单细胞数据和免疫结合发表8+！

导语

骨肉瘤 (OS) 是最常见的原发性骨肿瘤，预后较差。事实证明，免疫浸润对预后有很大影响。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章作者分析了单细胞数据集和bulk数据集，以确认骨肉瘤中的主要免疫细胞群及其特性。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为：8.786，文章题目为：Single-cell RNA datasets and bulk RNA datasets analysis demonstrated C1Q+ tumorassociated macrophage as a major and antitumor immune cell population in osteosarcoma。

数据介绍

本研究从TARGET数据库和GEO数据库下载了OS患者的临床和转录组数据。  

技术路线          

本研究技术路线如图1所示。  

图 1

结果解析 

01   高免疫浸润组骨肉瘤预后较好  

聚类后，数据集 GSE21257 的 40 和 13 个样本分别分为高免疫浸润组和低免疫浸润组 （图 2A）。然后本研究通过 ssGSEA 计算了这两组的免疫浸润评分。高免疫浸润组确实表现出更高的免疫细胞评分，低免疫浸润组的各种免疫细胞评分都较低（图2B），高免疫浸润组预后较好（图2C）。本研究在数据集 GSE21257 和 GSE32981 中分别收集了高免疫浸润组和低免疫浸润组之间的 DEG 。GSE21257高免疫浸润组有146个高表达基因和261个低表达基因。GSE32981得到110个高表达基因和14个低表达基因。在总共 240 个高表达基因中，34 个重叠基因被获取。本研究发现 275 个低表达基因之间没有交叉，就像依赖于免疫相关分组的生存图一样，几乎所有这 34 个基因都与更好的总体生存相关（图 2F）。GO生物过程富集表明，这34个基因参与了白细胞和T细胞的增殖过程（图2D）。DEG 分析的进一步 GSEA 显示补体信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、吞噬作用以及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用的标志被高度富集（图 2E）。

图 2

02   巨噬细胞是骨肉瘤中主要的免疫细胞群  

为了探索更高表达基因的来源，本研究使用单细胞测序数据集 GSE152048 分析了 OS 的细胞群。在初步质量控制评估和双峰去除后，本研究从总共 99,668 个细胞中获得了单细胞转录组，这些细胞聚集成九组。它们如下：(0) 37,939个OS细胞高表达SPP1、COL2A1、SOX9和ACAN；(1) 21,067 个骨髓细胞高表达 CD74、CD14 和 FCGR3A；(2) 13,667个成纤维细胞高表达COL1A1和LUM；(3) 包括T细胞和NK细胞在内的8,089个TIL高表达IL7R、CD3D和NKG7；(4) 7,699 个增殖的 OS 细胞高表达 TOP2A、PCNA 和 MKI67；(5) 7,307个破骨细胞高表达MMP9和CTSK；(6) 3,646个内皮细胞高表达vWF，(7) 129个FABP4+巨噬细胞高表达FCGR3A和FABP4；和 ( 8 ) 125 个成肌细胞高度表达 MYPL（图 3A–D）。小提琴图依次显示每个细胞组的一个代表性标记基因的表达水平，C1QA 除外（图 3B、C）。

图 3

COL1A1是成纤维细胞和OS细胞的标志物，主要表达于成纤维细胞，也存在于OS细胞中。此外，ACAN 主要在 OS 细胞中表达，但也在成纤维细胞中表达，七个集群均匀分布在 11 名患者中（图 3D）， FABP4+巨噬细胞组和成肌细胞组细胞数量很少，主要由样品BC17中的细胞组成，而FABP4+ 巨噬细胞检测到的基因数量异常多。本研究将 34 个更高表达的 DEG 与确定的某些细胞群相匹配，点图显示这些基因主要由骨髓细胞和 FABP4+ 巨噬细胞表达（图 3E）。

