科研丨温医大＆上海交大: 与代谢相关脂肪性肝病相关的唾液微生物群的生态变化(国人佳作)

编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)是与代谢综合征有关的最常见的慢性肝病。然而，MAFLD患者唾液微生物组的生态变化仍然未知。本研究旨在探究MAFLD患者唾液微生物群落的变化，并探讨微生物群的潜在功能。通过16S rRNA扩增子测序和生物信息学分析，对10例MAFLD患者和10例健康参与者的唾液微生物群进行分析。通过体检和实验室检查来评估受试人群的身体成分、血浆酶、激素和血脂谱。结果表明，与对照受试者相比，MAFLD患者唾液微生物组的α-多样性增加，β-多样性聚集明显。LEfSe分析显示，两组之间共有44个分类群存在显著差异。Neisseria、Filifactor和Capnocytophaga被鉴定为差异富集菌属，用于两组比较。共现网络表明，MAFLD患者的唾液微生物群表现出更加复杂且紧密的相互关系。基于唾液微生物组的诊断模型具有良好的诊断性能，其曲线下面积为0.82(95%CI：0.61-1)。冗余分析和spearman相关性分析发现，与胰岛素抵抗和肥胖有关的临床变量与微生物群落密切相关。基于PICRUSt的宏基因组预测显示，与代谢相关的通路在两组中更为普遍。综上，MAFLD患者唾液微生物群表现出生态变化，基于唾液微生物组的诊断模型为辅助MAFLD诊断提供了一种有前景的方法。

论文ID

原名：Ecological shifts of salivary microbiota associated with metabolic-associated fatty liver disease

译名：与代谢相关脂肪性肝病相关的唾液微生物群的生态变化

期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

IF：6.073

发表时间：2023.2

通讯作者：潘乙怀；黄正蔚

通讯作者单位：温州医科大学口腔医学院·附属口腔医院；上海交通大学医学院附属第九人民医院

DOI号：10.3389/fcimb.2023.1131255

实验设计

结果

1、受试者特征和一般临床数据

受试者的人口统计学数据、临床特征和实验室数据详见表1。在年龄、性别、血压、心率、牙周炎和DMFT方面两组之间无明显差异，但就BMI和腰髋比(WHR)而言，MAFLD组的患者要高于对照组人群。生化指标方面，MAFLD组的空腹血糖(FPG)、血清胰岛素(FSI)、胰岛素耐受性的稳态模型评估(HOMA-IR)和糖基化血红蛋白(HbA1C)显著升高，表明MAFLD患者存在胰岛素耐受性(IR)。此外，MAFLD组的甘油三酯(TG)水平相对较高，同时其高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平相对较低，这导致了该组中TG/HDL-C比值高于对照组。尽管丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平在两组之间无统计学差异，但MAFLD组的AST/ALT比值显著降低。

表1 受试人群的人口统计学和临床特征。

2、唾液菌群的群落结构和菌群组成

从20份唾液样本中共鉴定到16个细菌门、24个细菌纲、62个细菌目、100个细菌科、205个细菌属、383个细菌种和453个OTUs。在α-多样性方面，如表2所示，MAFLD组患者的ACE指数和Chao1丰富度指数显著高于对照组人群，这表明MAFLD显著改变了唾液微生物群的多样性和丰富度。在属水平上采用基于欧氏距离的主坐标分析(PCoA)评估唾液菌群的β-多样性，尽管存在部分重叠，但两组人群的唾液微生物群落具有显著性差异(AMOSIM，P = 0.04；图1A)。使用监督PLS-DA图对样本聚类进行可视化，进一步证实了组间存在显著分离(图1B)。

在门水平上，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门、Patescibacteria和Spirochaetota是两组人群中主要的优势细菌门，占群落丰度的99%以上。值得注意的是，与对照组相比，MAFLD患者中厚壁菌门的相对丰度增加，变形菌门的相对丰度下降，从而导致MAFLD组中厚壁菌门/变形菌门比值升高(图1C)。在属水平上，对照组和MAFLD组的优势细菌属包括链球菌属(Streptococcus，相对丰度分别为22.09%和18.70%)、奈瑟菌属(Neisseria，相对丰度分别为7.89%和17.44%)(图1D)。

表2 MAFLD组和对照组唾液微生物群α多样性。

图1

MAFLD组与对照组唾液微生物群落结构比较分析。(A)属水平主坐标分析(PCoA)；(B)属水平偏最小二乘判别分析(PLS-DA)；(C)门水平的微生物群落结构。(D)属水平的微生物群落结构。

