科研丨中南民大: 海藻酸钠寡糖通过调节肠道菌群对DSS诱导的小鼠结肠炎产生不同影响(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

海藻酸钠寡糖(AOS)按其单体序列可分为三种类型：MAOS、GAOS和HAOS。然而，这些AOS结构如何不同地调节健康和肠道菌群尚不清楚。本研究在体内结肠炎模型和体外产肠毒素大肠杆菌(ETEC)攻毒细胞模型中探索了AOS的结构-功能关系。结果发现，MAOS给药显著缓解了实验性结肠炎症状，并改善了肠道屏障功能。然而，HAOS和GAOS的效果不如MAOS。MAOS干预明显增加了肠道菌群的丰度和多样性，而HAOS和GAOS干预则没有增加。重要的是，通过FMT，MAOS给药小鼠的微生物群降低了结肠炎模型中的疾病指数水平，缓解了组织病理学变化，并改善了肠道屏障功能。MAOS(而非HAOS或GAOS)诱导的超级FMT供体似乎在结肠炎细菌治疗中发挥了潜力。这些结果可能有助于建立基于AOS靶向生产的精确药物应用。  

图文摘要    

论文ID

原名：Alginate oligosaccharide structures differentially affect DSS-induced colitis in mice by modulating gut microbiota

译名：海藻酸钠寡糖通过调节肠道菌群对DSS诱导的小鼠结肠炎产生不同影响

期刊：Carbohydrate Polymers

IF：10.723

发表时间：2023.3

通讯作者：郭小华

通讯作者单位：中南民族大学生命科学学院

DOI号：10.1016/j.carbpol.2023.120806

实验设计

根据图1所示的程序进行了两项动物实验，即AOS直接干预和AOS衍生的FMT试验。55只雄性C57BL/6小鼠(8周龄)随机分为五组：对照组(给予PBS溶液)、DSS组和HAOS、MAOS、GAOS处理组(饮用水中给予浓度为0.2 mg/mL的HAOS、MAOS或GAOS，持续3周)。DSS组和AOS组在饮用水中加入2% DSS (w/v)，连续7天诱导结肠炎。第29天，每组随机抽取6只小鼠，禁食12 h后，灌胃注射FITC-葡聚糖(50 mg/mL)。遵循4  h消化反应，每只动物取25 μL血清，荧光分析测定肠道通透性。每组各取8只存活小鼠，取结肠组织及血液作进一步分析。进行FMT试验：将24只雄性C57BL/6供体小鼠随机分为4组：对照组(给予PBS)、HAOS组、MAOS组和GAOS组(饮用水中给予HAOS、MAOS或GAOS(0.2 mg/mL) 3周)。在第22天，从供体小鼠(8 周龄)收集新鲜粪便，对每只小鼠的部分新鲜粪便进行16S rRNA微生物组分析。各供体组剩余粪便混合，制备粪便悬浮液，并在−80℃冷冻以用于进一步FMT。雄性C57BL/6受体小鼠随机分为5组：DSS组、DSS+FMT-CON、DSS+FMT-HAOS、DSS+FMT-MAOS和DSS+FMT-GAOS组。所有小鼠在适应后连续7天给予2% DSS。第10天处死受体小鼠，测量结肠长度，收集血液和结肠组织。进行临床和组织学参数分析、测定claudin-1和ZO-1蛋白表达水平、血清细胞因子、肠道菌群组成。

图1 本研究采用的动物实验设计。

结果

1 不同AOS对DSS诱导的结肠炎的影响 根据图1A所示的程序，研究了不同结构的AOS对DSS诱导的结肠炎的影响。AOS处理组小鼠的体重没有显著差异(图2A)。与DSS组相比，MAOS处理显著减轻了DSS诱导的结肠炎，结肠缩短明显缓解(P < 0.05)(图2B)，DAI评分(P < 0.0001)(图2C)和组织学评分(P < 0.0001)降低(图2D)。HAOS显著降低了DAI评分和组织学评分，但不增加结肠长度。然而，GAOS仅降低了组织学评分(P < 0.01)。解剖学观察还显示，MAOS干预显著减少了DSS引起的小鼠结肠出血和水肿(图2E)，而HAOS和GAOS处理没有导致任何明显的变化。组织学分析显示，HAOS和MAOS处理小鼠结肠中炎性细胞浸润、粘膜下肉芽肿、肠壁增厚(图2F，H&E)和胞质糖原升高(图2F，PAS)明显减弱。然而，GAOS处理小鼠的结肠仍然表现出严重的炎性细胞浸润、粘膜损伤、肌肉层增厚和糖原消耗。

