【话险危夷】维生素C通过下调氧化应激和炎症反应对内毒素感染性心肌病的抗氧化作用

摘要：

在严重的脓毒症病例中，内毒素引起的心肌病可对心脏造成重大损害。这项研究旨在观察维生素C(VitC)是否能预防脂多糖引起的心脏损伤。18只雄性SD大鼠(n=6)随机分为3组。对照组大鼠在标准饲料基础上灌胃生理盐水0.5m L(对照组)，第15天给予1剂内毒素(脂多糖)(6 mg/kg)致内毒素血症(内毒素组)，内毒素+维生素C 500 mg/kg体重灌胃15d(内毒素+维生素C组)。第15天，即注射脂多糖后6h，采集血液和组织标本，进行组织病理学和生化分析。与对照组相比，注射脂多糖降低了组织中超氧化物歧化酶(SOD)水平，增加了丙二醛。此外，内毒素组的炎症生物标志物、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素6(IL-6)也升高。光镜和电子显微镜显示内毒素治疗组心肌细胞、间盘、线粒体和内皮细胞均有损伤。在内毒素血症大鼠中，维生素C预处理显著降低丙二醛水平和恢复超氧化物歧化酶活性，最小化炎症生物标志物，并减轻心肌细胞损伤。

结论：

维生素C通过抑制氧化应激细胞因子对内毒素诱导的心肌病有保护作用。

关键词：

心脏组织；维生素C；组织病理学；氧化标记物；电子显微镜；统计分析

1.前言

脓毒症是指由感染引起宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。全世界至少有1900万人受到脓毒症的威胁，这提醒科学家和医生，它仍然是一个严重的全球健康问题和治疗困境。尽管对重症监护和支持技术的进行了广泛的研究，但脓毒症仍然是危重患者非心脏重症监护病房发病率和死亡率的原因之一。炎症反应失调、氧化应激、钙调节紊乱、自主神经系统失调、自噬缺陷、细胞凋亡损伤以及线粒体和内皮功能障碍都是脓毒症所致心肌病的表现。内毒素是由脂多糖组成的复合物，脂多糖是革兰氏阴性菌外壁的主要成分，由细菌主动分泌。通过刺激炎症介质，内毒素可引起脓毒症，随着时间的推移导致器官损伤。脓毒症中最常见的器官功能障碍之一是心脏功能障碍。尽管心肌功能障碍的机制复杂且知之甚少，但积累的实验数据表明，心室肌原纤维反应性降低、NO-过氧亚硝酸盐活化和线粒体氧化磷酸化抑制是基本的细胞内机制。脓毒症反应破坏组织的常见病因被认为是频繁的血管内皮损伤和微血栓形成。研究认为组织接受的氧气和底物减少，导致氧自由基和厌氧代谢的产生。膜流动性和功能降低、线粒体和高尔基体活动受损以及酶抑制是脂质过氧化的毒理学结果。

维生素C是一种具有清除自由基和抗氧化特性的补充剂。其治疗可显著提高心力衰竭患者左心室的射血分数，并且可降低心血管死亡率。维生素C的抗氧化特性有助于预防和治疗心血管疾病。抗氧化系统包括抗氧化维生素A、C和E、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血浆铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶 (SOD)和过氧化氢酶(CAT)，保护细胞免受脂质过氧化，这是细胞抗氧化的基础多种病理疾病。维生素是合适的抗氧化剂，可用于改善组织对氧化应激的保护，因为它们可以在广泛的剂量范围内轻松、高效且安全地作为膳食补充剂使用，而且没有潜在的并发症。

TNF-α 和 IL-6 增加血浆水平，并与左心室舒张功能障碍有关。舒张功能障碍的发病机制可能受活跃的促炎过程影响。TNF-α和IL-6相互作用可降低 eNOS 磷酸化并促进氧化应激，从而导致冠状动脉内皮功能障碍。本研究的目的是评估维生素 C 是否可以在实验诱导的内毒素血症期间保护大鼠免受氧化性心脏组织损伤。

2.材料与方法 

2.1测试物质 

内毒素（来自马流产沙门氏菌的脂多糖）由美国密苏里州圣路易斯的 Sigma Chemical 提供。美国密苏里州路易斯补充了维生素 C。

2.2.动物 

本研究中使用的大鼠是 18 只 Sprague Dawley 雄性大鼠，体重 150-250 克。随意给予标准饮食和水。将动物随机分为三组 (n = 6)。对照组大鼠仅接受标准饮食和 0.5 mL 生理盐水灌胃 15 天。内毒素组在第 15 天腹腔注射单剂量 LPS（6 mg/kg BW），内毒素加 Vit C 组接受 Vit C 500 mg/kg BW/天 [24] 通过口服灌胃溶解在生理盐水中并递送腹腔注射 15 天，然后在第 15 天注射单剂 LPS。注射 LPS 后 6 小时，从眶后静脉采集血样，并在苯巴比妥麻醉下提取心脏组织用于生化和组织病理学检查。

