3D生物打印及疾病治疗应用

2022年11月底，OpenAI的CEO Altman 在推特上宣布：“今天我们推出了ChatGPT，尝试在这里与它交谈。”

短短几个月时间，ChatGPT席卷全球，日前用户数量已经突破1亿，每日咨询量超2亿多次，彻底引爆了人工智能产业。曾几何时，“3D生物打印”也是这样的光景，人们趋之若鹜，各界人士广泛关注。

今天我们就来看看曾经的“3D生物打印”，通过下面这篇文章了解一下，3D生物打印的材料、技术，以及它在疾病治疗中的应用前景。这篇文章题目为《3D生物打印在疾病治疗中的应用，Application of 3D bioprinting in the prevention and the therapy for human diseases》，发表于2021年，刊登在Nature旗下Signal Transduction and Targeted Therapy期刊上。

为了应对新型病原体和传染病、加速药物发现，人们利用先进技术开发新型治疗药物，寻找有效治疗方法。

3D生物打印就是其中之一，它包罗万象、功能多样，不仅能构建高度仿生的传染病体外模型，而且在制备疫苗、药物，以及相关递送系统方面也能发挥特殊优势。

01   3D生物打印材料  

在3D生物打印中，材料的研究重点在于是否具备良好的机械性能，如何提高材料适用性、粘度，实现快速交联，如何更好的模拟天然组织结构，为3D结构提供几何支撑。同时，在打印过程中，如何避免细胞受损。

1.生物墨水

生物墨水必须能在各种打印条件下通用，不会造成堵塞，确保3D结构稳定，保证每批产品的外形一致。常用的生物墨水材料有聚己内酯(PCL)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)及其衍生物。这类材料的生物相容性好，对细胞影响小，能为体外模型提供良好的物理支撑。

2.水凝胶生物墨水

水凝胶具有良好的可调节性、生物降解性和生物活性，能够提供一种天然的亲细胞微环境。

通常，用于生物墨水的水凝胶具备以下几个特征：适度的流动性，能快速固化，成型后有足够的完整性。在溶胶-凝胶转变过程中，溶液中的纤维可以通过外部刺激（如温度、光源或离子浓度）进行物理或化学交联，交联通过共价键发生，交联过程中不产生细胞毒性。

天然来源的水凝胶已广泛用作生物墨水，其中就有：藻酸盐、胶原蛋白、明胶、纤维素、丝素蛋白和脱细胞基质（dECM）。

02   3D生物打印技术  

目前，通过计算机辅助设计、计算机辅助制造，各种3D生物打印技术能够创建高仿真的、具备高级功能的3D结构组织。接下来，看看各种不同的生物打印技术和应用场景。

（图2：a:挤压，b:FRESH,c: 微流控芯片，d/e/f:LIFE/SLA/DLP,g:喷墨）

1.挤压生物打印

挤压生物打印，又叫挤出生物打印，是应用最广泛的一种3D生物打印技术。

它通过挤出生物墨水形成连续纤维来搭建结构，分为气动挤出式、活塞挤出式和螺旋挤出式三种（图2a）。这种打印方法的分辨率不高，约为200μm。

缺点是，当喷嘴挤压生物墨水时会产生剪切应力，造成细胞损伤和死亡。因此，打印时需要仔细调整压力、墨水粘度、喷嘴尺寸和形状等，以控制剪切应力参数，确保细胞活力。

另外，还有一种FRESH打印技术（或，悬浮水凝胶的自由形式可逆嵌入），它将低粘度生物墨水分配到颗粒凝胶浴槽中，3D打印和交联同时完成，加速墨水沉积（图2b）。FRESH 打印的分辨率更高，可以使用任何软凝胶生物材料进行生物打印，是目前组织工程师首选的生物打印方式，被广泛用于肌肉、心脏和血管等复杂几何组织构建。

2.光辅助打印

光辅助打印是利用光固化油墨的生物打印技术，主要有三种类型：LIFT、SLA和DLP（图2d/e/f）。

LIFT的优势是可以使用低粘度的生物墨水(1~300 mPa s)，不需要喷嘴，也无需光固化。缺点是当制造1cm3结构时，它需要1m2的供体基质。

SLA生物打印是一种典型的光辅助打印，运用逐层打印来创建3D结构。而DLP则使用计算机控制的动态反射镜阵列，来选择性地投影，同时与2D生物墨水交联。两种方法都可用于制造细微、复杂的几何结构，被广泛用于可灌注血管和毛细血管等亚微米组织的构建。