此外，MAOS显著降低了血清中IL-6(图2G)和IL-8(图2H)的水平，显著升高了总SCFAs的血清浓度(图2I)。HAOS仅明显降低血清IL-6水平。而GAOS未能改善上述血清生化指标。

图2 HAOS、MAOS和GAOS差异抑制DSS诱导的结肠炎症状。(A)不同AOS处理和诱导结肠炎后小鼠的体重。(B)每组的结肠长度(每组n = 8)。(C)不同小鼠组的DAI评分(每组n = 8)。(D)不同小鼠组的组织学评分(每组n = 3)。(E)小鼠结肠的宏观图像。(F) AOS处理的不同组小鼠结肠切片的H&E和PAS染色。(G)血清IL-6、(H) IL-8和(I)总SCFAs浓度。

2 不同AOS对肠道屏障功能的影响

DSS诱导小鼠的肠道通透性显著高于对照组，但仅MAOS给药抑制了DSS诱导的肠道通透性变化(P < 0.001)(图3A)。通过Western blotting检测，MAOS可促进紧密连接蛋白的表达，包括claudin-1和occludin (P < 0.05，图3B)。HAOS和GAOS处理并未显著改变肠道通透性或紧密连接蛋白的表达。免疫荧光分析显示，DSS诱导claudin-1和ZO-1的荧光强度降低。MAOS干预逆转了红色和绿色荧光的下降，表明MAOS改善了claudin-1和ZO-1的表达(图3C)。而与DSS组相比，HAOS和GAOS仅提高了ZO-1荧光水平。

图3 MAOS、GAOS和HAOS对肠道屏障功能有不同影响。(A)通过血清中FITC水平评估不同组小鼠的肠道通透性。(B)给药不同AOS的小鼠结肠组织中紧密连接蛋白(包括claudin-1和occludin)的表达。(C)给药不同AOS的小鼠结肠组织中紧密连接蛋白表达的免疫荧光分析。Claudin-1(红色)、ZO-1(绿色)和DAPI(蓝色)。

3 给药不同AOS的小鼠肠道菌群组成

HAOS、MAOS或GAOS给药后，小鼠肠道微生物群在门和属水平上显示出不同的分布(图4A)。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示MAOS组与CON、HAOS或GAOS组之间的肠道微生物群结构分离(图4A)。根据Venn图(图4B)，MAOS在不同组中具有最多的特有OTUs(495)。MAOS干预组小鼠肠道微生物群的α多样性(包括Chao1指数和Shannon指数)高于对照组、HAOS组或GAOS组(P < 0.05)(图4C，D)。在属水平上，与CON组相比，HAOS处理显著改变了粪便微生物群中7个属的丰度，包括阿克曼氏菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和Parabacteroides(图4E)。MAOS处理显著增加了12个属的丰度，包括Desulfovibrio、Lachnoclostridium、Ruminococcus和Oscillibacter等(图4F)。GAOS干预仅明显改变了7个属的丰度，乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度显著降低(图4G)。

通过LEfSe分析，鉴定出与AOS处理相关的差异代表性细菌类群。LEfSe结果显示，在给药MAOS的小鼠中，梭菌、厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属和乳杆菌目富集，而在给药GAOS的小鼠中，Coriobacteriia、Rikenellaceae和Alistipes富集(LDA评分 > 3.0)(图4H)。只有uncultured Bacteroidales和Eubacterium在HAOS组中富集。基于16S rRNA序列获得的微生物群落谱，我们利用PICRUSt估计肠道微生物群的功能。如图4I和补充图4所示，在MAOS和HAOS/GAOS组之间观察到与“聚糖生物合成和代谢”、“耐药性:抗微生物”和“辅因子和维生素代谢”相关的KEGG途径的显著差异，表明MAOS处理后小鼠体内微生物群落与HAOS和GAOS相比表现出不同的功能。

图4 给药不同AOS的小鼠肠道菌群组成。小鼠给药PBS、HAOS、MAOS或GAOS 21天， 收集粪便进行16S rRNA测序。(A)通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)图显示肠道微生物群的结构。(B) Venn图显示了四组中共有和独特的扩增子序列变异(ASV)。α多样性由(C)Chao1指数和(D)Shannon指数表示。用(E) HAOS、(F) MAOS和(G) GAOS处理后，在属水平上具有显著丰度差异的分类群(P < 0.05)。(H)使用LEfSe分析对四组微生物类群的差异进行分析。(I)不同处理组肠道微生物群的KEGG通路分析。