3、唾液微生物类群的改变

基于测序所得到的群落丰度数据，我们在属水平上对两组人群的微生物丰度进行了比较，以评估唾液微生物群的具体变化。ANCOM分析显示，Filifactor、奈瑟菌属(Neisseria)和二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)的丰度在两组之间存在显著差异(表3)。LEfSe分析显示，MAFLD组中Howardella、密螺旋体属(Treponema)、脱硫球茎菌属(Desulfobulbus)、Bulleidia、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、Filifactor、Eggerthia、Fretibacterium、Shuttleworthia和罗氏菌属(Roseburia)的丰度更高。相比之下，对照组人群中奈瑟菌属和二氧化碳噬纤维菌属的丰度更高(表3)。图2中展示了基于LEfSe分析所计算得到的LDA评分高于2.0的门到属水平上具有丰度差异的微生物类群。结果显示，不同组间差异显著的有4门、5纲、9目、11科、15属，其中36个分类群富集于MAFLD组中，8个分类群富集于对照组中。这些结果表明MAFLD患者和健康受试者的唾液中存在特定细菌。

进一步对属水平丰度前50位的分类群进行共现网络分析，以探究微生物群落内的生物相互作用。如图3所示，两组之间的微生物网络略有不同，MAFLD组内的分类群表现出更复杂且稳健的相互关系。MAFLD组和健康组的网络传递性分别为0.522和0.438。相比之下，MAFLD组的平均最短路径长度为2.240，健康组为3.207。

图2

MAFLD组与对照组唾液微生物群丰度差异的鉴别分析。基于LEfSe分析绘制的Cladogram图，其中红色表示MAFLD组样品富集的类群，蓝色表示对照组样品富集的类群(LDA>2.0, P<0.05)。

图3

MAFLD组(A)和对照组(B)构建的丰度前50个属的微生物共现网络。每个节点代表一个属，节点的大小与平均相对丰度成正比。相同的颜色代表属于同一门的属。每个连接的粗细与系数值成正比。红色和绿色线分别表示正和负相互作用。

表3 MAFLD组和对照组之间显著差异属。

4、基于唾液菌群的MAFLD诊断模型

随后我们进行了随机森林分析以探究唾液菌群对MAFLD的诊断潜力。一般认为曲线下面积(AUC)的值越大，生物标志物的诊断准确性越高。在唾液微生物群中，包括Fretibacterium、奈瑟菌属、密螺旋体属、Delftia、二氧化碳噬纤维菌属、小杆菌属(Dialister)和Erysipelotrichaceae_UCG-003在内的7个属被确定为最佳生物标志物，AUC为0.82(95%CI：0.61-1)(图4)。这些结果表明，唾液微生物标志物在区分MAFLD患者和健康人群方面具有良好的诊断潜力。

图4

基于唾液微生物组的MAFLD诊断模型。(A)随机森林模型中按重要性排序的属的柱状图。(B)接受者工作特征曲线在属水平上的AUC值为0.82。绿色部分为置信区间。

5、临床变量与微生物群落的相关性

为了探索微生物群落组成与多个临床变量之间的潜在相关性，我们选择了包括BMI、WHR、总胆固醇(TC)、TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、HDL-C、AST/ALT、GGT、HOMA-IR和HbA1c在内的10个主要临床变量进行冗余分析(RDA)检验。如图5A所示，HOMA-IR(r2 = 0.4896，p = 0.007)、BMI(r2 = 0.4819，p = 0.0.003)、WHR(r2= 0.4595，p = 0.006)和HbA1c(r2 = 0.3874，p = 0.018)在唾液群落组成中发挥重要作用。此外，Spearman相关热图描绘了前20个丰富属与临床变量之间的相关性(图5B)。

图5

微生物群落与临床变量的相关性分析。(A)属水平微生物种群分布的RDA分析，图中箭头代表临床变量，长箭头表示与唾液微生物组的分布高度相关。两条箭头线的锐角表示临床变量之间呈正相关，钝角表示负相关。(B)基于前20个丰富唾液微生物群和临床变量的Spearman相关性热图。右侧的颜色范围显示不同R值的颜色分区。每个物种的聚类树在热图的左侧。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

6、功能通路的改变

为了研究唾液微生物群的功能意义，我们进一步通过PICRUSt2从16S rRNA数据中预测宏基因组功能。值得注意的是，KEGG富集分析得到的前15条显著富集的通路中，有7条通路属于代谢通路(图6)。与嘧啶代谢以及果糖和甘露糖代谢相关的通路在MAFLD组中显著增加，而与2-氧代羧酸代谢、硫代谢、谷胱甘肽代谢、酪氨酸代谢、抗坏血酸和aldarate代谢等相关的通路在该组中减少。

