科研丨RESP RES: 肠道菌群调节博莱霉素诱导的小鼠急性肺损伤反应

编译：微科盟如风，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   小鼠气道灌注博莱霉素(BLM)是一种广泛使用但具有挑战性的急性肺损伤(ALI)模型，研究者在治疗方案和动物结局方面存在高度差异。目前尚不清楚肠道菌群是否在BLM引起的肺损伤的结果中发挥任何作用。本研究对C57BL/6小鼠气管内灌注BLM，通过16S rRNA扩增子和宏基因组测序分析粪便微生物组。利用无菌小鼠常规化和SPF小鼠之间的粪便菌群转移，以确定与更严重的BLM反应相关的优势共生物种。此外，通过流式细胞术分析小鼠的肺和肠道引流淋巴结，以确定与BLM敏感微生物组相关的免疫表型。结果表明，来自芝加哥大学两个SPF屏障设施的小鼠在BLM引起的肺损伤期间表现出显著不同的死亡率和体重减轻。粪便微生物群从小鼠死亡率较低的设施转移到存活率较高的设施中的小鼠，使受体小鼠更容易受到BLM诱导的体重减轻的影响。BLM敏感表型与肠道中Helicobacter和Desulfovibrio的存在、稳态时Th17-中性粒细胞轴减少以及损伤反应急性期肺中性粒细胞积聚增加有关。综上所述，肠道菌群的组成对BLM诱导的消瘦和死亡有显著影响，表明肺-肠轴在肺损伤中的作用。    

论文ID

原名：Gut microbiota modulates bleomycin-induced acute lung injury response in mice 

译名：肠道菌群调节博莱霉素诱导的小鼠急性肺损伤反应

期刊：Respiratory Research

IF：7.162

发表时间：2022.12

通讯作者：Anne I. Sperling

通讯作者单位：美国芝加哥大学医学系

DOI号：10.1186/s12931-022-02264-7

实验设计

结果

1 饲养在两种SPF动物设施中的C57BL/6小鼠对BLM诱导的肺损伤的反应不同  

作者小组先前的研究表明，气管内给药BLM会导致C57BL/6小鼠肺损伤，包括体重减轻、肺水肿和中性粒细胞增多。我们发现，C57BL/6小鼠和B6的野生型(WT)同窝小鼠在芝加哥大学动物饲养设施进行实验时，ICOS-/-菌株在1 U/kg剂量的BLM处理下存活下来(设施A)。然而，当我们在不同的饲养设施(设施B)中进行实验时，来自C57BL/6背景的多个菌株(B6.PHIL和B6.PLZF-/-菌株)的WT同窝仔鼠的死亡率明显更高(图1)。这两个设施都由大学的同一个动物资源中心维持在SPF Barrier I级。为确保排除某些病原体，这些设施配备了定向气流，并提供辐照饲料和高压灭菌笼具和垫料。由于两个设施处于同一级别，因此允许在两个设施之间转移动物，研究人员可以按任何顺序进入这些设施。因此，观察到不同设施之间动物的存活率存在巨大差异令人惊讶。在C57BL/6背景下，不同WT同窝仔鼠均在各自的房间内出生和长大，在这些房间里，动物受到BLM攻毒并随后受到监测。BLM模型对小鼠的性别和年龄以及BLM的来源很敏感。例如，在BLM模型中，雄性小鼠明显更容易出现体重减轻、促炎反应和纤维化。与这一已知现象一致，BLM易感性的设施依赖性差异在成年雄性小鼠中很明显，而雌性小鼠在两个设施中很少死亡。接下来，我们使用相同的BLM种群和人员在同一天在两个设施中攻毒年龄和性别匹配的雄性C57BL/6小鼠。同样，我们观察到两个设施之间匹配小鼠的存活率存在显著差异(图1B)。此外，在使用LPS的第二个肺损伤模型中观察到两个设施中的小鼠对肺损伤的易感性差异(附加文件1:图S1)。这些数据表明，我们观察到的现象与肺损伤期间诱发的一些常见通路有关。