4 不同AOS处理小鼠粪便菌群移植到DSS-结肠炎小鼠中的影响 根据图1B所示的程序，对用不同AOS处理的小鼠粪便微生物群移植到DSS-结肠炎小鼠中的效果进行了研究。DSS诱导开始时，各组小鼠的平均体重相等(图5A)。FMT干预后，从第2天到第10天，FMT-MAOS组小鼠的平均体重高于FMT-CON、FMT-HAOS或FMT-GAOS组。FMT-MAOS组的结肠长度明显更长，DAI评分和组织学评分显著低于DSS组或其他移植组(P < 0.05)(图5B–D)。FMT-HAOS和FMT-GAOS处理显著降低了组织学评分(P < 0.05)，但与FMT-CON组相比，结肠长度或DAI评分没有改变(图5B–D)。FMT-MAOS处理显著减轻了出血、水肿和结肠缩短，但FMT-HAOS或FMT-GAOS处理没有缓解(图5E)。

H&E染色显示，FMT-MAOS显著减轻了DSS诱导的炎性细胞浸润、隐窝破坏和上皮损伤，而FMT-CON、FMT-HAOS和FMT-GAOS组仅显著缓解炎性细胞浸润(图5F)。PAS染色显示，用FMT-MAOS供体粪便物质处理的小鼠体内糖原升高，表明来自FMT-MAAS供体小鼠的粪便微生物可以提高杯状细胞的丰度和结肠屏障的完整性(图5F)。而FMT-CON、FMT-HAOS和FMT-GAOS处理对糖原的丰度没有影响(图5F)。

图5 不同AOS处理小鼠的粪便微生物群移植(FMT)对结肠炎有不同的缓解作用。(A)接受FMT小鼠的体重(n = 8)。(B) FMT组小鼠的结肠长度(n = 8)。(C)不同组小鼠在实验最后一天的DAI评分(n = 8)。(D)不同组小鼠的组织学评分(n = 3)。(E)不同FMT处理小鼠结肠的宏观图像和(F)结肠切片的H&E和PAS染色图像。 

5 不同AOS诱导的肠道菌群对肠道屏障损伤的影响

TEM图像显示，DSS处理缩短了肠上皮绒毛，破坏了刷状边界，并破坏了紧密连接(图6A)。FMT-MAOS处理改善了上皮结构和上皮细胞之间的紧密连接(图6A)，而FMT-CON、FMT-HAOS和FMT-GAOS未能缓解刷状边界破坏。此外，FMT-CON和FMT-HAOS(而不是FMT-GAOS)恢复了上皮细胞之间的紧密连接(图6A)。包括claudin-1和occludin在内的紧密连接蛋白的表达在FMT-MAOS干预后显著上调(P < 0.05)(图6B和C)，而对于FMT-HAOS、FMT-GAOS和FMT-CON处理，紧密连接蛋白的表达是相同的(图第6B和C)。这些结果表明，MAOS衍生的微生物群比HAOS-或GAOS-衍生的微生物群对整体肠道屏障的恢复更好。

图6 不同AOS处理的小鼠粪便微生物群移植对结肠炎肠道屏障功能的影响存在差异。(A)结肠上皮微观结构和形态特征的TEM图像。(B)通过免疫荧光分析(IFA)测定claudin-1和ZO-1蛋白的表达水平。(C)通过蛋白质印迹(WB)分析claudin-1和occludin的表达水平。

6 不同AOS处理对血清细胞因子的影响

本研究进一步分析发现，FMT-MAOS处理降低了IL-6(P < 0.05)(图7A)、IL-8(P < 0.05)(图7B)、DAO(P < 0.0001)(图7C)和TMAO(P < 0.05)的浓度(图7D)，并上调了总SCFA含量(P < 0.01)(图7E)，表明MAOS在调节血清代谢物方面具有积极作用。与FMT-CON组相比，FMT-HAOS和FMT-GAOS处理促进了DAO浓度的降低，但对其他检测的促炎细胞因子(IL-6和IL-8)或肠道微生物群代谢产物(TMAO和SCFA)的浓度没有影响(图7A–E)。