03   C1QA和其他重叠的DEGs主要由C1Q+ TAMs表达  

由于 DEG 由髓样细胞和 FABP4+ 巨噬细胞表达，本研究将髓样细胞组进行类似于上一步的亚群分析。当分辨率设置为0.5时，骨髓细胞被分成九个簇，从九个簇中识别出六个细胞群（图 4A-D）。它们是 (1) 9,601 个 C1Q+ TAM，在簇 0 和 1 中具有高 C1Q 表达；(2) 3,516 个单核细胞，C1Q 表达低，G0S2 和 S100A9 表达高，簇 2；(3) 1,072 个 C1Q+ 破骨细胞，在簇 5 中具有高 C1Q、MMP9 和 CTSK 表达；(4) 609 个 C1Q+ 成纤维细胞，在簇 7 中具有高 C1Q、COL1A1 和 LUM 表达；(5) 簇 8 中 79 个 FABP4+ 巨噬细胞高表达 FABP4；(6) 簇 3、4 和 6 中的 7,418 个未知细胞（图 4A-D）。小提琴图显示 CD14、CD74 和 C1Q 在所有组中均有表达（图 4B）。C1Q 在 C1Q+ TAM 中表达最高，在单核细胞和 C1Q+ 破骨细胞中表达较低（图 4C）。

图 4

以前鉴定的破骨细胞和成纤维细胞几乎不表达 C1Q（图 3B）。然后，本研究将这两组细胞称为 C1Q+ 成纤维细胞和 C1Q+ 破骨细胞，因为它们同时表达 C1Q 和个体标记。FABP4+ 巨噬细胞来自所有 11 名患者，其中极少量来自 BC17（图 4D）。图 3D 显示 FABP4+ 巨噬细胞群主要来自 BC17。本研究认为在两次聚类中识别出的两个 FABP4+ 巨噬细胞群是相同的，并且比较了这些细胞群的标记基因和之前获得的 34 个 DEG。有 15 个 DEG，包括 C1QA 被发现是 C1Q+ T A M 标记，6 个 DEG 被发现是单核细胞标记 （图 4E）。C1Q+ 巨噬细胞标记物的 GO 富集显示抗原加工和呈递以及中性粒细胞激活（图 4F）。

04   C1Q+ TAM标志物与预后相关且高度共表达  

C1Q+ TAM 有 219 个标记，本研究发现 10 个最高倍数变化的前标记中有 5 个与更好的预后相关。它们是 C1QA、C1QB、FOLR2、LGMN 和 APOE（图 5A）。本研究还使用 C1Q+ TAM 的高表达标记根据层次聚类的结果将数据集 TARGET-OS 的示例分为两组（图 5B）。具有高 C1Q+ 巨噬细胞标志物表达的组显示出更好的总体存活率（图 5C），这表明 C1Q+ TAM 浸润具有抗肿瘤作用。本研究计算了 219 个标记之间的共表达系数，以 C1QA、C1QB 和 C1QC 作为基准。三者之间的相关系数在数据集 TARGET-OS 中分别为 0.97、0.97 和 0.98。本研究计算了每个患者的 TAM 标记的系数，选取了明显的共表达基因，并通过 Cytoscape 绘制了平均系数（图 5D）。其中CD74、HLA-D、补体 1 和载脂蛋白起主导作用。此外，本研究探索了 C1Q+ TAM 和从第一次聚类和子聚类中获得的细胞-细胞相互作用和配体-受体对（图 5E），通过细胞间相互作用分析表明，C1Q+ TAM 主要作用于内皮细胞。

图 5

小编总结

本研究表明，较高的免疫浸润水平提高了OS患者的总体生存，大多数免疫浸润相关基因的高表达与更好的生存有关。特别是本研究报道了C1Q作为骨肉瘤的抗肿瘤因子。以C1QA/B/C、APOE/C、FLOR2、SLC40A1、SEPP1、MRC1高表达为标志的C1Q+ TAMs有助于OS患者更好的预后。C1Q+ TAMs是OS TME中的主要免疫细胞。本研究提供了免疫细胞如何影响骨肉瘤预后的图像，C1Q+ TAMs可作为治疗靶细胞，改善骨肉瘤的治疗。本研究局限主要在于所有的数据量不大，研究结果仍需要进一步的实验验证。