最近开发的立体光辅助打印技术，同时使用了三个激光束，加快了生物墨水光固化时间，将打印时间从几十秒缩短到几秒。

3.喷墨生物打印

它源自办公室喷墨打印技术，也是首个生物打印（图2g）。

喷墨生物打印分连续、按需两种打印方式，连续喷墨生物打印的分辨率为10至150μm，按需喷墨生物打印分辨率更高，通常为<30μm。

连续喷墨生物打印的液滴生成速度更快，但对导电墨水要求高，并有过程污染的风险。目前，更常用的是按需喷墨生物打印。

总的来说，喷墨生物打印的优势是成本低、分辨率高，缺点是生物墨水粘度范围有限(1~200 mPa s)，难以构建大体积的3D结构。

03   3D生物打印人体模型研究  

3D生物打印人体模型研究包括：类器官、基于软光刻的微流控器官芯片，以及体外模型。

1.类器官

目前，类器官在形态和功能上已经能够复制多种人体器官。

一些类器官能够识别细菌或病毒感染后的不同病理。有报告显示，近端气道类器官能够区分人类感染性流感病毒H7N9与禽流感病毒H7N2、猪感染性流感疫苗H1N1等病毒。

婴儿肺部类器官已经可以模拟婴儿和儿童常见的呼吸道病毒感染。因此，近年这些类器官被用到新冠肺炎的开发研究中。

2.微流体器官芯片

（图4：微流体芯片器官）

微流体器官芯片涵盖了微流体流动、动态机械运动、天然生理学，以及对组织间的相互作用的研究。

已有报道，Si等人利用微流体肺部芯片开展已有药物治疗流感和新冠肺炎的筛选，在备选的7种 SARS-CoV-2抑制剂中，发现阿莫地喹和托雷米芬两种药物能减少病毒影响。虽然尚未得到临床相关验证，至少可以证明该项技术可以用于新冠治疗的快速筛选。

3.体外模型

（图5：体外模型）

可用于传染病研究的体外模型，按照系统分为如下5类：接触异物的角膜和气道、神经系统、循环系统，以及肺、肝、肾和胰腺等静态系统和高通量筛选系统。

（1）接触异物的系统

Kim等人使用角膜衍生的脱细胞ECM打印了透明角膜基质组织（图5f/h），使用胶原纤维模拟天然角膜结构，构建出一种高度成熟、透明的角膜基质类似物。研究显示，将这种角膜基质组织植入体内4周后，胶原纤维产生了类似于人类角膜的晶格图案，且透明度更佳。

（2）神经系统

Joung等人通过挤压生物打印开发了一种生物工程脊髓（图5i），他们将衍生iPSC脊髓神经元祖细胞和少突胶质细胞祖细胞集群，放置在150µm的通道中，中心间距200µm。在支架培养的第三天，观察到轴突沿着通道进行性延伸。

研究证实，打印的神经元系统具有生物活性，这些神经元网络的荧光强度，随着钾和神经递质谷氨酸浓度升高而增强。

（3）循环系统

Kolesky等人使用多种3D生物打印材料，构建了可灌注的3D血管组织。

血管组织采用含有凝血酶的泊洛沙姆溶液与ECM材料交联而成，ECM材料包括明胶、纤维蛋白原、转谷氨酰胺酶，以及人新生儿真皮成纤维细胞和人骨髓间充质干细胞(hMSCs)。

（4）其他静态系统

Kim等人开发了一种3D胰腺组织，由ECM生物墨水挤压打印而成。研究显示，经过5天培养后，打印的胰腺组织存活率超过60%，随着培养基中葡萄糖浓度的增加，胰岛素分泌水平也在增加。此外，还显示胰腺特异性基因的RNA水平升高。

（5）高通量筛选系统

Matsusaki等人使用喷墨打印技术开发了440个简化肝组织芯片的微阵列，在多孔芯片上实现多层、多类细胞的快速打印。研究显示，HUVEC夹层之间的单层HegG2s的白蛋白和CYP3A4分泌水平提升。