图1 被安置在两个SPF级住房设施中的WT小鼠对肺损伤的反应表现出不同的存活率。对博莱霉素的反应是在WT小鼠中测量的，这些小鼠具有C57BL/6背景，但在芝加哥大学单独的SPF动物住房设施中出生和长大。小鼠气管内接受1.0 U/kg博莱霉素，每天监测体重减轻情况和存活率。如果小鼠体重减少了25%或更多，则对它们实施安乐死。A，生存数据由多个实验汇编而成。B，在同一天用相同的BLM处理后，两个设施中年龄匹配的雄性B6小鼠的存活率。P值由对数秩检验获得。

2 常规无菌小鼠概括了各供体小鼠对BLM挑战的反应

本研究假设，两个动物饲养设施中微生物群的差异可能是导致对BLM攻毒的易感性差异的原因。为了检验这一假设，我们对无菌(GF)C57BL/6雄性同窝小鼠在两个设施中的任何一个进行常规化，方法是每周两次在各自的设施中添加来自WT SPF小鼠邻近笼子的脏笼具和粪便。根据一项已发表的研究设计，将小鼠常规化处理2周，该研究表明，在动物同居2周后可实现细菌的水平转移和宿主免疫细胞的分化。

用BLM处理常规化的ex-GF小鼠(图2A)。我们监测体重作为肺损伤程度的指标，因为BLM模型的体重减轻与肺损伤之间存在显著相关性。即使小鼠的健康评分足够高，体重减轻25%或更多的小鼠也会被安乐死。与SPF小鼠的反应相似，设施A中只有一只ex-GF小鼠死于BLM诱导的肺损伤(10%死亡率)，而设施B中11只小鼠中有5只(45%)死亡(图2B)。此外，在设施B中，到第3天，小鼠的体重已经明显减轻，这表明对肺损伤的早期反应受到了影响。在整个实验过程中，体重下降情况明显不同(图2C)。我们在图1中发现的一个局限性是，虽然所有的小鼠都是C57BL/6背景，但每个品系的起源是未知的，因此小鼠可能存在一些遗传差异。然而，这些来自常规化ex-GF C57BL/6小鼠的结果表明，BLM诱导的肺损伤期间的体重减轻受微生物群的影响，与小鼠的遗传无关。

图2 在两个SPF设施中常规化无菌同窝仔鼠可调节肺损伤反应的严重程度。A，无菌C57BL/6雄性同窝小鼠被转移到两个SPF设施中的任何一个，并通过每周两次添加脏垫料和来自邻近笼子的粪便进行常规化14天。对常规化的ex-GF小鼠气管内注射1.0 U/kg博莱霉素，每天监测存活率和体重减轻情况。B，常规化ex-GF小鼠在博莱霉素处理后的存活率和体重减轻(C)。P值分别从对数秩检验和双因素方差分析中获得，表示为P < 0.05(*)、P < 0.01 (**)、P < 0.001 (***)。  

3 两个SPF饲养设施中的常规ex-GF小鼠具有独特的粪便微生物组

为了研究两种SPF设施中常规ex-GF小鼠BLM易感性的差异是否可归因于微生物群落，我们对BLM处理(A0和B0)或7天后(A7和B7)获得的粪便样本进行了16S rRNA基因扩增测序(图3A)。扩增子序列变异(ASV)的加权UniFrac分析表明，两个设施中动物粪便微生物群落的群落结构存在显著差异(图3B)。两个设施之间加权UniFrac距离的差异在第二主成分(PCoA2)上很明显，与BLM处理无关。Shannon指数是衡量总ASV数量和每种ASV丰度的指标，与基线和BLM处理后7天的设施A小鼠相比，基线时设施B小鼠的样本显著更高(图3C)。这些数据表明，与设施A小鼠相比，设施B小鼠的微生物群落不仅整体结构不同，而且物种多样性更大。 为了研究特定的分类群是否会导致肠道菌群多样性和结构的差异，我们通过对来自未受干扰的动物数据进行宏基因组谱(STAMP)统计分析来比较ASV的相对丰度。我们发现Ruminococcaceae(科)、Lachnospiraceae(科)、Oscillospira(属)、Rikenella(属)和Desulfovibrionaceae(科)的成员在设施B中明显更丰富，而设施A中Bacteroides(属)和Turicibacter(属)显著富集(图3D)。基线时设施B小鼠中丰度相对较高的三个分类群，包括Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Oscillospira，都属于梭菌目。此外，一些未分类的Clostridiales2成员是设施B小鼠中差异富集最多的分类群。

