科研丨Microbiome: 多组学分析揭示1型糖尿病患者口腔微生物群的变化及其对肠道菌群的影响

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

肠道微生物组的改变与多种慢性疾病有关。然而，这些变化的驱动因素在很大程度上仍然未知。口腔是暴露于包括病原体在内的外源性因素的主要途径，其中的过程可能影响胃肠道后续隔室中的群落。本研究对来自8个多发1型糖尿病(T1DM)家族的35个个体的配对唾液和粪便样本进行了菌株解析、整合宏基因组、宏转录组和宏蛋白质组分析。结果发现了不同的口腔微生物群，主要反映了链球菌物种之间的竞争。具体而言，发现T1DM患者口腔中唾液共生链球菌的丰度降低，这与其与致病性变形链球菌的明显竞争有关。口腔中唾液链球菌的减少也与肠道中唾液链球菌减少以及兼性厌氧菌(包括肠杆菌)的高丰度有关。此外，发现T1DM中肠道炎症的证据，这反映在肠杆菌的表达谱以及人类肠道蛋白质组中。最后，可以在个体组学水平上追踪从口腔到肠道的转移菌株变体，不仅突出了转移，而且突出了沿着胃肠道传播的分类群的活动。综上所述，T1DM背景下口腔微生物组的改变影响下肠道的微生物群落，特别是通过减少唾液链球菌的“口腔-肠道”转移。本研究结果表明，观察到的口腔驱动的肠道微生物组变化可能有助于T1DM中的炎症过程。通过整合多组学分析，解决了疾病背景下的菌株变异“口腔-肠道”转移。

论文ID

原名：Alterations of oral microbiota and impact on the gut microbiome in type 1 diabetes mellitus revealed by integrated multi-omic analyses

译名：综合多组学分析揭示1型糖尿病患者口腔微生物群的变化及其对肠道微生物群的影响

期刊：Microbiome

IF：16.837

发表时间：2022.12

通讯作者：B. J. Kunath，P. Wilmes

通讯作者单位：卢森堡系统生物医学中心；卢森堡大学

DOI号：10.1186/s40168-022-01435-4

实验设计

结果与讨论

1、研究描述

在这项研究中，对8个家族进行了多组学口腔和肠道微生物组研究，每个家族至少有两个T1DM病例(图1A)。这扩展了以往专注于数据子集的研究。本工作还包括所有参与者口腔的宏基因组(MG)和宏转录组(MT)分析。总共分析了来自35名多次就诊患者的84份粪便和76份唾液样本。生成了84份粪便和74份唾液的MG数据、64份粪便和71份唾液的MT数据以及71份粪便样本的MP数据(表1)。35名患者中，17名为T1DM患者，18名为健康家庭成员(图1A)。总共获得了653.4 Gbp的DNA测序数据、870.6 Gbps的RNA测序数据和13,833,325个碎片离子光谱。

在所有样本中，MG的每个样本的DNA和RNA测序数据平均为4.2±0.9 Gbp，MT的每个样本平均为6.3±1.6 Gbp。肠道数据包括4.2±0.8 Gbp的MG和5.6±1.1 Gbp的MT测序数据，口腔数据包括4.2±0.9 Gbp的MG和7.0±1.6 Gbp的MT测序数据。对于粪便样本，平均进行了95000±59000次MS2扫描，并鉴定了4500±3400个蛋白质。对于01–04家族的样本，平均获得63000±4700个碎片离子扫描。数据库搜索结果平均为1500±300个蛋白质。对来自家族05、06、08和11的样品进行了平均203000±11800次碎片离子扫描，可鉴定出8000±1600个蛋白质。有关详细统计信息，请参见补充表1。在本研究中，我们结合了来自三个组的信息，以识别和追踪两个身体部位的菌株变异。为了做到这一点，不同组体之间的重叠必须最大化，以保持所有样本的特异性。因此，使用了样本特异性组装的完整contigs集，而不是仅覆盖所有多组学数据子集的宏基因组组装基因组(图1B)。

图1

队列描述和研究工作流程概述。上图(A)显示了队列中具有家庭成员和疾病状况的不同个体。下图(B)描述了综合多组学分析工作流程，以处理、整合和分析唾液和粪便样本的宏基因组(MG)、宏转录组(MT)和宏蛋白质组(MP)数据。

