immunoPET与核素偶联抗体药物系列 | 探针载体

前 言  

免疫PET成像的关键取决于成像示踪剂靶向肿瘤组织的特异性，肿瘤摄取时间，以及图像的肿瘤/本底对比度。为了获得高度特异性的肿瘤摄取和低背景保留，成像探针的载体通常是抗体、抗体片段、VHHs或多肽等分子。本期内容为大家介绍免疫PET成像中常用的探针载体。

单克隆抗体 

mAbs（monoclonal antibodies）开发和使用在过去十几年取得相当大的成功，各种mAbs已经用于治疗实体瘤、恶性血液病以及非癌症疾病。放射性核素标记的mAbs也成功应用于临床，但是选用mAbs制备免疫PET探针有明显缺点：(1) mAbs的大小(150 kDa图1a)超过正常肾小球过滤的临界值(60 kDa); (2)血液清除率低，mAbs的Fc结构域可以和内皮细胞上的新生儿Fc受体(FcRn)结合，使得探针受到保护而不易发生降解，在血液中的停留时间从几天到几周不等；(3)组织穿透率低，mAbs通常在注射2-4天后，靶组织与周围组织之间才有明显的放射性信号的峰值对比。

因此，使用mAbs做为成像探针载体，必须选择长半衰期的放射性核素如89Zr（t1/2=78.4 h）或124I（t1/2=100.3 h）进行放射性标记。此外，mAbs探针易于在肝脏、脾及骨髓等正常器官和组织内积聚，而获得影像的肿瘤/本底比值并不理想，有可能产生假阳性诊断。这些缺陷限制了基于mAb的免疫PET成像示踪剂在临床的广泛应用。

图1.代表性抗体和抗体片段示意图。(a)常规免疫球蛋白由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。每个重链由三个恒定域(即CH1、CH2和CH3)和一个可变域(VH)组成，轻链由一个恒定域(CL)和一个可变域(VL)组成。(b)重链抗体(HCAb)缺乏轻链和CH1结构域。(c)单结构域抗体(VHH)是HCAb的抗原结合结构域(VH)。(d)单链抗体(ScFv)是由linker链接一条重链可变区与一条轻链可变结构区构成。基于ScFv作为模块，可以构建(e)双链抗体(ScFv的二聚体)和(f)微体(scFv−CH3的二聚体)。

功能性抗体片段 随着抗体工程技术的发展，目前多种抗体片段已被设计用于成像。一般而言，这些抗体片段缺少Fc区，相对分子质量和尺寸与完整的抗体相比大大降低，保留与抗原结合特性的同时，体内血液清除率和肿瘤组织的吸收率都大幅增加，并相应地获得较高的肿瘤/本底比值，在注射后短时间内即可成像。

抗体Fab片段 Antigen-binding fragments，Fabs

抗体Fab片段是抗体经蛋白酶水解后得到的抗原结合片段，相对分子质量与完整的抗体相比大大降低，Richter等采用PASylation技术修饰Fab片段并使用放射性核素89Zr标记，制备的89Zr·Df-HER-2-Fab-PAS200进行PET显像，能够显示HER-2阳性乳腺癌的原发病灶及淋巴结转移病灶，提示放射性核素标记的Fab片段作为HER-2靶向探针具有可行性，但抗体Fab片段在成像时无法避免被肝脏、脾及骨髓等正常组织非特异性摄取。

单链抗体single chain antibody fragments，scFvs

单链抗体(scFvs，图1d)是最流行的抗体片段之一，分子大小为25 kDa。与完整的mAb相比，scFvs在血液中的清除速度快，并且成像中肿瘤/本底比值比mAbs高很多。

scFvs由轻链可变区和重链可变区组成，它们通过柔性肽linker连接在一起。因此，两个结构域之间的肽接头的长度和氨基酸构成会显著影响scFvs的大小和抗原结合亲和力。相比于mAbs，scFvs的局限性在于其单价的抗原结合亲和力要弱于mAbs双价的亲和力，但是可以通过将单价scFvs改造成多价形式来增强亲和力并优化肿瘤靶向能力。Diabody(60 kDa，图1e)是单价scFvs的二价形式，其中Cys-modifified diabody (Cys-diabody) 常用于位点特异性放射性核素标记。其他较大的二价形式，如minibody(Mb，图1f)也已被开发为靶向载体。一些多价scFv片段，如triabody(~90 kDa)和trimerbody(110 kDa)，也显示出作为免疫PET成像探针载体的潜力。 放射性标记的scFvs和Fabs会被泌尿系统快速清除，导致放射性示踪剂在肾脏中高滞留。通过一些策略可以很大程度避免高肾滞留现象，包括将明胶和赖氨酸共融合，聚乙二醇修饰靶向载体等。