有趣的是，我们观察到BLM处理后Clostridiales丰度发生了变化。对BLM处理后第7天收集的样本进行分析显示，Clostridiales2的丰度不再有显著差异，而与设施A小鼠相比，设施B小鼠中Clostridiales1(目)的一些未分类成员的丰度明显降低(附加文件1：图S2)。此外，在BLM处理后，设施A小鼠体内Bifidobacterium(属)、Adlercreutzia(属)和Turicibacter (属)出现富集。有趣的是，在设施B小鼠中，即使在BLM处理后，一些bacterium F16(科)和Desulfovibrionaceae(科)成员的丰度仍然较高(附加文件1:图S2)。总体而言，我们对16S rRNA基因序列的分析表明，在两种不同的设施中，被常规化的基因相似的同窝小鼠之间，特定类群的群落结构和相对丰度存在显著差异。

图3 两个SPF设施的肠道菌群结构不同。A，在14天的常规化之后，在博莱霉素处理前(D0)和处理后(D7)从ex-GF小鼠收集粪便样本(每种情况n = 7)。通过粪便样本的16S rRNA基因(V4区)测序分析肠道微生物结构。B，相似系数的加权UniFrac分析是根据每只小鼠的16S rRNA基因序列计算的。进行置换多元方差分析以分析β多样性的配对统计差异。C，样本内丰富度和均匀度(α多样性)通过Shannon多样性指数衡量[A0 vs. B0(p= 0.0003)；A7 vs. B0(p= 0.0267)]。D，利用宏基因组谱统计分析(STAMP)软件包分析了两种设施在D0时微生物类群的差异丰度。

4 将一个饲养设施中的SPF小鼠粪便菌群转移到另一个饲养设施可调节气管内BLM的易感性

鉴于每个饲养设施中都有独特的微生物群落，我们试图确定每个设施的微生物群是否与促进或预防肺损伤有关。尽管最初在我们的动物设施中的多个近交品系小鼠中观察到了不同的BLM易感性，但由于哺乳动物肠道微生物群从不同祖先起源进行垂直传播，即使在同一设施中，微生物群落中的一些异质性也是不可避免的。为了控制祖先微生物群的可能影响，每个动物设施中常规化ex-GF同窝仔的后代作为稳定的SPF菌落维持多代，并用于本研究的所有后续实验。为了研究粪便微生物群从一个设施中的小鼠转移到另一个设施中的小鼠是否可以调节对BLM诱导的肺损伤的易感性，我们对这些SPF小鼠进行了粪便微生物群移植(FMT)。在没有预先操纵内源微生物组的情况下，两个设施中的SPF同窝仔通过口服灌胃3次接受来自同一设施或另一设施的动物的FMT，然后用BLM处理小鼠。值得注意的是，在应对BLM攻毒时，与同窝对照相比，引入设施B微生物群足以增加设施A中SPF级动物的体重减轻(图4A)。然而，设施A的微生物群并没有改变设施B中BLM诱导的动物体重减轻(图4B)。这些数据表明，设施B微生物群的某些成分以显性负向方式加重了BLM诱导的小鼠体重减轻。