2.3.氧化应激（MDA 和 SOD）和炎症生物标志物（TNF-α 和 IL-6）评估 

为测量氧化应激和炎症生物标志物，将心脏标本在冰冷盐水中匀浆并以 18,000×g (148C) 离心 15 分钟。TBARS 检测试剂盒用于测量 MDA（产品编号 Cayman Chemical Company，Ann. Arbor，MI，USA）。该试剂盒用于测量 SOD（产品编号 Cayman Chemical Company，Ann. Arbor，MI，USA）。根据制造商的说明，通过使用 ELISA 试剂盒（BIOTANG INC. Cat. No. R6365, St, Lexington, MA, USA）测试 TNF-α。使用 ELISA 试剂盒 (BIOTANG INC, Cat. No.RB1829，圣，列克星敦，马萨诸塞州，美国）。

2.4心脏横截面的苏木精-伊红染色 

采集心脏组织样本并在中性缓冲福尔马林 (10%) 中保存 24 小时。在用增加的酒精浓度使组织脱水后，制成石蜡块。对于组织学研究，组织切片（5 µm 厚）用苏木精和伊红染色。

2.5.透射电子显微镜 (TEM) 

将 1 mm3 的心脏小块保存并固定在4℃的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中的 2.5% 戊二醛溶液中，pH 7.2。两个小时后，将样品后固定在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中的 1% 四氧化锇中，pH 7.2，4℃，然后在递增等级的乙醇中脱水，然后开始包埋在 Spur 的树脂中。将组织块切割成80nm厚的超薄切片。样品用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，然后在80Kv的电子显微镜（JEM-1011,Jeol,Tokyo,Japan）下进行分析。

2.6.统计分析 

均值和标准偏差(SD)用于表示数据。Graph Pad Prism程序（版本6）用于分析数据。Tukey的事后检验是在执行单向方差分析后进行的。为了实现这一点，两个独立参数之间可能存在相关性，对Pearson 相关性进行了统计检查。如果p≤0.05，则结果为具有显著统计学差异。

3.结果

3.1.生化结果 

内毒素组的氧化应激增加，从对照组的MDA增加和SOD减少可以看出 (p≤0.05)（图 1A、B）。与内毒素组相比，补充维生素C显着降低了MDA（指示过氧化）并增加了抗氧化酶(SOD)，但未达到对照水平。

图1.所有组的生化参数（氧化应激和促炎生物标志物）

(A,B)：维生素 C 可防止内毒素诱导的氧化应激，并降低三个研究组心脏匀浆中的氧化应激生物标志物（MDA (A)和SOD (B)）。结果是平均值 (±SD)，n = 6。*p<0.05 与对照组相比，***p<0.05与内毒素组相比。(C,D)：维生素C可防止内毒素诱导的炎症，并减少三个镶嵌组心脏匀浆中的促炎生物标志物（IL-6 (C)TNF-α(D)）。结果是平均值(±SD)，n = 6。*p<0.05与对照组相比，***p<0.05与内毒素组相比。作为炎症的指示，与对照组相比，暴露于内毒素的组表现出炎症生物标志物（TNF-α和 IL-6细胞因子）增加 (p≤ 0.05)（图 1C，D）。与内毒素组相比，补充维生素C有助于显着减少促炎生物标志物，但不会恢复到对照水平。

3.2.组织学检查 

来自对照组的心肌细胞被横纹化并组织成线性阵列，具有嗜酸性细胞质、精确的分支模式（片状）和中心的椭圆形细胞核，一层薄薄的结缔组织将它们与成熟的心脏毛细血管隔开（图 2A)。