表1 多组学研究数据概述。

MG，宏基因组学；MT，宏转录组学；MP，宏蛋白质组学。

2、T1DM和健康对照组之间的总体微生物群落结构没有显著差异

使用MG数据比较了T1DM患者和对照组两个身体部位的群落结构。总体而言，健康个体肠道中检测到的总物种数量变化更大，但在丰富度方面没有显著差异(MWW:p val 0.72，补充图1A)，也没有观察到Simpson多样性指数(MWW:p val 0.53，补充图1B)的显著差异。β多样性根据家族成员而显著不同，但T1DM患者和对照组之间没有差异(dbRDA的ANOVA；p vals 0.001(家族)，0.11(病情)；R2 0.49；补充图1C)。

口腔微生物群在物种丰富度(MWW:p val 0.48，补充图1A)和Simpson多样性指数(MWW:pval 0.90，补充图1B)方面没有显著差异。与肠道一样，T1DM的β多样性没有显著差异，但家族成员有差异(dbRDA的ANOVA，p vals 0.5(病情)，0.003(家族)；R2 0.37；补充图1C)。因此，对于两个身体部位，没有证据表明T1DM对总体微生物群落多样性有显著影响。如前所示，口腔群落组成的显著差异可能与家庭成员有关。

3、T1DM患者口腔的酸化会影响特定的分类群，并破坏链球菌物种之间的平衡

链球菌是口腔的主要殖民者，是口腔稳态和疾病的关键参与者。在健康受试者中，机会病原体(例如变形链球菌或肺炎链球菌)和非致病性共生物种(如S. salivarius、S. parasanguinis或S. mitis)的丰度之间存在平衡，它们通过不同的机制(如酸或碱的产生或细菌素的分泌)相互竞争。

在本研究中，与对照组相比，T1DM患者口腔中几种链球菌的丰度有所不同。特别是在MG水平上，我们观察到链球菌物种之间的高度可变性(图2)。这种变异性与先前的研究结果一致，根据研究发现T1DM中不同链球菌种类的数量增加或减少。例如，对两个身体部位进行的基于16S rRNA基因的研究观察到，T1DM患者口腔中链球菌属的丰度增加，但肠道中的链球菌减少。

据观察，耐酸但非致病性的副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)和密切相关的HMSC073D05链球菌的丰度增加(log2倍数变化分别为3.5和3.4；校正p值<0.05)。相比之下，T1DM中共生和不耐酸的唾液链球菌的丰度降低(log2倍数变化−3.5；校正p＜0.05)。此外，我们观察到T1DM患者口腔中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的丰度降低。牙龈卟啉单胞菌通常与营养不良状态有关，但也已知在酸性条件下无法生长。总之，这些结果表明T1DM患者的微生物分布与酸化腔相对应。

宏转录组数据提供了进一步的证据，该数据显示致病性变形链球菌的活性显著增加(log2倍数变化11.3；校正p值<0.05)，而其他链球菌，尤其是唾液链球菌/S sp.CCH8-H5(log2倍数变化−13.3，校正p值<0.05)活性较低(图2)。变形链球菌是与牙周病相关的口腔常见病原体，以其耐酸性和嗜酸性而闻名，这导致T1D患者口腔的进一步微生物酸化。

为了更好地理解口腔微生物群中的潜在模式，我们研究了表达基因与发现具有差异活性的分类群的相关性。我们观察到变形链球菌和两种与密切相关物种之间的细菌竞争相关的特异性表达转录物，即细菌素IIc和pre-毒素TG，它们是结核菌素的组成结构域(图2-网络分析和补充图2)。这种肽毒素是一种以链球菌属为特征的环状细菌素，具有广谱抑制活性，包括大多数链球菌，但S. rattus和变形链球菌除外。未发现相应的基因表达与特定物种相关。然而，变形链球菌对该毒素具有耐药性的事实以及变形链球菌与该毒素的两种转录物密切相关的观察结果支持了我们的假设，即变形链球菌对细菌素的表达负责。根据本研究的数据，T1DM患者的口腔酸化最初是由于宿主的病理生理学，导致不耐受酸的细菌数量减少，并有利于耐酸致病性变形链球菌的生长，进而进一步酸化环境，并通过表达靶向特异性细菌素而击败共生的唾液链球菌。

图2

T1DM患者口腔微生物组中分类单元解析的差异丰度和基因表达。火山图分别显示了使用宏基因组和宏转录组数据的T1DM与健康个体在丰度(三角形)和表达(圆形)方面的差异。最小log2倍数变化为5(垂直虚线)，调整后的p值为0.01(水平虚线)(红点)。满足倍数变化阈值但不满足调整后p值阈值的Taxa显示为绿色。右上方的插入图显示了补充图2的一个子集，并强调了变形链球菌活性与靶向特异性细菌素表达之间的相关性。

