酵母表面展示技术在蛋白改造中的应用

2023
03/08

+
分享
评论
阿帕克生物
A-
A+

酵母表面展示是真核表达系统,能够产生含有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质。这种独特的优势组合使酵母表面展示技术成为应用于蛋白改造中的领先技术。

· 前言 通过与酵母细胞壁蛋白融合表达,将目的重组蛋白展示在酵母表面白的方法,称为酵母表面展示。酵母表面展示技术已经成为一种极具价值的蛋白质工程工具,广泛应用于生物技术和生物医学领域。之前两期内容我们为大家介绍酵母表面展示技术原理和在抗体发现中的应用,本期小编为大家介绍酵母表面展示技术在蛋白工程中的应用。

01亲和力成熟

蛋白质的亲和力对其结合配体而言是一个关键参数,高亲和力有利于调节结合复合物的生物学功能。目前,针对于蛋白质亲和力成熟的方法众多,其中最为常见的是定向进化和分子展示技术。在过去的十年里,酵母表面展示技术逐渐成为亲和力成熟的常用技术。

使用酵母表面展示的亲和力成熟的策略主要包括4个步骤(图1):

47401678240584896

图1:通过FACS从酵母表面展示的文库中分离高亲和性蛋白质突变体.[1]

A. 文库构建:随机诱变产生107-109个蛋白质突变体的文库;

B. 酵母表面展示:基因库转化酵母细胞和诱导表面表达,蛋白质突变体表现为与Aga2p细胞壁蛋白的融合体;

C. 利用蛋白配体对展示文库进行差异标记(两种策略):平衡结合策略与动力学结合策略,蛋白质突变体由于亲和性不同而导致配体结合产生差异;

D. FACS筛选:添加经荧光标记的抗表位标签抗体可使酵母表面表达水平随结合而正常化,从而可通过FACS分离出高亲和性的突变体; 

经分选的酵母克隆可扩增培养以用于分析或后续一轮分选,或可分离提取DNA,经突变后用于转化新批次的酵母细胞以进行进一步的蛋白定向进化,从而筛选出更高亲和力的蛋白。

02蛋白稳定性高 蛋白质的稳定性通常是指其抵抗热和化学变性以及蛋白水解降解的能力。高稳定性是用于研究工业和治疗应用的蛋白质的期望特征,同时稳定性的提升可转化为更长的保存期、活性持续时间和体内活性。与结合亲和力一样,酵母表面展示技术可以在蛋白质突变体仍与酵母细胞表面相连的情况下分析热稳定性,从而可以快速、定量地测定最大变性(TM)值。 目前,酵母平台主要利用三种策略工程化增加蛋白质的稳定性(图2)。三种方法均先通过随机诱变产生约107至109个蛋白质突变体文库,并将其作为与Aga2p细胞壁蛋白的融合物进行酵母表面展示,随后分策略进行高稳定性蛋白质的筛选。

40311678240664714

图2:通过FACS从酵母表面展示的文库中分离高稳定性蛋白质突变体(点突变显示为红色)[1]

策略一:根据表面表达水平筛选稳定的蛋白质突变体(图2a)。用突变基因库转化酵母通常会显示出适当折叠和截短的蛋白质突变体,其表达水平在一定范围内,可用作蛋白质稳定性的替代物。用针对c - myc表位标签(紫色框)的荧光抗体(绿色星)和对酵母表面展示蛋白的天然折叠特异的配体(红色星)标记细胞,再通过FACS选择表达最高水平的正确折叠突变体的细胞。 

策略二:根据其抵抗不可逆热变性的能力筛选稳定的蛋白质突变体(图2b) 。在细胞分选前对酵母表面展示文库进行高温热应激(85℃,10分钟)。高温热变性一般属于不可逆变性,故此法更适合于具有较高热稳定性的蛋白质。基于其与荧光标记的抗体或配体结合的能力,通过FACS分选出特异于天然蛋白质折叠的,可抵抗热变性的酵母表面展示的突变体。 