图7 用不同AOS处理的小鼠粪便微生物群移植对血清细胞因子的表达有不同影响。(A) IL-6、(B) IL-8、(C) DAO、(D) TMAO和(E) SCFAs的血清浓度。

7 不同AOS对细胞屏障功能及体外ETEC粘附的影响

ETEC感染增加了IPEC-J2细胞的通透性(图8A)，而MAOS处理显著抑制了细胞通透性的增加(P < 0.01)(图8A)，并上调claudin-1和occludin的表达(P < 0.05)(图8B)，而HAOS和GAOS组显示出与ETEC处理相同的通透性和紧密连接蛋白表达(图8A，B)。通过mCherry标记的ETEC攻毒细胞模型研究不同AOS的抗感染能力，与ETEC攻毒组(图8D)相比，在ETEC攻毒前用MAOS处理明显降低了ETEC对IPEC-J2(图8C)和Caco2(图8D)细胞的粘附，而HAOS和GAOS处理并未降低对IPEC-J2或Caco2细胞的粘附。

图8 不同AOS影响IPEC-J2和Caco2细胞的细胞屏障功能和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)粘附。(A)用不同AOS预处理细胞24小时 ，然后用ETEC感染细胞12小时，然后分析细胞通透性的变化。(B)用不同AOS预处理细胞24小时 ，然后用ETEC感染12 小时，然后通过蛋白质印迹(WB)分析细胞中claudin-1和occludin的表达。(C)用不同AOS预处理细胞24小时 ，然后用mCherry标记的ETEC感染3 小时，通过荧光显微镜分析细胞以确定ETEC粘附性。(D)用不同AOS预处理Caco2细胞24小时 ，然后用mCherry标记的ETEC感染3 小时，通过荧光显微镜分析细胞以确定ETEC粘附性。  