图2.所有组心脏结构的组织病理学评估 (400×)。

对照组(A)显示位于中心的细胞核 (N)、带有条纹的分支细胞质网络(S)和肌肉纤维(ICS)之间的脆弱结缔组织，毛细血管很少(C)。内毒素组（B）表现出更明显的改变，其中大部分心肌纤维条纹（S）具有解体和碎裂，核外周化增加和固缩（N）以及肌浆空泡化。显示间质空间(ICS)增加，毛细血管(BV)充血和扩张，以及单细胞浸润（箭头）。内毒素加维生素C处理组(C)显示心肌细胞条纹(S)、最小间质间隙(ICS)和毛细血管充血减少的近似正常组织学外观。仍然可以看到一些固缩核 (N)。内毒素损伤的心肌细胞紊乱、退化、紊乱，并有不同程度的肥大。在大多数肌细胞中，细胞核是固缩的，并被核周胞质空泡和苍白嗜酸性肌浆包围。充血、扩张、扩张的毛细血管被纤维间包裹。还检测到血管周围空间中单核细胞的细胞浸润、出血和间质水肿（图 2B）。VitC组内毒素炎症、肌坏死、水肿、红细胞外渗较少，心肌损伤百分比最低。在某些区域发现了许多组织良好的肌纤维，其中央有泡状细胞核，但少数具有外周黑色细胞核和略微稀疏的细胞质。血管完好无损；然而，肌肉纤维之间存在一些变化（图 2C）。

3.3透射电子显微镜(TEM)分析 

对照组的心室肌细胞在椎间盘(ICD)处呈分支、横纹状并相连。肌原纤维在肌节内以规则的模式排列在带（Z和H）之间。ICD 的指状褶皱会定期重复。在交错处有筋膜粘附物、斑点桥粒和缝隙连接（连接）。此外，观察到均匀分散的线粒体是与肌节长度相关的链状结构。线粒体是椭圆形的细胞器，具有横向取向的嵴和相对电子致密的基质，沿着心肌细胞中的肌原纤维形成簇。心室肌细胞核常染色质，染色质均匀、疏松且呈粗颗粒状。在核膜的内表面也观察到一层致密的染色质团块。澄清了具有由毛细血管组成的规则细胞核的简单鳞状内皮细胞。通过重叠和附着，内皮细胞产生血管腔（图 3A、B、图 4A 和图 5A）。

图3.所有组心脏结构的TEM显微照片。

对照组(A, B)显示正常的心肌条纹结构，线粒体(m)完整性保存完好。保留的细胞核 (N) 具有正常分布的染色质和核包膜、富含完整肌原纤维的细胞质和具有明显（Z和H）条带的条纹图案。内毒素组(C,D)表现出肿胀的线粒体(m)，嵴杂乱无章，呈絮状密度沉积，线粒体外膜缺陷，肌原纤维破裂，肌肉 (Z和H)带紊乱。还观察到核包膜的分解、成团染色质在细胞核(N) 中的随机分散和间质性标记空间(*)。

图4.所有组的插盘的TEM显微照片。

对照组(A)显示具有丰富细胞质和健康肌原纤维的健康心肌细胞，以及具有清晰（Z和H）条带和未受损线粒体的条纹图案（m）。还可以看到具有特征性筋膜粘附(FA)、桥粒(D)和间隙（连接）连接(N)的椎间盘。内毒素组(B)表现出无组织的肌原纤维细胞质，具有肌肉（Z和H）带损伤和多形性线粒体（m）。还注意到具有明显破坏其成分（筋膜粘附 (FA)、桥粒 (D) 和间隙连接 (Nexus) (N)）的损坏的椎间盘。内毒素加维生素 C 组(C)显示完整的肌原纤维、带条纹图案的清晰（Z和H）条带、线粒体(m)和层间盘（筋膜粘附 (FA)、桥粒(D)和间隙（连接）连接（N))也被评估。

图5.所有组的线粒体、Z带和H带以及内皮细胞的TEM显微照片。

对照组 (A) 显示正常的心肌条纹结构，具有保存完好的线粒体(m)完整性。在密集的细胞质中发现具有横纹图案和明显条带（Z和H）的健康肌原纤维，毛细血管由简单的鳞状内皮细胞(En)及其细胞核(N)组成。内皮细胞通过重叠连接形成血管腔(Lu)。内毒素组(B)显示线粒体增大(m)，毛细血管变形更多，内皮细胞变形(En)，肌原纤维紊乱，肌带(Z和H) 排列紊乱，形成血管腔(Lu)，其不规则细胞核(N)).请注意，可以看到胶原纤维(CF)的沉积。内毒素加维生素C组(C) 揭示了具有保存完好的完整性的典型结构和透明条带的条纹图案（Z和H）、保存的线粒体（m）、完整的毛细血管和形成血管腔的正常内皮细胞（En）（Lu ) 和一个健康的细胞核(N)。