图4 从设施B到A的粪便微生物群转移使受体更容易受到肺损伤反应的影响。A-B，在每个SPF设施中出生和长大的常规ex-GF初代的同窝后代小鼠被分成两个笼子。一笼小鼠接受来自它们自己的混合粪便浆液(A → A或B → B)，另一笼小鼠接受来自不同设施(A → B或B → A)的小鼠混合粪便浆液，一周内灌胃3次。第一次灌胃10天后，给予1 U/kg的博莱霉素。体重曲线显示了粪便菌群从设施B转移到设施A(A)，以及从设施A转移到设施B(B)的影响。总体而言，所有组中约70%的小鼠存活下来，没有统计学显著差异，并且在死亡时删除数据点。P < 0.001(***)或无显著性(ns)。C-E，收集FMT受体在灌胃前后的粪便样本进行16S rRNA基因(V4-V5区域)测序。C，通过Shannon指数测定样本内丰富度和均匀度(α多样性)。D，根据每只小鼠16S rRNA基因序列计算相似系数的未加权UniFrac分析。E，从设施B的供体小鼠中存在但在设施A的受体小鼠中基线时不存在的共生类群列表中测量的序列扩增子百分比热图。收集供体小鼠的粪便样本，并在灌胃的几天内进行取样。分别于基线、首剂灌胃(FMT)后10天、博莱霉素攻毒(FMT + BLM)后7天纵向采集7只受体小鼠的粪便样本。F-G，对两个设施中常规ex-GF初代小鼠后代粪便样本的宏基因组学分析。样本取自naïve小鼠，未经任何处理。F，维恩图显示了每个设施中独有的分类单元。G，用于宏基因组测序分析取样的10只小鼠中Helicobacter和Desulfovibrio属物种的read计数。

5 在ALI反应期间，Helicobacter和Desulfovibrio菌种的定植与体重减轻增加有关

为了确保移植微生物组的定植，我们通过16S rRNA基因扩增子测序对基线和FMT后小鼠粪便微生物组进行了表征。尽管引入了其他微生物物种，但FMT受体动物中微生物组的α多样性与对照动物相当(图4C)。未加权UniFrac分析显示，来自两个设施的小鼠的微生物群落结构在基线时是不同的，但在FMT后它们变得更类似于各自的供体微生物组(图4D)。设施B微生物群受体(Fac B→A FMT)在肺损伤反应中表现出最显著的变化，其粪便微生物群的PCoA1变化最大。由于UniFrac考虑了系统发育距离，β多样性的巨大差异可能是由FMT植入一些系统发育距离较远的谱系引起的。 使用16S rRNA基因分析，我们调查了设施B供体特异性分类群是否可以成功地在设施A中的FMT受体中定植。根据序列reads百分比，我们发现变形菌门的两个成员，Helicobacter和Desulfovibrionaceae，是生物重复中最一致定植的属(图4E和附加文件1：图S3)。重要的是，尽管推动了PCoA1的小幅转变，但几个供体特异性分类群也显示在设施A微生物群受体(Fac A→B FMT)中成功定植。从设施A新引入的微生物被分配到多个门，包括Vampirovibrio、Ruminococcus、Alloprevotella、Allobaculum和Akkermansia(附加文件1：图S4)。这些结果表明，设施A微生物群无法抑制设施B小鼠体内预先存在的微生物群的负面影响，但设施B微生物群可以显著加重设施A小鼠的BLM诱导的体重减轻。 为了进一步阐明可能导致设施B小鼠严重体重减轻的微生物，我们对两个设施中的naïve小鼠的粪便微生物群进行了宏基因组测序。从粪便样本序列中共鉴定出268个分类单元。病毒、真菌、古菌和原生生物的标准化reads小于0.005%，并且在两个设施的动物之间，这些非细菌类群的组成没有明显差异。与FMT受体中差异定植分类群的结果类似，我们发现Desulfovibrio和Helicobacter的成员在基线时仅存在于设施B的微生物群中(图4F)。借助宏基因组测序提供的更高分辨率，我们能够在物种水平上识别候选微生物。设施B中与严重体重减轻相关的微生物种类包括Desulfovibrio sp.(Tax ID 885)、Helicobacter hepaticus、H. ganmani(Tax ID 60246)、H. typhlonius(Tax ID 76936)和H. UBA716(Tax ID 1946589)，这些微生物都在设施A微生物群中缺失(图4G)。因此，我们来自16S rRNA基因和宏基因组测序的结果表明，Desulfovibrio和Helicobacter是调节BLM诱导的肺损伤期间体重减轻程度的候选微生物。

