噬菌体展示和其他肽展示技术

01 内容摘要  

自从100多年前噬菌体被发现以来，它们在基础和应用生命科学中得到了广泛的应用，噬菌体展示技术即基于噬菌体病毒粒子展示表面肽序列。噬菌体展示系统的改进使我们能够在生物技术的许多领域采用这种方法，包括免疫学和生物医学应用，新材料的形成等。噬菌体展示平台的重要性得到了认可，并于2018年授予诺贝尔奖“肽和抗体的噬菌体展示”。

这篇综述概述了Phage display这项技术，包括各种显示系统的比较，它们的优缺点，以及在科学，医学和广义生物技术各个领域的应用示例。还讨论了其他肽显示技术，这些技术采用细菌，酵母和哺乳动物细胞，以及真核病毒和无细胞系统。这些强大的方法仍在开发和改进中；基于噬菌体展示和其他肽展示系统的新型精密工具不断涌现，预计在不久的将来会出现解决各种科学、医学和技术问题的新机会。

02 主要内容      

1、M13噬菌体病毒粒子结构及噬菌体展示技术原理

M13噬菌体属于丝状噬菌体家族。

它有一个单链DNA基因组，它的衣壳由五种不同的蛋白质组成。“Classical”典型噬菌体展示是基于噬菌体基因组修饰，包括在编码衣壳蛋白的基因中插入一个外源序列。因此，噬菌体病毒粒子在其表面呈现异源肽/蛋白。

2、M13基因组

M13噬菌体的基因组包含11个基因，根据编码的蛋白质功能可分为三个不同的组：衣壳结构（基因III、VI、VII、VIII、IX）、DNA复制（基因II、V、X）和噬菌体组装（基因I、IV、XI）

3、M13噬菌体pIII蛋白的结构

pIII蛋白包含两个N端结构域N1和N2，与G1连接子相连，以及C端结构域CT。N端和C端域与G2 linker相连。

4、主要噬菌体展示格式Major phage display formats.

根据Smith的分类，噬菌体展示格式有六种类型。

Type 3是一种展示载体系统，指的是天然丝状噬菌体基因组natural filamentous phage genome，由ssDNA载体类型表示。在3型载体中，插入基因编码的插入物导致融合蛋白/肽在所有5个pIII蛋白拷贝中显示。同样，8型显示导致在每个产生的pVIII蛋白中展示外源肽。3型和8型之间的主要区别是显示肽的拷贝数，3型最多5个，8型最多可达2700个。33型的特点是存在两种类型的plll蛋白，野生型和重组型，因为噬菌体基因组中存在两个不同的相应基因副本。由于野生型pll具有与噬菌体相关的功能，且不与任何肽相连，因此只有部分表达的pll分子与外来肽/蛋白融合。与3型载体相比，33型载体能够显示更长的多肽(蛋白质或抗体片段)，但价显著降低。88型向量也是如此。综上所述，3、8、33和88型基于天然噬菌体载体，允许多价噬菌体展示，其中外源分子/肽连接到噬菌体外壳蛋白的所有copy(主要是pIII和pVIII，但有时也使用pVI、pVII、pIX)，a phage vector的基因组包含单个重组外壳蛋白基因。

Phage vectors是早期噬菌体展示实验中最早使用的平台，通常它们更容易使用。然而，这种类型的载体存在一些缺陷，例如由于外源肽融合而导致的plll传染性损失(pIII infectivity loss)。此外，Phage vector的多价展示更容易得到亲和力较低的结合子。为了解决这些问题，开发了允许单价显示（monovalent）的phagemids(hybrids of phage and plasmid vector，代表3 +3和88型)。与33型或88型类似，3 + 3型和8 + 8型有两个plll或pVIII基因Copy，尽管它们位于不同的复制子上。具有外源序列的plll或pVIII基因的重组形式位于phagemid genome中，而野生型基因存在于phage genome中，被称为辅助基因。

5、噬菌体载体和噬菌粒的比较

Comparison of a phage vector and a phagemid

噬菌体载体（phage vector）与噬菌粒（phagemid）的主要区别是展示价(display valency)。如果噬菌体载体phage vector只包含一个编码显示衣壳蛋白的重组基因的copy，所得到的噬菌体展示总是多价的polyvalent。

反过来，phagemid噬菌粒的使用会产生低价lower valency展示(在pIII的情况下大多是单价的monovalent)，因为辅助噬菌体(Helper phage)提供了外壳蛋白的wild-type copy，通常比重组蛋白的表达效率更高。

The recombinant form of the pIII or pVIII gene with foreign sequences for display is located in thephagemid genome, while the wild-type gene is present in the phage genome and called the helper. Specifically, phagemids are designed to contain the origin of replication for both the M13 phage and the E. coli plasmid in addition to gene III or VIII, an antibiotic-resistance gene and relevant multiple cloning sites

6、间接pIII显示

使用的真核基因片段编码的Jun和Fos蛋白展示

7、landscape phages。不同的“‘landscapes”的肽展示在噬菌体表面

The idea of landscape phages. Different ‘landscapes’ of peptides displayed on phage surface are presented.

8、Selectively infective phage (SIP).选择性感染噬菌体

(A)Si技术中，展示的肽蛋白融合到pIII蛋白的C端结构域，而配体融合到其负责噬菌体侵染的N端结构域。

(B)适配分子可以作为噬菌体基因组编码分子(顺式in cis)或噬菌体编码分子或在体外(反式 in trans)提供。

9、Delayed infectivity panning (DIP) procedure

延迟侵染筛选(DiP)程序。该过程分为五个步骤，包括噬菌体与细菌细胞表面的结合，清洗未吸附的噬菌体，温度变化，侵染，以及分离和分析得到的噬菌体。

10、用于噬菌体展示的噬菌体类型。

除了M3噬菌体属于丝状噬菌体家族外，噬菌体展示还可以基于尾部噬菌体，如T7、T4和，以及较小的ssRNA二十面体噬菌体，Qß和Ms2。

用于显示肽蛋白的主要衣壳蛋白用箭头表示。

11、表面展示系统的类型。

主要是基于病毒表面，细胞表面 和无细胞展示（cell-free）这3个系统。

12、基于噬菌体和辅助噬菌体M3 pIII展示的文库制备和生物筛选程序

构成目标展示肽/蛋白质基础的DNA序列主要克隆到噬菌粒载体（phagemid vector）上。转化大肠杆菌感受态细胞产生噬菌体库（phagemid library），辅助噬菌体感染后产生噬菌体展示库（phage display library）。该库针对先前固定的靶标进行亲和筛选。清洗步骤需要去除未结合的噬菌体。洗涤后，与目标相互作用的噬菌体在大肠杆菌中被洗脱和扩增。整个循环重复几次(通常是3-5次)，以选择特异性结合的序列。在连续几轮的生物筛选后，对获得的序列进行功能分析。

03 小结    

30多年前引入的噬菌体展示技术为噬菌体表面暴露多肽提供了极好的工具。尽管有许多噬菌体显示系统可用，并且有成千上万的文章描述了该技术的具体应用，但仍然需要新的和改进的噬菌体显示平台，并且进一步研究噬菌体的实际使用，将肽暴露在其表面，将在科学和医学的各个领域带来许多新的迷人的发现。    

文献来源：Jaroszewicz W, Morcinek-Orłowska J, Pierzynowska K, Gaffke L, Węgrzyn G. Phage display and other peptide display technologies. FEMS Microbiol Rev. 2022;46(2):fuab052. doi:10.1093/femsre/fuab052.

编辑人：Transparent

来源：医药速览 2023-03-05