内毒素组的 TEM 显微照片显示特定心室心肌细胞受到广泛损伤（图 6A）；还有一些肌原纤维变细和破裂。此外，具有筋膜粘附、桥粒和间隙连接的ICD（图6B）随意分布在组织上，主要在粘附连接附近，具有相对维持的桥粒细胞间通讯和退行性线粒体改变（图3B、图 4B和图6C）).大多数肌肉细胞的线粒体内膜扩张，导致嵴碎裂。核膜的分解导致了聚集的异染色质的产生，这些异染色质随机分布在受损的细胞核中。观察到较小的空泡和间质间隙。血管腔的内皮细胞受伤，细胞核碎片不规则，胶原纤维沉积（图3C、D、图4B、图5B 和图6D）。

图 6. TEM 心脏、线粒体、毛细血管内皮损伤的百分比。

维生素C可防止内毒素诱导的心肌细胞 (A)、椎间盘 (B)、线粒体 (C) 和毛细血管内皮细胞(D)受损。*p<0.05与对照组相比，*** p <0.05与内毒素组相比。

与内毒素组相比，内毒素加维生素C组表现出改善，心肌纤维再生。肌细胞核呈现椭圆形常染色质，ICD和间隙连接的超微结构得以保留，叉指结构完整，筋膜贴壁。只有一些线粒体似乎增大了大小和形状的变化，这与部分破坏的嵴相关，而几乎所有的线粒体都保持了完整的嵴和致密基质。有完整的毛细血管，典型的内皮细胞形成血管腔和健康的细胞核（图3E、F、图4C 和图5C）。在图6A–D中，心肌细胞、ICD、线粒体和毛细血管内皮细胞表现出损伤减少百分比。

3.4心脏损伤、氧化应激和促炎生物标志物之间的相关性 

作者探索了心肌细胞组织损伤与心肌细胞中氧化和促炎生物标志物浓度之间的相关性，以了解 LPS 诱导的组织损伤的发病机制与这些生物标志物之间是否存在相关性，并确定Vit C之间是否存在联系对LPS诱导的心肌病的保护作用（图7和图8）。心肌细胞评分确定与 SOD (r=0.7；p <0.008)呈负相关，而 MDA (r=0.8；p < 0.001)、IL-6 (r=0.9；p <0.001) 和 TNF-α (r=0.8；p< 0.001) 显示出显着的正相关性。

图7.心肌细胞与氧化应激和炎症生物标志物之间的相关性。

在所有大鼠组中估计心脏匀浆的 MDA、SOD、IL-6和TNF-α水平。心肌细胞损伤百分比与氧化应激生物标志物（MDA和SOD）之间的相关性分别显示在（A，B）中，（C，D）分别报道了心肌细胞损伤百分比与促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）之间的相关性。

图8.心肌细胞间盘(ICD)与氧化应激和炎症生物标志物之间的相关性。

计算所有大鼠组的MDA、SOD、IL-6和TNF-α心脏匀浆水平。ICD损伤百分比与氧化应激生物标志物（MDA和SOD）之间的相关性分别显示在（A，B）中。ICD损伤百分比与促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）之间的相关性已分别在(C,D)中得到证实。

4.讨论 

我们使用组织学、超微结构和氧化/抗氧化特征研究了Vit C在大鼠模型中预防内毒素血症引起的心脏损伤的作用。我们的结果显示，在内毒素组中，MDA（脂质过氧化的指标）增加，抗氧化酶SOD减少。活性氧(ROS)生成的增加归因于氧化应激(OxS)和抗氧化酶的减少。抗氧化酶的数量或活性下降导致ROS增加，从而造成氧化组织损伤。

内毒素促进心脏损伤的过程被认为是由于心脏组织中抗氧化酶活性的降低。此外，活性氧(ROS)升高会增强糖基化终产物的合成并引发心脏损伤。

氧化应激和促炎细胞因子水平升高可能会对细胞膜造成相当大的损害。一项关于该主题的研究支持了这一点，它揭示了内毒素组心脏组织匀浆中Il-6和TNF-α的增加。这可以解释为什么内毒素组的心脏超微结构受损。

我们发现，将维生素C给予内毒素组可以保护大鼠免受氧化应激和炎症生物标志物增加的影响，这解释了为什么这种抗氧化剂有助于防止内毒素血症引起的结构性心脏变化。

对内毒素血症大鼠的心脏标本进行组织学检查，均显示出病理表现。真正可见的变化是细胞间空间的显着扩大和心脏结构的重组，这支持了先前的研究，该研究报告了由于内毒素血症导致的心肌间质组织扩大，这与更多结缔组织元素（尤其是胶原纤维）的存在有关，并且与肌肉损伤的严重程度有关。内毒素血症随后导致大量心肌细胞水肿和肌丝退化。根据我们现有的数据，内毒素血症引起的心脏损伤在Vit C预处理中得到改善，表现为肌肉坏死和水肿减少以及炎症最小化。一些视野显示一些肌纤维，在许多视野中都可以看到周围略微稀疏的细胞核，而其他视野则显示组织良好的肌纤维和中央空泡状细胞核。

