纳米抗体合成文库介绍

前 言  

纳米抗体(VHH)因其独特的理化性质已被证明具有作为治疗分子和临床诊断工具的巨大价值，而纳米抗体需要对纳米抗体库进行淘筛来获取。目前纳米抗体文库可以分为三类，包括天然库，免疫库和合成库。天然库的VHH基因来源于未经免疫的羊驼B淋巴细胞，免疫库的VHH基因来源于经某种特定抗原免疫的羊驼体内的B淋巴细胞，而合成库无需动物免疫和取血，直接人工设计合成VHH抗体基因，再以基因工程技术去建库。本期小编为大家介绍常见纳米抗体合成文库。

1、基于VHH的合成文库

纳米抗体(VHH)是骆驼科动物的重链抗体的重链可变域(图1)，分子量仅为15KD，由4个框架区(FRs)和3个互补决定决定区（CDRs)间隔构成，除了拥有更长的CDR3区(3-28个氨基酸残基)，结构上与人的重链抗体可变域类似。VHH抗体有以下特点：体积小，特异好，稳定性高，免疫原性低，组织渗透性强。

图1 传统抗体(A)和纳米抗体(B)（来源于Thomas et al., 2014）

纳米抗体合成库的构建核心是人为创造出具有多样性的VHH片段，大致流程如下：(1) 选择蛋白框架；(2)模板确定；(3) 通过引物设计在CDR随机突变；(4) 合成模板和引物；(5) 采用不对称和重叠PCR合成多样性的VHH片段。

纳米抗体合成库基本的框架是一致的，多样性体现在CDR区。选择好框架之后，要确定突变CDR区的数量，和每个CDR区氨基酸的长度。一般CDR3区是确定亲和力和特异性的主要区域，可以仅对CDR3区突变，CDR3区可以设计多个长度。考虑到合成库的有效性，可能保留重要氨基酸位点，比如形成二硫键Cys位点。设计的引物中应包含多样性的CDR区和重叠延伸时片段之间的重叠序列。合成随机引物时，引物合成公司将在每个特定的位点添加混合碱基，每一个混合碱基池都是可以按一定比例定制。对于不同长度的CDR区，可以将每个长度制备成一个混合池，这些池可以在以后以特定的比例进一步混合，利用PCR技术重组VHH片段。下面就是目前已经公布的纳米抗体合成文库合成骨架，CDR区突变以及筛选方法等相关的介绍(表1)。

(1) Yan library: Yan等基于cAbBCII10 的保守骆驼单域抗体片段 (VHH) 框架构建了一个大型合成噬菌体展示纳米抗体文库。通过随机化合成寡核苷酸，在CDR3中引入了多样性。从文库中分离出与PA和NGAL结合的纳米抗体，用于PA检测系统的研发。

(2) Wang library：Wang等使用通用模板cAbBCII10，对3个CDR区进行完全随机化设计。从中分离出4种GPC3的纳米抗体，GPC3是一种高度特异性的肝细胞癌 (HCC) 诊断标志物，也是 HCC治疗的潜在靶点，这些纳米体可用于HCC诊断和治疗的药物的开发。

(3) Wei library：Wei等同样以cAbBCII10为蛋白骨架，对3个CDR区进行设计，其中CDR1和CDR2部分随机化，CDR3区设计9-20个氨基酸残基，构建的一个噬菌体展示文库。筛选出一种针对甲型流感病毒离子通道蛋M2的纳米抗体，对表达M2的甲型流感病毒具有广泛的中和作用。

(4)  Ju library：Ju等以h_NbBcII10为蛋白骨架构建的一个噬菌体展示文库，h_NbBcII10是cAbBCII10人源化的模板。此文库选择对3个CDR区随机设计，使用IL-1β、Amyloid-β和VEGF三种抗原对文库进行筛选，获得识别靶点的纳米抗体。

(5) NaLi-H1 library：这是第一个完全合成的人源化美洲驼单域抗体噬菌体展示库，以hsdAb为框架，hsdAb是基于人类VH3序列将纳米抗体D10(sdAb10)人源化得到的蛋白框架。此文库对3个CDR区进行设计，其中CDR1和CDR2部分随机化，CDR3区设计了四个长度(分别9 12 15 18个氨基酸残基)，除半胱氨酸外完全随机化。它是一个通用的纳米抗体合成库，可针对多种抗原进行快速筛选，并获得的高亲和力的纳米体(nM级)。(1) 针对细胞表面抗原：HER2是一种在肿瘤细胞表面过表达的蛋白质，该文库可快速高效的筛出与HER2结合的纳米体，用于靶向定位肿瘤细胞。(2) 针对胞内抗原：两种荧光蛋白EGFP和mCherry、β-微管蛋白、β-肌动蛋白、异染色质蛋白 HP1、肿瘤抑制因子p53，均可筛选出和它们结合的纳米体。(3) 筛选得到的胞内抗体可与蛋白酶靶向域融合，特异性的去降解它们各自的靶标，可以作为一个快速敲低蛋白的工具。