讨论

最近，许多研究都集中在由益生菌、益生元和天然产物介导的肠道微生物群的改善上，现在预测肠道微生物群结构的改变与疾病之间存在密切联系。然而，各种拟议的肠道调节剂对肠道健康的影响存在很大差异。在本研究中，我们比较了不同结构AOS对结肠炎的影响，正如预期的那样，我们发现不同结构的AOS在调节结肠炎方面具有不同的功能。在三种测试的AOS结构中，MAOS似乎比HAOS或GAOS更有效地抑制DSS诱导的结肠炎，因为MAOS预处理的小鼠在DSS诱导结肠炎后表现出更好的临床和生活史参数。DSS处理导致的肠屏障功能丧失受到抑制，DSS处理后肠道通透性增加幅度较小，MAOS处理组中紧密连接蛋白claudin-1和occludin的表达显著上调，与观察到的临床体征相符。 研究表明，AOS可通过增加结肠粘膜层完整性、降低细胞凋亡、减轻肠道生态失调以及缓解炎症和氧化应激来保护肠道免受损伤。但以往研究中使用的AOS材料通常是MAOS、HAOS和GAOS的混合物，在AOS化学结构方面没有区别。本文的研究结果表明，AOS的有益作用可能主要归因于MAOS。这一认识有助于临床应用AOS预防和精准治疗结肠炎。 益生元预防和缓解结肠炎与肠道微生物群组成的改变密切相关。还深入研究了AOS塑造肠道微生物群的能力，使用AOS处理小鼠的粪便成功缓解了FMT小鼠的小肠粘膜炎并改善了精子质量。在本研究中，我们比较了不同结构AOS介导的肠道菌群组成的变化，发现MAOS明显诱导了微生物群落结构的变化，提高了肠道微生物群的多样性和丰度，而HAOS和GAOS改变了肠道菌群的组成，但未能改变其多样性和丰度。 HAOS处理显著增加了阿克曼氏菌属的水平，表明阿克曼菌可能是缓解结肠炎的关键菌属。阿克曼菌与肠道中SCFAs的产生有关，作为益生菌补充阿克曼菌也可以显著缓解DSS诱导的急性结肠炎。HAOS和MAOS干预均显著增加了瘤胃球菌属，据报道，将瘤胃球菌移植到小鼠体内可提高促炎细胞因子(干扰素-γ，IL-17)和抗炎细胞因子(IL-22)的水平。 本研究中一个有趣的发现是，MAOS处理后脱硫弧菌的相对丰度增加(图4F)，因为该属在人体肠道中的作用被争议为共生或有害。在其他报告中也观察到脱硫弧菌的丰度增加，并与Mytilus coruscus多糖和微生物群转移治疗介导的有益肠道微生物群的变化呈正相关。先前的一项研究还表明，DSS处理显著降低了脱硫弧菌的丰度。在本研究中，FMT-MAOS处理在缓解结肠炎方面显示出显著的治疗效果，表明脱硫弧菌丰度的增加可能是有益的，并改善肠道稳态以促进对结肠炎的抵抗。值得注意的是，MAOS干预后检测到的代表性菌群包括乳杆菌科、乳杆菌目和乳杆菌属，它们对免疫反应调节、细菌稳态、病原菌抑制、屏障功能和有益代谢物的产生具有积极作用。我们注意到，GAOS处理后乳杆菌属明显减少，这可以部分解释为什么在本研究中，GAOS(无论是灌胃给药还是FMT)对微生物群的改变未能缓解结肠炎。 FMT是一种通过直接细菌转移来塑造肠道微生物群的策略，超级FMT供体是确保靶向细菌治疗成功的首选。FMT研究也提供了直接证据，表明各种调节剂对肠道屏障和免疫反应的影响与肠道微生物群的调节有关。本研究发现来自MAOS供体的FMT明显减轻了小鼠结肠炎的症状，并且肠道屏障功能明显改善(但GAOS或HAOS供体的FMT没有改善)。低聚糖具有结构灵活性、稳定性、安全性和器官靶向性等优点。研究已广泛证实，功能性低聚糖通过调节肠道微生物群对肠道健康有益，包括低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚壳聚糖(COS)。然而，MAOS似乎比其他功能性低聚糖更独特，在本研究中对肠道菌群的修饰方面表现出更高的优势。此外，MAOS作为唯一的低聚糖成分被建议用于治疗阿尔茨海默病和认知障碍。MAOS调节肠道稳态的具体机制值得进一步探讨。本研究推进了AOS结构与功能关系的研究进展，为AOS的分子作用机制奠定了基础。 TMAO水平升高与心血管疾病呈正相关，血清DAO浓度升高可能导致肠道通透性增加。只有FMT-MAOS显著降低了TMAO和DAO的浓度。血清细胞因子分析还显示，仅在接受MAOS供体FMT的结肠炎小鼠中IL-6和IL-8水平显著降低，这表明这些FMT供体有潜力成为成功的结肠炎细菌治疗的超级供体。我们还根据以前的报告评估了血清中的总SCFA含量。MAOS和FMT-MAOS干预引起的总SCFAs水平的升高可能在全身循环，并对许多器官产生影响。据我们所知，这是第一份显示不同低聚糖在产生FMT供体方面的差异效应的报告，并进一步验证了供体筛选对成功治疗的重要性。

本研究的结果表明，AOS的组成在决定对宿主的益处方面很重要。本研究结果也可以部分解释为什么单用MAOS作为GV971的主要成分，被推荐用于治疗AD和认知障碍，而这些疾病也与肠道微生物群紊乱密切相关。 MAOS在防止ETEC在IPEC-J2和Caco2细胞中的粘附和通透性方面也同样有效，这与我们之前的研究一致，即低聚壳聚糖抑制了ETEC对IPEC-J2细胞的粘附，并增加了紧密连接蛋白的表达。而HAOS和GAOS处理对ETEC粘附和上皮屏障功能无明显调节作用。由于体外实验独立于肠道细菌，结果表明AOS导致上皮细胞中信号通路的结构相关激活，从而对屏障功能和ETEC粘附产生不同的调节作用。因此，MAOS衍生通路对直接获益效应的贡献还需要进一步研究。 综上所述，我们阐明了结肠炎中AOS及其衍生菌群的结构-功能关系。本文的研究结果清楚地表明，MAOS(而非GAOS或HAOS)是预防和缓解DSS诱导的结肠炎以及改变肠道菌群组成的积极贡献者。因此，在AOS生产过程中，利用特定的海藻酸裂解酶降解海藻酸，可以获得不同结构的AOS。鉴于MAOS在调节微生物群方面的独特优势，MAOS诱导的微生物群可以作为可能的超级供体制备成微生物制剂，进一步深入探索MAOS衍生的菌群代谢产物，以寻求治疗微生物紊乱引起的肠道疾病的新治疗策略。综上所述，这些结果将指导AOS在食品或药物生产中的定向生产和精确应用。