4、肠道中唾液链球菌丰度降低，有利于炎症环境和肠道细菌的繁殖

肠道衍生的多组学数据的差异丰度分析表明，不同条件之间差异不大。肠道中唾液链球菌的较低丰度符合我们在口腔中观察到的趋势(补充表2)。唾液链球菌在成年人的肠道内定植，通过抗炎作用以及防止病原体的繁殖，有助于肠道内稳态。先前的研究表明，从口腔分离的唾液链球菌菌株能够通过显著降低肠上皮细胞和免疫细胞系中NF-κB的激活和IL-8的分泌来预防体外和体内炎症反应。因此，唾液链球菌数量的减少可能会导致肠道环境发炎加重。

本研究还观察到肠道中大肠杆菌(肠杆菌)的丰度增加(补充表2)。肠杆菌是最常见的过度生长的潜在病原体之一，其扩张与许多疾病，特别是炎症有关。通过研究肠道中的基因表达，我们发现与健康对照相比，T1DM中存在多个差异表达基因(图3)。值得注意的是，大多数过度表达的基因与肠杆菌有关，这表明T1DM患者中该种群具有很强的活性。由于它们的兼性厌氧代谢，通常在肠道粘膜上皮附近低丰度存在。众所周知，肠杆菌在许多涉及炎症的条件下都能生长。鉴定的过表达基因有助于细菌毒力、氧化应激反应、细胞运动和生物膜形成，以及一般的复制和生长。值得注意的是，发现了过氧化氢酶过氧化物酶的上调，这种酶可以解毒活性氧中间产物(如H2O2)，因此参与保护宿主免受氧化应激。与生物膜形成相关的酶(YliH)也过表达。最后，还鉴定出了OmpA样跨膜结构域以及蛋白HokC/D，其对应于大肠杆菌毒素抗毒素系统，该系统确保相关质粒的传递。

肠道内由炎症引起的肠杆菌大量繁殖有多种可能的机制。其中一种依赖于炎症宿主反应，该反应产生一种有效的抗菌剂(过氧亚硝酸盐)，这种抗菌剂很快转化为硝酸盐，然后可以通过硝酸盐呼吸用于细菌生长。由于肠道中编码硝酸还原酶的基因主要由肠杆菌编码，这种富含硝酸盐的环境为肠杆菌(如大肠杆菌)提供了生长优势。除了参与氧化应激的基因外，我们还发现钼蛋白氧化还原酶4Fe-4S结构域在T1DM中过表达(图3和补充表3)。该结构域存在于许多还原酶/脱氢酶家族中，尤其是大肠杆菌中的呼吸硝酸还原酶，这进一步支持了我们关于T1DM背景下肠道炎症的假设。此前已部分观察到T1DM中肠杆菌的丰度增加，但信号不一定清楚，或与抗生素诱导的T1DM加速等混杂因素相关，未发现功能证据。

此外，还研究了T1DM对肠道中人类蛋白质丰度的影响。我们假设肠道炎症会导致参与宿主免疫反应的蛋白质的丰度更高。有趣的是，我们发现外分泌胰腺功能不全的证据大多与几种蛋白酶有关，如胰腺羧肽酶、弹性蛋白酶或胰蛋白酶相关酶在T1DM中含量较低(图4和补充表4)，这可能与T1DM有关。在T1DM中发现一种参与宿主免疫反应的蛋白质，即聚合免疫球蛋白受体(pIgR)，在T1DM中被发现水平升高(log2倍数变化0.42，p值<0.05)(图4和补充表4)。pIgR是一种由上皮细胞表达的跨膜蛋白，负责将浆细胞在粘膜中分泌的聚合IgA经胞吞转运至肠腔。聚合IgA与微生物表面的结合通过防止附着到上皮细胞来保护肠粘膜，从而抑制感染和定植。当将所有访视视为独立样本来观察差异表达的蛋白质时，我们发现使用中值信息时蛋白质相似，但也有一些与宿主免疫反应和炎症相关的额外蛋白质在T1DM中表达更多(补充图3和补充表5)。虽然该方法在静态上不太稳健，但它可以观察数据集中的其他趋势。值得注意的是，我们发现了更高水平的脂质运载蛋白2酶(LCN2)(log2倍数变化0.37，p值<0.05)，这是人类炎症疾病的典型生物标志物，并与代谢紊乱(如肥胖和糖尿病)相关。分析还证实了乳转铁蛋白(LTF)的较高表达(log2倍数变化0.76，p值<0.05)，这在我们之前的研究中已经发现。LTF在先天免疫和胰岛素功能中发挥作用，其抗菌活性可影响胃肠道微生物群。

