观遗传疗法是基于 miRNA 操作。策略基本上集中于调节癌细胞中的 miRNA 表达和活性 ( 75, 90 )。这种操作是通过模拟特定的 miRNAs ( 91 ) 或施用表观药物，如 EZH 抑制剂 ( 92 , 93 ) 来管理的。

CRISPR/Cas9系统已成为广泛应用的基因组打靶技术。由于技术改进，可以使用 CRISPR 平台 ( 94 ) 实现靶向表观基因组编辑。dCas 与染色质修饰域的融合代表了染色质编辑的强大工具 ( 95 )。表观基因组编辑是通过 CRISPR 激活和抑制系统 (CRISPRa/CRISPRi) 在人类细胞中实现的。这些方法可用于体内和体外的表观遗传重编程、疾病建模、治疗靶向和细胞疗法 ( 94 )。最近的临床研究已经在人类造血祖细胞和干细胞中进行了基于 CRISPR 的表观基因组编辑，用于治疗免疫疾病 ( 96). 然而，需要更多的努力来建立常规的临床使用。

结论

染色质修饰基因的突变在膀胱癌中非常常见 ( 11). 已有大量研究强调，表观遗传失调对于理解膀胱癌发病机制、表型特征、疾病结果的确定以及指导治疗方案至关重要。膀胱癌表观遗传学的临床应用仍处于发展阶段。扩大我们对尿路上皮恶性肿瘤表观遗传学的有限知识将有助于改进诊断和开发更精确的靶向治疗。针对表观遗传机制的药物、用于诊断的表观遗传生物标志物以及定制癌细胞的表观基因组状态是个性化医学的新兴领域。然而，将表观药物和表观基因组编辑应用于临床仍需要克服许多挑战。

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