04   3D生物打印的疫苗、药物和递送系统

图：3D生物打印技术用于疫苗等

表：3D打印递送系统

1.RNA打印

CureVac公司是mRNA打印的先驱者，它开发“RNA打印”的初衷是用于狂犬病疫苗。目前正在开发用于包括：黄热病、拉沙热、MERS和COVID-19的mRNA疫苗。最新消息显示，公司正与特斯拉合作，成立“RNA打印”业务新公司。

2.药物打印

最初将3D打印技术引入制药领域，是希望通过控制药物释放，减少给药频率、提高给药剂量，来改善用药依从性。

Aprecia Pharmaceuticals的抗癫痫药物Spritam（左乙拉西坦）是第一款3D打印药片，于2015年获得FDA批准。

这款产品采用了专有的粉末床和ZipDose 3D打印技术，喷墨打印头将粘结液体滴到粉末层上，将药物层层包裹，最多达到40多层。这种方法制备的药片有效成分含量可以达到1000mg，是普通药片含药量的5倍（200mg）。而且药片易于癫痫患者服用，在水溶液中几秒钟内崩解，在体内稳定释放。

还有人报道了可定制的3D打印药片，它能满足患者的多种需求，实现更为复杂的释放。这种定制药片分三种：含有表面侵蚀聚合物、不含表面侵蚀聚合物，含保护涂层的非渗透聚合物。3D打印设计出各种形状的药室，利用不同表面聚合物，实现恒速、控释、缓释的目的。

由此可见，在制造复杂药片方面，3D打印技术有望成为一种廉价、高效的定制药物制备方法。

3.细胞/药物递送系统

在个性化医疗中，3D打印技术能够根据患病部位，快速构建特定形状的支架。

Aldrich等人设计出了一种具有抗菌功效的3D复合支架，用于治疗开颅术后感染。他们用3D打印构建聚己内酯（PCL）/羟基磷灰石水凝胶复合支架，包封抗生素和巨噬细胞。然后，将这种复合支架植入到金黄色葡萄球菌感染的颅骨缺损模型中，观察到细胞的抗菌活性增强，细菌转化为代谢敏感型。

4.药物持释系统

Yi等人利用挤出打印技术开发了一种聚合贴剂，这种贴剂由PCL、PLGA和5-氟脲嘧啶混合而成，形状可以根据不同给药部位构建。在兔模型中，他们观察到药物持续释放4周，胰腺肿瘤明显缩小。

5.脉冲给药系统（PDDS）

2017年，McHugh等人推出了一种脉冲释放疫苗的单次注射平台。

他们运用3D打印技术将卵清蛋白封装在PLGA微囊中，经皮下注射到小鼠体内，通过控制乙、丙交酯的比例来调节释放曲线和降解速率。该种脉冲给药系统在单剂量中包含多种降解率的聚合物颗粒，释放曲线与传统疫苗接种一致。

6.气雾递送系统

Aran等人开发了一种名为MucJet系统，用于口服疫苗接种，他们采用了生物相容性高、耐水性好的光聚合塑料树脂进行3D打印，通过高压液体射流，将荧光素标记的卵清蛋白送到颊粘膜。

MucJet系统含内、外两个隔室，分别含有推进剂和疫苗。当MucJet系统聚合膜溶解后，外部隔室推进剂产生CO2气体，压力增加，推动含疫苗的内部隔室活塞，射出疫苗。体外研究表明，MucJet的递送效率提高近八倍，体内研究观察到，抗原的免疫原性增强了三个数量级。

结语

3D打印技术与生物医药结合，不仅能够构建初级器官、体外模型，而且可以根据疫苗、药物和递送系统的需要，制备各种复杂结构。

随着人工智能发展，智能化3D生物打印技术已经在研究中，相信在不久的未来，人类会以更高效的手段，找到更加个性化的治疗方法，获得更多更好的医药产品。

参考文献：

1.Application of 3D bioprinting in the prevention and the therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy.Volume6, Articlenumber:177（2021）.

作者：大道至简

来源： 医药速览 2023-03-01

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