图3

T1DM患者肠道内差异基因表达分析。使用宏转录组数据的表达差异显示在火山图上。仅满足倍数变化或调整后的p值阈值的函数分别以绿色和蓝色显示。菱形和圆形分别表示来自Pfam和KEGG数据库的补充注释。与肠杆菌相关的基因用粉红色标记。

图4

T1DM中的人类蛋白质组差异。热图显示了T1DM与健康个体的差异分析中具有最高显著性的人类蛋白质的相对丰度(未经校正的p值<0.05)。健康个体和T1DM患者分别显示在橙色和蓝色框中。

5、多组学整合突出了细菌从口腔到肠道的转移和活性

由于口腔和肠道中唾液链球菌的丰度较低，我们试图探索胃肠道两端之间的传播，并评估队列中的转移水平。为此，我们在口腔和肠道的reads支持下识别并跟踪基因组变异。与之前仅使用基于MG的应变变异来观察传播的研究不同，我们还利用了MT和/或MP数据，不仅识别了转移的应变变异，还识别了功能活性应变变异。此外，虽然MG和MT分析基于测序，但宏蛋白质组学提供了一个基于肽和质谱分析的独立信息层。这提供了通过识别具有变异氨基酸序列的翻译蛋白来强有力地验证已识别的转移错义变异的机会。首先使用所有基因组变异(同义和错义)以及口腔和肠道的read支持，确定了我们大多数队列中要转移的普雷沃氏菌属和拟杆菌属，并在肠道MT水平上具有活性(图5A)。普雷沃氏菌属在口腔中相对常见和丰富，但在肠道中不太常见。因此，发现它被转移和激活并不奇怪。相比之下，虽然拟杆菌属在肠道中非常丰富，但在口腔中很少发现。事实上，在我们的研究中，从拟杆菌中观察到的信号主要来自少数特定个体，并不代表整个队列。

值得注意的是，我们在MP水平上鉴定了几种支持菌株变体的肽(图5B)，表明我们可以跟踪并验证所有三个原子层的变体。尽管变体支持肽的数量相对较低，但它们的鉴定证实了我们发现的从口腔转移的分类群在肠道中也是活跃的。属于拟杆菌属的菌株变体在变体肽水平上不再被鉴定，这可以通过鉴定拟杆菌的样本数量少来解释。更令人惊讶的是，没有使用MT支持的变体的链球菌属，但其存在于MP水平。这表明，属于链球菌属的菌株变体在MT水平上的代表性太低，而在MP水平上则不足以超过其各自的阈值。此外，已知链球菌栖息在肠道的上部(小肠)而不是下部(结肠)。由于RNA转录物不如蛋白质稳定，因此只有肽可以从上消化道中活跃的分类群中识别出来并不奇怪。因此，我们假设所应用的严格MT读取丰度阈值可能过于严格，无法识别肠道上部活跃的转移细菌，MP支持将更合适。为了验证这一点，使用了只有MG read支持的错义变异，并进行了包括新蛋白变体在内的宏基因组搜索。区分了来自口腔的MG和来自肠道的MG和MT支持的变体(称为MG-MT支持的变体)，以及来自口腔的仅由MG支持的变体和来自肠的MG(称为仅由MG支持的变体)。这两种类型的变体都可以在MP水平得到进一步支持(图5B，D)。

通过仅应用MG支持标准，在81个样本中发现了大约10倍多的变体，包括Alistipes、双歧杆菌和Faecaliberium在内的其他属被鉴定为转移。除了Faecalibacterium，所有这些分类群通常都在两个身体部位发现。如所假设的，现在在MG水平上发现了属于链球菌属的菌株变体(图5C)。添加MP层显著证实了链球菌菌株变体的存在和活性，而未发现Alistipes属和Faecalibacterium属(最初未被MG-MT变体发现)的链球菌菌株变体(图5D)。因此，宏蛋白质组学基本上支持并验证了通过其他组学检测到的变体，这是由于蛋白质的更高稳定性或宏蛋白组学的不同和独立技术(例如，它不会遭遇测序错误)。此外，由于蛋白质具有免疫原性，使用宏蛋白质组学检测菌株变体肽增加了一层有价值的信息，因为来自口腔的蛋白质可能会引发大肠炎症。

图5

在多个组中鉴定了属的变异。该图显示了与分类群相关的每组变异的宏基因组(MG)和宏转录组(MT)丰度的reads分布，以及宏蛋白质组(MP)丰度的谱。每个方框上方的数字表示已识别的变异数量、已识别变异的样本数量以及每个样本的变异中值。A和B对应于MG‑MT支持的变体，而C和D显示仅MG支持的变体。还对分布进行了比较，用浅橙色(健康对照组)和浅蓝色方框(T1DM患者)表示。