图6

使用PICRUSt2对宏基因组功能进行预测。左侧的条形图显示了每个KEGG通路的平均比例；右侧显示了比例之间的差异。

讨论

唾液微生物群是口腔内不同部位的微生物库，可以代表整个口腔微生物群，能够反映口腔健康和身体健康状况。已有的研究表明，越来越多的代谢紊乱可能与唾液微生物生态变化有关，如动脉粥样硬化、2型糖尿病、多囊卵巢综合征和肝性脑病等。然而，据我们所知，很少有研究在微生物水平上去探究唾液微生物群与MAFLD之间的关联。本研究发现，MAFLD患者的异常代谢水平显著改变了唾液微生物群的组成和结构，这在区分MAFLD患者与健康人群方面具有良好的诊断能力。

口腔微生物多样性对维持机体健康至关重要，并随宿主的生理状态而变化。一般而言，高水平的微生物群丰富度和多样性被认为是健康生态系统的标志，尤其是在肠道微生物生态系统中。然而，我们当前的研究表明，MAFLD患者唾液微生物群的α-多样性(ACE指数和Chao1指数)有所增加。尽管在Shannon和Simpson指数中未观察到显著差异，但两者均提示MAFLD患者的多样性略有增加。这些结果与我们之前关注的MAFLD相关人群龈上微生物群变化的研究一致。基于Takeshita等人提出的概念，口腔健康状况不佳可能导致唾液中的微生物丰富度增加。因为长期的菌斑积累可能引起附着细菌的繁殖，牙龈出血可以为细菌生长提供丰富的营养物质。这些生态转变可能促进唾液中的细菌组装。这一现象已在其他代谢性疾病患者中观察到。此外，PCoA和PLS-DA结果显示两组之间的微生物群落存在显著聚集。因此，MAFLD患者的代谢水平改变会引起唾液微生物群的变化，并增加口腔疾病的风险。

厚壁菌门和变形菌门的丰度呈现出不同的变化趋势，与对照组相比，MAFLD组的厚壁菌门增加而变形菌门减少，这导致了厚壁菌门/变形菌门比值的增加。在原发性干燥综合征和精神分裂症患者的唾液微生物组中也检测到了类似厚壁菌门/变形菌门比值增加的情况。与MAFLD相似，这两种疾病的特征为慢性低度炎症。Lau等人还揭示了代谢手术后伴有轻度肥胖的2型糖尿病成人肠道微生物群中厚壁菌门/变形菌门比值有所降低。一个可能的原因是，变形菌门是革兰氏阴性菌的一个主要门类，主要与葡萄糖稳态改善、代谢改善和炎症反应降低相关。相比之下，厚壁菌门主要是革兰氏阳性菌，通过断链脂肪酸合成在碳水化合物和脂质的发酵和代谢中发挥关键作用，这通常有助于肥胖的发展。因此，这表明在MAFLD状态下，厚壁菌门细菌在生态位占用方面可能比变形菌门细菌具有竞争优势。然而，厚壁菌门/变形菌门比值是否可用作微生物组研究中生态系统健康的标志物仍需要更多研究来证实。

LEfSe和ANCOM分析显示两组之间存在显著差异。MAFLD患者中主要富集产Filifactor，而奈瑟菌属和二氧化碳噬纤维菌属主要在健康对照人群中更丰富。此外，密螺旋体属、Fretibacterium、丙酸杆菌属、Shuttleworthia、Eggerthia、Bulleidia、Howardella和脱硫球茎菌属在MAFLD组中的比例更高。众所周知，Filifactorspp.是众所周知的牙周病原体，其在肝癌患者的唾液微生物群中大量存在。密螺旋体属由一组不同的致病性或共生微生物组成，不仅可引起梅毒、雅司病和品他病感染，还与慢性肝病、感染性心内膜炎和阿尔茨海默症有关。此外，口腔Treponema denticola与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和Tannerella forsythia共同被称为“红色复合体”，被广泛认为是牙周病病因和发病机制中的基本病原体。一系列动物和人体研究证实：Fretibacterium、Propionibacterium、Shuttleworthia、Eggerthia以及Bulleidia细菌属在患有肝病(包括非酒精性脂肪肝、肝细胞癌)的口腔或肠道菌群中普遍存在。这些结果可以通过新兴的口腔-肠-肝轴来解释，即口腔微生物可以转移到胃肠道中，在胃肠道中它们将扩散到肝脏并诱发肝脏疾病。另一方面，奈瑟菌属通常为革兰氏阴性微生物，主要包括口腔中的非致病性菌种。我们先前的研究中曾表明，健康人群的龈上菌斑中奈瑟菌的丰度高于MAFLD患者。Capnocytophaga是一种革兰氏阴性厌氧菌，据报道其可改善口腔健康并减少龋齿形成。有趣的是，奈瑟菌属和二氧化碳噬纤维菌属已被确定为人类口腔健康“核心微生物组”的一部分。