策略三:利用升高温度的优势和内质网(ER)的质量控制机制来选择稳定的突变体。在该方法中,在高达37℃(与通常使用的20℃或30℃相比)的温度下诱导表面展示的蛋白质表达24小时,以在蛋白质合成期间利用ER对蛋白质的翻译后处理,使蛋白质结构的平衡向错误折叠状态转移,同时保持酵母细胞的活力。一般来说,只有在升高的诱导温度下有效折叠和加工的蛋白质才能避开ER质量控制机制并有效地转运到细胞表面。然后可以如第一种策略(图2a)所述对文库进行分类,以选择稳定性增加的突变体。

03蛋白酶定向进化

定向进化是改造酶特性的一项强有力的技术。然而,酶的定向进化过程中最大的挑战则是将酶突变体的基因型与其表型(例如,催化活性或底物特异性)正确联系,因为在大多数情况下,底物转换产生的是可扩散的产物,无法共价结合到噬菌体或细胞的表面,而酵母表面展示技术可将酶突变体与锚定蛋白如a-凝集素融合表达,而锚定于酵母细胞壁上。随着酵母表面展示技术的发展,结合FACS技术可以对包含108个酶突变体的文库进行筛选,获得更高活性和底物特异性的酶。 其中,用于酶催化邻近标记的生物素连接酶TurboID就是通过酵母表面展示定向进化筛选获得的。科学家Tess C. Branon等人[2]以生物素连接酶BioID(BirA-R118S) 为模板,使用易错PCR技术合成一个包含有107个连接酶突变体的文库,每个连接酶突变体平均有两个氨基酸的突变。将该连接酶突变体文库展示在酵母表面,加入生物素和ATP启动杂交生物素化,然后用链霉亲和素对每个酵母细胞表面的生物素化部位进行染色。通过流式分选富集高度自我生物素化的细胞(图3)。 科学家通过这种酵母表面展示定向进化生物素连接酶,经过多轮筛选最终获得更高效率的生物素连接酶突变体TurboID和miniTurbo,这两种酶使得酶催化标记反应可在10分钟内完成,大大缩短生物素标记实验周期且提高标记效率。

94851678240708920

图3. 基于酵母表面展示定向进化的选择方案。[2]连接酶与锚定蛋白Aga2p融合表达,Aga2p通过二硫键与Aga1p共价结合锚定在酵母表面。连接酶的C-末端带有myc表达标签。将生物素和ATP加入到酵母库中反应10分钟到24小时。蓝色圆点所示为生物素化标记的位点。用链霉亲和素染色检测底物的生物素化程度,用anti-myc抗体染色检测连接酶的表达。FACS分选富集链霉亲和素和Myc染色高比例的细胞。

小  结 

与核糖体和噬菌体展示等其他技术相比,酵母表面展示的最显著优势是可以结合流式细胞仪分析使用,能够在细胞上定量测量蛋白表达水平、稳定性、亲和力和特异性,而不需要可溶性蛋白表达和纯化等步骤。此外,酵母表面展示是真核表达系统,能够产生含有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质。这种独特的优势组合使酵母表面展示技术成为应用于蛋白改造中的领先技术。

不感兴趣

看过了

取消

本文由“健康号”用户上传、授权发布,以上内容(含文字、图片、视频)不代表健康界立场。“健康号”系信息发布平台,仅提供信息存储服务,如有转载、侵权等任何问题,请联系健康界(jkh@hmkx.cn)处理。
关键词:
FACS,酵母细胞,突变体,蛋白质,生物素,酵母,蛋白

人点赞

收藏

人收藏

打赏

打赏

不感兴趣

看过了

取消

我有话说

0条评论

0/500

评论字数超出限制

表情
评论

为你推荐

推荐课程


社群

  • “健康为民 体验提升”案例征集 加入
  • 第九季管理奖官方群 加入
  • 全院血糖管理交流群 加入
  • 医院运营管理官方群 加入
  • 手术室精益管理联盟 加入
  • 医院SPD创新管理交流群 加入

精彩视频

您的申请提交成功

确定 取消
×

打赏金额

认可我就打赏我~

1元 5元 10元 20元 50元 其它

打赏

打赏作者

认可我就打赏我~

×

扫描二维码

立即打赏给Ta吧!

温馨提示:仅支持微信支付!

已收到您的咨询诉求 我们会尽快联系您

添加微信客服 快速领取解决方案 您还可以去留言您想解决的问题
去留言
立即提交