6 安置在设施A和设施B中的Naïve SPF小鼠具有独特的免疫表型

肠道菌群在宿主免疫系统的发育和维持中起着至关重要的作用，它不仅可以决定肠道的健康，还可以决定包括肺在内的远端器官的健康。为了验证两个设施中饲养的SPF小鼠具有不同的基线免疫表型的假设，我们设计了针对T细胞、树突状细胞、B细胞、先天免疫细胞和先天样淋巴细胞的综合流式细胞仪面板，并分析了来自两个设施的年龄和性别匹配的naïve动物的肠道引流淋巴结(gLN)、脾脏和肺。首先，我们专注于研究gLN中T细胞的表型，因为已知我们饲养设施中的一些共生微生物可调节辅助性T细胞分化。由于H. hepaticus是一种致病菌，WT小鼠具有一种耐受机制，即诱导抑制促炎性Th17细胞的RORγt+Foxp3+调节性T(Treg)细胞。与此一致，我们发现，与基线时的设施A小鼠相比，设施B中携带H. hepaticus的小鼠的gLN中RORγt+ Treg细胞增加，Th17细胞减少(图5A、B)。然而，在两个饲养设施中，naïve小鼠的肺部适应性免疫细胞组成相当(附加文件1：表S1)。

接下来，我们进行了FlowSOM聚类分析，以比较两个设施中naïve小鼠肺部先天免疫细胞的整体情况。我们发现，与设施A小鼠相比，设施B小鼠的FlowSOM种群8增加，种群9减少(图5C)。种群8中的细胞表达与NK细胞一致的标志物，而中性粒细胞标志物在种群9中表达(图5D)。通过手动门控，我们确认了设施B小鼠肺部NK细胞比例增加，中性粒细胞减少(图5E、F)。有趣的是，设施B小鼠脾脏中的中性粒细胞频率也较低，进一步证实了我们的结果(附加文件1：图S5D)。这表明在这些具有不同肠道微生物群的SPF小鼠中，稳态期间的粒细胞生成可能受到不同的调节。总体而言，本研究数据表明，这两个设施中的小鼠具有不同的免疫表型，因此设施B小鼠的肠道淋巴结Th17细胞和全身中性粒细胞在基线时下调。

图5 共生物种的差异定植对应于naïve动物肺部的特定免疫景观。对常规ex-GF初代小鼠的未受干扰后代的肠道引流LN和肺进行了免疫表型分析。A，gLN中RORγt+ Treg(CD25+Foxp3+)细胞的频率。B，gLN中Th17(RORγt+Foxp3−)细胞的频率。C-D，使用FlowSOM聚类算法分析肺部的非适应性免疫细胞群(CD45+CD3−CD19−)。从每个设施n = 8只小鼠中共分析了128,000个细胞。FlowSOM生成了10个具有独特表型的簇。E，基于手动门控的肺部NK细胞频率(NK1.1+lineage-)。F，肺部中性粒细胞频率(Ly6G+CD11b+lineage-)。P值来自t检验，表示为P < 0.05 (*)、P < 0.01 (**)、P < 0.001 (***)。  

7 在BLM诱导的肺损伤反应期间，设施B小鼠的中性粒细胞募集到肺部的能力更强

为了研究BLM期间的细胞反应在两个设施中饲养的动物之间是否不同，我们在BLM给药后3天对小鼠的肺进行了免疫表型分析。设施B小鼠对BLM处理更敏感，并在损伤的急性期向肺部募集更多中性粒细胞，尽管设施B中PBS处理的对照小鼠维持中性粒细胞水平低于设施A对照小鼠(图6A)。在BLM处理后第3天，设施B小鼠的肺中性粒细胞在BLM处理后增加了1.5倍以上，而设施A小鼠几乎没有变化(图6B)。到BLM处理后第6天，在两个饲养设施中的小鼠肺部募集了相似水平的中性粒细胞。肺切片的组织病理学分析表明，两种设施中BLM处理的小鼠肺均有类似所述的斑块状中性粒细胞性肺泡炎(附加文件1：图S6)。因此，稳态时中性粒细胞数量的增加可能会对BLM诱导的体重减轻提供保护，而在BLM反应期间中性粒细胞快速增加是有害的。