(6) McMahon library：蛋白框架源自美洲驼基因IGHV1S1-S5的共识框架，此文库对3个CDR区进行设计，其中CDR1和CDR2区部分随机化，CDR3区设计三个长度（10 14 18个氨基酸的长度）。这是一个酵母展示的合成文库，可用于人类GPCR构象选择性单域抗体的筛选。同时以HSA靶点，筛出了一种与HSA强结合力的纳米抗体，亲和力为430nM，可以用于半衰期延长生物制品的生产。针对人脂联素，确认了三个结合脂联素的纳米抗体。β2-肾上腺素受体和人腺苷A2A受体是两种不同构象的GPCR家族受体蛋白，分别筛选出和这两个受体结合的纳米抗体。

(7) Sevy library：Sevy等按照不同的策略构建了四个VHH文库，以羊驼IGHV3S53及其两种人源化基因为模板。对3个CDR区设计，CDR1和CDR2采用高多样化和低多样化两种方式，CDR3区设计8-10个氨基酸长度。使用这四个文库，针对三种不同大小和特征的模型抗原(可溶性小鼠PD-1胞外域蛋白，淀粉样蛋白-β肽和GPCR- MrgX1)分离了纳米抗体，获得针对三个靶标具有高亲和力(高达5 nM)的不同表位的多种结合剂，同时也筛选出能阻断 mPD-1与其受体 mPD-L1 结合的纳米抗体。

(8) Zimmermann library：Zimmermann等采用了三种蛋白框架(分别是3K1K,3P0G,1ZVH)构建了三个纳米抗体合成文库，根据这三种框架CDR3区的不同长度，产生凹型，环型，凸型三种可能的结构。每个文库均选择对3个CDR区随机化设计，其中三个文库CDR3区长度分别为6，12，16个氨基酸长度。通过三种不同的三核苷酸随机化混合物获得的随机化位置的氨基酸组成。此文库可用于膜蛋白构象捕获的纳米抗体的筛选，例如：MBP，IrtAB，ENT1和GlyT1。

表1 目前已经公布纳米抗体合成库情况(来源于Liu et al., 2022)

2、i-body合成文库（模仿N-VAR）

新抗原受体免疫球蛋白的可变区(V-NAR，Variable-New antigen receptor)，是来自鲨鱼抗体lgNAR的可变区片段(图2)，分子量约11-12KDa，仅包含CDR1和CDR3两个区域，且CDR3区比人lgG的相应区域长，大约5-23个氨基酸残基。AdAlta公司采用V-NAR在结构上类似与人神经细胞粘附分子(NCAM)免疫球蛋白的结构域1作为支架，开发出i-body药物发现平台(图3)。

图2 传统抗体(左)和lgNAR (右)（来源于Monica et al., 2021）

图3 i-body平台开发（来源于AdAlta官网）

i-body是在完全人类单域抗体蛋白支架上设计了两个模仿鲨鱼抗体形状的环，这些环负责与引起疾病的靶标结合和相互作用。i-body 合成库技术是一种独特抗体库技术，该技术使用剪接重叠PCR的方法将鲨鱼抗体（VNAR)CDR3嫁接到人类神经细胞黏附因子(NCAM)上，同时在分子内部引入一对二硫键稳定结构,并以此作为框架，设计合成文库。i-body合成库的设计，在修饰后的蛋白支架上确定可替换氨基酸残基，作为CDR1和CDR3随机区域，对CDR1区6个氨基酸残基进行完全随机化，同时CDR3区使用10-20不同长度的氨基酸残基，并对其进行完全随机化。实现随机化的方法是使用简并密码子NNK,即密码子第一个和第二个碱基的 N 核苷酸歧义（25% 胞嘧啶、25% 胸腺嘧啶、25% 腺嘌呤、25% 鸟嘌呤）和密码子第三碱基的K核苷酸歧义的核苷酸混合物合成的（50% 鸟嘌呤和 50% 胸腺嘧啶），使用寡核苷酸合成含有CDR1和CDR3插入片段。基于这些规则，来构建一个大型的组合文库。所合成的噬菌体文库包含200亿种i-body化合物，可以针对所选的疾病靶点进行快速筛查，尤其是针对GPCR靶点，以识别针对靶点的特异性i-body(图4和图5)。

图4 i-body平台筛选（来源于AdAlta官网）

目前已使用筛选出近20个药物候选分子，其中该技术开发出对CXCR4具有高特异性和亲和力的完全人源化的单域抗体支架i-body AD-114-PA600，用于抑制肺纤维化，其第二代支架AD-214在i-body AD-114的C端融合了人的Fc片段，来延长它在人体中的半衰期,AD-214已完成临床I期试验。ADR3是一种新型的i-body，体外试验表明，对hRANKL有高亲和力，可以减弱破骨细胞分化和骨吸收，可能会为骨质流失的治疗提供了一种新的方法。

图5 i-body平台优势（来源于AdAlta官网）

小 结  

纳米抗体与传统抗体相比，具有很多优势，如更低的免疫源性，更好的组织渗透作用等。解决了传统抗体的一些局限性问题，是传统抗体的更好的替代品。随着抗体库技术的进步，使用廉价寡核苷酸的合抗体库也必将是规避动物使用的替代方案。相信未来会有更多的靶点药物会从合成抗体库中筛选出来，也会出现更多的基于合成抗体库开发药物的公司。