高通量测序后的下游实验验证方法m6A RNA甲基化篇

此前，我们分享了m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路，进而筛选出m6A修饰目标基因。

做完MeRIP-seq测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面：

简单验证

全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能

靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达

研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达

m6A修饰目标基因的表达回复实验

研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达

（1）简单验证

目标基因m6A甲基化的验证：MeRIP-RT-PCR

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

（2）全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能

m6A甲基化干扰：m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂 如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2

检测m6A甲基化整体变化：m6A甲基化免疫荧光染色（定性）、m6A斑点杂交（定性）、比色法（定量）、质谱法（定量）

检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR

检测目标基因的mRNA水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质水平：Western blot

检测细胞功能/表型变化

FB23-2给药后，大脑损伤组神经功能缺陷评分显著变差

（3）靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达

目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建：荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒，转染细胞并表达。

检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR

检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

检测细胞功能受到的影响：免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ...

用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统

（4）研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达

检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平： Polysome profiling Ribo-seq 通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率

通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率

Polysome Profiling方法举例：

siMETTL3/14对目标基因与与核糖体的结合造成影响，对内参基因GAPDH无影响。

研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平 研究m6A对目标基因mRNA水平的影响 RT-qPCR RNA-seq

METTL3/14干扰后，采用RT-PCR和RNA-seq检测目标基因的mRNA水平是否收到影响

研究m6A是否通过调控RNA的出核（nuclear export）而影响目标基因蛋白水平

裂解细胞，超速离心分离细胞核与细胞质，然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平

METTL3/14干扰后，采用RT-PCR检测目标基因在细胞核与细胞质中的mRNA水平是否受到影响

（5）m6A修饰目标基因的表达回复实验

writers的突变/敲降/敲除实验： RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化 Western blot检测目标基因的蛋白水平变化 检测目标基因的功能

writers的突变/敲降/敲除后，目标基因的过表达回复实验：

检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况

METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响

（6）研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达

合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种

Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验：

RT-PCR验证靶基因的mRNA水平

Western blot验证靶基因的蛋白水平

Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合

YTHDF1引入突变后，检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响

关于易RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。