图6 肺损伤期间中性粒细胞向肺部的募集相对增加与设施B中小鼠的体重减轻更严重相吻合。在博莱霉素(1 U /kg)或PBS(赋形剂对照)处理后，从两个设施中的常规ex-GF初代的后代中采集肺。A，BLM处理后第3天肺部中性粒细胞的归一化频率。B，与每个设施中的PBS处理相比，博莱霉素处理后3天肺部中性粒细胞积聚的倍数变化。P值表示为P < 0.05 (*)、P < 0.01 (**)、P < 0.001 (***)。  

讨论

本研究表明，共生粪便微生物群的组成会影响BLM诱导的C57BL/6小鼠体重减轻的严重程度。使用两个动物饲养设施中保存的各种小鼠品系，我们观察到与另一个设施(设施A)中的小鼠相比，BLM处理的WT同窝对照小鼠在一个设施(设施B)中具有惊人的高死亡率。我们确定，基于小鼠出生和成长的饲养设施，WT小鼠保持了不同的肠道微生物群落，尽管两个设施具有相同的SPF方案。此外，与设施A小鼠相比，设施B中未受干扰的WT小鼠具有较低的Th17和中性粒细胞水平。在BLM处理期间，设施B小鼠的肺部中性粒细胞增加倍数更大，表明炎症反应更严重。我们证明BLM高度易感表型可通过粪便微生物群转移。当这两个微生物群落结合时，与设施B相关的微生物群会发挥显性负效应。我们确定Helicobacter和Desulfovibrio的成员作为候选微生物，它们有助于增加对BLM诱导的体重减轻的易感性。 虽然最初观察的是两个设施中不同B6菌株的存活差异，但微生物群对基因相同的动物及其后代的影响在很大程度上取决于体重减轻的程度，而不是存活的程度。体重减轻和生存率直接相关，因为在我们的生存研究中，动物死亡主要是由于体重减轻过多。常规化GF小鼠及其SPF后代中不太显著的表型可能归因于本研究多年来微生物群组成的变化。这两个设施都保持为I级屏障，需要持续监测病原体、个人防护设备和生物安全柜的使用情况。由于这些设施没有分级进入限制，某些类群的相对丰度可能会随着时间的推移而发生变化。因此，我们通过在三个不同时间段收集的三组独立粪便微生物组测序数据中识别两个设施之间的一致差异，确定了BLM处理期间体重调节的候选微生物。值得注意的是，Desulfovibrio和Helicobacter始终被排除在设施A之外，并且在过去几年的研究期间，它们在设施B中的存在始终与BLM处理后体重减轻加重相关。