单结构域重链抗体single domain antibodies,sdAbs

HCAbs(图1b)是骆驼科动物中天然存在的重链抗体。HCAbs可通过免疫骆驼科动物，或从naïve或合成文库中获得。HCAbs重链的可变区(VHH，图1c)，通常被称为纳米抗体(Ablynx的商品名)或单结构域抗体(sdAb)。VHHs是自然界中最小的抗原结合单位, 分子量约为12-15 kDa，直径< 4 nm，结构紧凑，同时保持其抗原识别能力。 VHHs独特的理化性质带来的诸多优势包括：(1)对人的免疫原性低, VHHs天然缺失Fc，而且与人3型VH结构域高度相似性；(2)体积小，半衰期短，可使用半衰期较短的放射性核素进行标记；(3)高热稳定性（高重折叠能力）和对恶劣环境的相对高的抵抗力；(4)VHHs形状扁长且十分紧凑,暴露出的凸形互补位和长CDR3环可以结合常规抗体难以结合的抗原表位（如表面空洞或裂缝）；(5)分子量小，可穿透血脑屏障；(6) VHHs的单链结构更易于克隆和生产。

因此VHHs被认为是肿瘤分子成像中的“灵丹妙药”。VHHs在免疫PET成像中具有良好的组织穿透性和血液清除率，能更快地与肿瘤组织结合，可使用半衰期较短的放射性核素进行标记，在注射后1h内即可获得高对比度影像，常用18F、68Ga及99Tcm标记。

尽管VHHs具有出色的药代动力学，但基于VHHs的免疫PET成像示踪剂同样不适用于检测泌尿系统或肾脏中的病变。

除了应用于肿瘤分子成像，VHHs在以肿瘤治疗为目的应用中也正在被广泛的研究和开发，比如基于VHHs的放射性免疫疗法(radioimmunotherapy，RIT)和基于VHHs的光免疫疗法(photoimmunotherapy，PIT)。

多肽类分子 多肽类分子有较短的生物半衰期、较好的肿瘤组织穿透性和较低的免疫原性，也易于化学修饰，在使用过程中亲和性较为稳定。多肽类靶向分子探针血液清除率高，可以获得良好对比度的影像，但仍会出现肾脏及膀胱的生理性积聚。如何加快药物代谢并从体内清除，从而减少对肾脏及膀胱周围病灶检测的影响依然是个挑战。

生物工程骨架蛋白 随着蛋白质工程技术的革新，目前已经开发出了可用于分子成像领域的骨架蛋白。这些低分子量蛋白质没有二硫键和糖基化修饰，因此可以在原核系统中快速表达，有效降低生产成本。 目前，PET成像最常用的工程骨架蛋白之一是亲和体(6 kDa)。亲合体分子最初来源于葡萄球菌A蛋白的B结构域，是具有58个氨基酸残基的短肽，折叠成三螺旋结构。因其相对分子质量比sdAbs相对分子质量更低，因而肿瘤细摄取率更高，且其在血液中的清除速率也更快，易在短时间内获得更高对比度的肿瘤成像。目前靶向HER2的亲和体核素探针已经成功用于诊断HER2表达阳性患者（18F-HER2-BCH affibody)。 随着更多亲和体的开发，亲和体有望替代抗体，完成目标蛋白检测，肿瘤影像诊断及治疗等作用。

酪氨酸激酶抑制剂

与抗体、抗体片段及工程骨架蛋白相比，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKl）有着更低的相对分子质量及更高的血液清除速率，且可评估以TKI为主要靶点的细胞内酪氨酸激酶的密度及状态，但TKI较高的肝脏非特异性摄取限制了其在临床中的应用，因此如何增加其细胞膜通透性的同时，减少肝胆排泄及非特异性摄取是制备TKI探针的关键。

小 结  

成像探针的载体通常选用抗体、抗体片段、纳米抗体或多肽等分子。其中完整抗体的血液药代动力学较慢，需要半衰期相对长的核素标记导致较高的辐射剂量，血液清除率较慢，血池及肝脏背景高，为了获得较好的图像对比度，需要较长时间点的显像(64Cu-trastuzumab 最佳显像时间为1-2 天,89Zr-trastuzumab 最佳显像时间为标记4-6 天)，患者的配合度较差。

相比之下，抗体片段，纳米抗体或多肽等分子可使用短半衰期核素标记，辐射剂量明显低于长半衰期核素标记的完整抗体，并且由于它们相对分子质量小，生物分布快，注射药物后短时间内显像（1~4 h），增加患者的便利性，可重复显像。

综上，免疫PET分子显像可实时无创的监测全身病灶的表达情况，有助于更好的理解肿瘤表达的异质性，用于原发肿瘤转移灶的筛选和不易活检病灶状态的评估，同时也可用于预测疗效，以选择适合靶向治疗的患者。短半衰期核素标记的抗体片段、纳米抗体及多肽等分子显像因其较短的显像时间点及较低的辐射剂量，更适于临床应用。

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