微生物以错综复杂的相互作用网络共存，进而影响相关物种，并可能导致疾病的发生。如共现网络图所示，MAFLD患者唾液中的细菌属间相互作用表现出较高的网络传递性和较低的平均最短路径长度。传递性测量网络的平均连通性，数值越高表明存在连接越紧密的簇(属间相互作用越多)。相比之下，微生物网络中较低的平均最短路径长度表明物种通过较短路径相互连接。潜在的原因可能是，MAFLD患者唾液网络中的短路径长度和紧密连接可以在细菌物种之间快速传递信号，从而可能促进群落代谢的转变。

及时准确地诊断MAFLD是进行快速治疗干预的先决条件，这可以抑制疾病进展。随机森林分析显示，唾液菌群特征具有良好的诊断能力(细菌分类群的AUC达到0.82)，可将MAFLD患者和健康人群区分开来。这些发现强化了唾液微生物可能富含诊断生物标志物的概念，可以作为口腔和全身疾病的指标。Schwimmer等人使用儿童粪便样本进行16S rRNA测序发现，结合血清ALT水平和编码基因相对丰度的预测模型可区分非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、NASH和重度纤维化受试者，AUC分别能够达到0.95、0.92和0.87。尽管肠道菌群预测似乎优于MAFLD，但考虑到无创性和可及性，生化血液指数未纳入本研究中基于唾液的生物标志物模型中。如何将这些关键微生物生物标志物转化为临床实践的可用工具是下一步研究的关键。

许多研究报告了MAFLD的复杂病因和发病机制，MAFLD发展的潜在风险因素包括IR、肥胖和血脂异常，其中IR占中心地位。IR意味着身体肌肉、脂肪和肝脏中的细胞不能对促进葡萄糖摄取和脂肪储存的正常浓度的胰岛素激素有很好的响应。因此，能量摄入与消耗之间的不平衡引起的IR可导致肝脏脂肪蓄积，并通过增加血液中的循环游离脂肪酸促进血脂异常。在本研究中，MAFLD组的HOMA-IR超过阈值，并且显著高于对照组，这表明IR在MAFLD患者中非常普遍。此外，HbA1c和TG/HDL-c比值的升高进一步证实了MAFLD组的IR倾向。此外，血清转氨酶水平的升高和AST/ALT比值的降低是持续肝细胞损伤的标志。这些指标在进展性MAFLD患者中通常会出现紊乱，这意味着入选的MAFLD患者存在不同程度的肝细胞损伤。

RDA分析进一步验证了IR(HOMA-IR：p= 0.007；HbA1c：p = 0.018)和肥胖 (BMI：p = 0.003；WHR：p = 0.006)对唾液菌群分布的显著影响。如Spearman相关热图所示，尽管一些相关性未达到统计学显著性，但奈瑟菌、二氧化碳噬纤维菌、Haemophilus和Rothia倾向于与IR、肥胖和血脂异常指数呈负相关。这些菌属属于硝酸盐还原菌，存在于口腔中，能够通过硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮途径对宿主产生有益作用，如调节葡萄糖代谢、降低脂质水平和减少炎症。然而，这些口腔硝酸盐还原微生物在MAFLD中的具体作用和相关机制仍有待进一步阐明。本研究所得到的负相关性结果支持以下假设：代谢异常(例如，血脂异常、IR和肥胖)可能在调节口腔微生物组成和引起口腔微生态失调中发挥作用。梭杆菌属与TC和LDL-C水平呈正相关，这与梭杆菌属通过脂质代谢异常参与动脉粥样硬化发病机制的观点一致。

PICRUSt2功能预测分析表明，两组之间的主要功能变化是代谢相关通路。嘧啶代谢以及果糖和甘露糖代谢途径的上调与我们之前在MAFLD患者中进行的龈上菌斑研究一致，进一步证实了口腔细菌的代谢相关途径与MAFLD的发生有关。与氨基酸代谢相关的途径(包括谷胱甘肽代谢和酪氨酸代谢)在健康受试者中更普遍，可能是因为MAFLD患者存在肝细胞损伤引起的氨基酸代谢紊乱。然而，需要进一步的代谢组学研究来探索MAFLD中的代谢及其与唾液微生物组的关系。

本研究的局限性在于样本量有限。尽管入选标准严格，但未来需要更大样本量的研究来控制潜在的混杂因素。此外，由于16S rRNA测序的限制，可能需要宏基因组学测序来对MAFLD患者唾液微生物群变化相关的功能信息进行基因注释和验证。

综上所述，本研究系统描述了MAFLD患者和健康个体之间唾液微生物群的变化，评估了唾液微生物群作为预测MAFLD的辅助诊断工具的潜在价值，并证明了生化变量，尤其是IR在微生物生态转变中的作用。本研究深入了解了唾液微生物群与MAFLD之间的关系，这可能有助于制定预防、诊断和治疗MAFLD的策略。