本研究的数据表明，在肺损伤反应中，Desulfovibrio sp.和一些Helicobacter物种具有潜在的促炎作用。Desulfovibriosp.是脱硫弧菌属中的一个未知种，是一组存在于包括人类在内的许多动物胃肠道中的硫酸盐还原细菌。人们对这种共生物种知之甚少，但最近发现其他相关的Desulfovibrio物种与罕见的菌血症病例有关。另一方面，H. hepaticus的免疫影响在肠道健康和疾病方面已有详细记录。H. hepaticus是一种致病菌，仅在特定的微生物环境中才能在Il10缺陷小鼠中引起结肠炎。有趣的是，在小鼠Mycobacterium tuberculosis感染后，肠道定植H. hepaticus已被证明会促进持续性肺损伤，这表明H. hepaticus和宿主免疫系统之间的相互作用可以调节肺部的免疫反应。为了支持这一观点，我们发现在存在Helicobacter的设施B中，naïve小鼠的gLN中RORγt+ Treg细胞的比例增加。此外，基线时BLM高度易感动物的肺和脾脏中中性粒细胞的相对比例均降低。通过G-CSF的IL-17A信号转导是粒细胞生成和中性粒细胞募集的关键介质，RORγt+ Treg细胞可以特异性抑制分泌IL-17A的Th17细胞。因此，我们在稳态状态下的BLM高度易感动物中观察到的中性粒细胞系统性减少可以通过Th17特异性免疫调节细胞的扩增来解释。 在BLM高度易感小鼠体内稳态中Th17-中性粒细胞轴减少的含义令人费解。ALI期间活化的中性粒细胞通过释放促炎细胞因子和细胞毒性产物(包括颗粒酶、活性氧物种和中性粒细胞胞外陷阱)发挥致病作用。我们发现设施A小鼠的肺部中性粒细胞没有增加，而设施B小鼠在BLM处理后仅3天肺部中性粒细胞增加1.5倍以上，这与中性粒细胞在肺损伤中的已知作用一致。然而，设施B小鼠在基线和气管内PBS赋形剂处理期间，肺部中性粒细胞比例相对较小。我们假设体内平衡时增加的中性粒细胞可能具有保护作用，并且肠道微生物群可能在稳态调节中性粒细胞。已有研究表明，稳态期间的粒细胞生成水平受微生物群的影响。此外，一些肠道共生菌可以促进肺部中性粒细胞表型的变化，以防止肺部感染。因此，虽然中性粒细胞的潜在保护作用所涉及的机制仍不清楚，但肠道微生物群可能调节粒细胞生成和中性粒细胞功能。 粪便微生物群移植对肺部的影响可能是全身性的，也可能是肺部特异性的。由于我们转移了全部粪便内容物，因此效果可能是全身性的，部分原因是浆液中存在一些代谢物和其他分泌因子。例如，已知称为短链脂肪酸(SCFA)的细菌代谢物可维持上皮屏障的完整性并防止肺部发生过敏性炎症。此外，粪便分泌型IgA(sIgA)的水平可由肠道中Sutterella属微生物调节，它决定了葡聚糖硫酸钠诱导的肠道损伤的严重程度。这些循环中的分泌因子可能影响全身结构细胞的健康，包括肺部。另一方面，肠道微生物群的扰动可能通过肠-肺轴影响肺部。肠道微生物组组成与呼吸道疾病发展之间的相关性支持了两个器官之间存在串扰的观点。肠道和肺部的微生物群落从胚胎发育时期起就在健康和疾病方面表现出相互关联。此外，在脓毒症实验模型和机械通气患者的研究中，一些肠道微生物大量存在于肺部，并且与ALI/ARDS的严重程度或发展相关。最后，虽然我们通过灌胃将粪便微生物群直接输送到肠道，但我们不能排除通过供体微生物群的易位和吸入将肠道微生物引入肺部的可能性。

可能解释两种饲养设施之间整体微生物群落结构差异的一个因素是，小鼠的标准饲粮不同。这种饲粮差异在本研究之前就已经存在，因此，这可能是我们的研究结果的一部分。设施B中的BLM高度易感小鼠在其整个生命周期(包括胎儿发育期间)都使用Teklad Global 18%蛋白质啮齿动物饮食(2918，Harlan-Envigo)。然而，设施A中采用高脂肪饮食，所有其他小鼠在断奶后均给予NIH-31改良开放式配方(7913, Harlan-Envigo)。标准非高脂肪饮食2918和7913均由相似的常量营养素组成并经过辐照。两种饮食的区别在于7913饲粮(设施A)包含磨碎的燕麦、鱼粉和脱水苜蓿粉，而2918饲粮(设备B)含有L-赖氨酸和DL-甲硫氨酸。虽然饮食不会成为新共生物种的来源，但成分的细微差异可以选择特定的分类群，并有助于维持两个设施之间独特的微生物群落。 本研究结果支持微生物群在控制BLM诱导的损伤反应中的作用。值得注意的是，肠道微生物群对BLM反应的影响似乎在BLM治疗的急性期最为显著，而之前的一项研究表明，肠道微生物群的特异性消耗对BLM诱导的肺纤维化的发展影响微乎其微。我们证明在肺损伤反应研究期间需要控制小鼠微生物群中变形菌的存在。

值得注意的是，除非特别要求，H. hepaticus和Desulfovibrio不属于无特定病原体设施和供应商的排除病原体。本研究强调了报告实验动物共生微生物群落组成的必要性，以提高跨机构使用BLM模型进行研究的可重复性。我们的数据还影响了BLM在癌症患者中的潜在应用，因为它是一种有效的化学疗法，但由于罕见但严重的副作用(包括肺部肺炎和纤维化)而很少使用。由于癌症患者肺部并发症的发展也是不可预测的，因此了解每位患者的微生物组是否会影响他们患肺炎的几率可能会影响临床决策。