6、与健康对照组相比，链球菌在T1DM中传播较少

识别和跟踪所有组层和两个身体部位的变体，使我们能够评估不同已识别分类群的转移水平。在TIDM患者的口腔和肠道中，唾液链球菌的含量和活性都较低。虽然差异不显著，但在链球菌属的转移水平上可以观察到类似的趋势。不仅在仅MG水平上链球菌似乎转移较少(图5C)，这一趋势似乎进一步得到了较低量肽的支持，因此，使用MG-MT支持的变体和仅MG支持的变体，在宏蛋白质组学水平上与链球菌相关的活性较低(图5B，D)。这表明口腔和肠道中唾液链球菌丰度较低可能确实存在关联。然而，由于所采用的方法缺乏分类学分辨率，因此无法得出有力的结论。进一步的分析应使用所有样本的通用组件，并在物种水平上完全解析，以验证我们的发现。

7、传播水平与肠道中的类群丰度密切相关，但与口腔中的类群数量无关

通过对转移细菌MG和MT水平与口腔和肠道中的丰度进行相关性分析，验证胃肠道两端的类群丰度是否相关。转移细菌的丰度(MG和MG_Only)与其在肠道中的丰度之间存在强正相关(p值<0.05时，rs=0.6–0.7)，这表明转移水平确实影响肠道中分类群的最终丰度(图6)。活性(MT)也呈正相关，但值较低(p值<0.05时，rs=0.4–0.5)。有趣的是，在分类群的口腔MG丰度与其转移水平之间没有发现相关性(补充图4)，这与我们先前研究中发现的相关性一致。这表明，转移率不仅仅取决于口腔中分类群的原始丰度，而是由其他参数驱动的。例如，口腔的宿主生理学(唾液流速、葡萄糖浓度、pH)可能会影响胃肠道的传播水平以及微生物生理(例如低pH和胆汁酸耐受性)。因此，我们研究了转移水平与可用元数据之间的相关性，但没有发现强烈的显著相关性(补充图补充数据1)。

图6

转移分类群丰度与肠道丰度之间的相关性。该图显示了转移与肠道丰度之间的相关性。具有MG或MT标记的分类群的丰度对应于在宏基因组和宏转录组水平上支持的变体的丰度。彩色值表示正(蓝色)或负(红色)显著相关性(校正p值<0.05)。白色背景值表示相关性不显著。

结论

本研究观察了胃肠道、口腔和肠道两个极端的两个重要身体部位的微生物群，并在家族性T1DM病例研究中确定了组成、功能和细菌类群转移的差异。在T1DM患者的口腔中，不同类群的丰度强烈类似于酸化腔。值得注意的是，我们发现共生酸不耐受的唾液链球菌的丰度和活性较低，而耐酸的致病性变形链球菌的活性较高，这与细菌素的表达另外相关，突出了两种链球菌之间的竞争(图2)。在肠道中，我们观察到唾液链球菌的丰度较低，大肠杆菌的丰度较高，与肠杆菌科相关的细菌毒力和氧化应激反应相关的基因表达总体增加(图3)。除了肠杆菌的丰度和活性增加外，还发现了T1DM中肠道炎症的进一步证据，这是通过几种参与宿主免疫反应或炎症的人类蛋白的过度表达(图4和补充图3)。

两个身体部位的多组学数据使我们第一次能够追踪所有三个组层的变体和分类群，从而识别出沿着胃肠道传播并在肠道中活跃的特定分类群。这加强了对传播变异的识别，并为口腔细菌的实际肠道定植提供了更多证据。发现了要传播的多个属，并强调了使用功能组支持来识别肠道中活跃的分类群的重要性(图5)。还讨论了宏转录组学固有的局限性，并强调了宏蛋白质组学如何能够有利地用于验证已识别的变体并探索肠道的上部。通过对T1DM患者口腔到肠道转移的相关信息进行背景分析，我们特别发现了T1DM患者中链球菌传播水平较低的趋势，从而强化了口腔和肠道中唾液链球菌丰度较低确实与T1DM相关的观点(图5B，D)。然而，分类群的传播水平与其在两个身体部位的丰度之间的相关性显示出与肠道(而非口腔)的强烈相关性(图6)。随着T1DM患者口腔生理学的改变，我们假设其中一些因素(例如唾液流速、葡萄糖浓度、pH值)对口腔微生物沿胃肠道的传播速率的影响可能比最初的丰度更强。后续研究可以将口腔的不同元数据测量与新开发的菌株变异方法相结合，并评估是否有任何生理参数影响特定变异的丰度及其沿胃肠道的传播率。