根据我们的 TEM 发现，内毒素血症大鼠心肌细胞的肌原纤维同样受损。此外，某些肌细胞以模糊的 Z 线形式显示出条纹缺失；A带和H区几乎看不见，并且插入的圆盘的独特形状也消失了。坏死肌肉中钙诱导蛋白酶的激活可能导致肌原纤维分解。

线粒体是各种生理活动所必需的，包括维持导致广泛心血管疾病发展的促氧化和抗氧化机制。此外，线粒体负责通过控制氧气和营养物质来产生能量、指导细胞代谢和细胞凋亡随着细胞色素C细胞质部分的减少，以及线粒体细胞色素C易位的减少，产生线粒体改变.增加的线粒体硝基酪氨酸合成也被用来指示NO相关的心肌细胞损伤。相反，NO与细胞毒性有关，因为它已被证明会破坏线粒体呼吸链酶并触发线粒体诱导的细胞凋亡。线粒体酶活性的变化归因于线粒体大小的变化和每个线粒体的嵴。在内毒素血症组中，我们的研究结果显示线粒体的内膜扩大，导致嵴碎裂。相比之下，对内毒素血症组施用Vit C显示大多数线粒体中的致密基质和完整嵴得以维持。但也有少数肿胀，结构和大小不规则，部分破损。

我们目前的研究表明，内毒素血症心肌细胞的细胞核表现出不同程度的染色质密度损失和核裂解。还观察到核膜内陷和染色质结块。心肌细胞破坏及其线粒体成分导致核周水肿。心脏缺血导致染色质聚集和细胞核收缩的证据证实了这一点；这会导致心肌细胞坏死。内毒素组有畸形的内皮细胞，它们构成了血管腔。我们的研究结果表明，根据早期研究，心脏脉管系统中的毛细血管损伤可以解释肌原纤维解体。

在这项研究中，维生素C通过改善心肌细胞、ICD、内皮细胞和线粒体等心脏超微结构来防止内毒素引起的心脏损伤。这可能是由于抑制了氧化应激细胞因子的产生，这与之前的研究一致，表明较高的氧化应激与增加的细胞因子产生有关。

此外，我们的研究结果揭示了心脏结构损伤、氧化应激生物标志物（SOD和MDA）和促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）之间的显着相关性，这意味着内毒素血症引起的心脏损伤的病理生理学与这些参数并证实VitC 可以防止LPS引起的大鼠心脏损伤。这项研究显示了内毒素、氧化应激、炎症生物标志物和心脏损伤之间的联系，其中抗氧化剂(VitC)在动物模型中改变了心肌病的病程。抗氧化剂可能产生的有益作用可能会为用于 LPS 引起的心脏损伤的二级预防措施范围提供新的补充。由于LPS没有明确作用于心脏桁架，我们打算扩展我们的研究以评估VitC对LPS引起的肺、肝和肾损伤的影响。

研究限制

尽管有这些发现，但这项研究仍有许多局限性。我们的数据仍然是观察性的，这是必不可少的。此外，基于这些发现，目前尚不清楚用 Vit C 预处理内毒素处理的大鼠以保护它们免受LPS诱导的心脏损伤的上游机制。但是，强烈建议使用剂量反应曲线进行更多研究。确定调节炎症的替代途径、心脏功能和心力衰竭标志物的测量也可能是未来研究的一个有前途的领域。最后，本研究仅关注维生素C预防LPS引起的心脏损伤的能力的预处理。然而，在不同的时间间隔检查这种对心脏功能的影响和所有评估的标志物可能会提供更多信息。此外，这项研究仅表明维生素C对脂多糖诱导的心脏损伤具有潜在的保护作用。然而，没有人会预料到内毒素血症并开始服用VitC。Vit C防止LPS对其他器官（如肝脏、肺和肾脏）造成损害的能力未在本研究中进行研究，但将纳入进一步研究。

5.结论 

根据我们的研究结果，通过降低脂质过氧化作用和增加抗氧化酶，减少氧化应激和损害心脏结构的炎症生物标志物的产生，对内毒素处理的大鼠施用VitC可保护它们免受LPS诱导的心脏损伤。

述评：

脓毒症是指由感染引起宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。尽管脓毒症的治疗取得了重大进展，但它仍然是全球危重患者死亡的最常见原因。脓毒性心肌病或脓毒症相关心肌抑制，是脓毒症患者出现的与心肌缺血无关的急性心功能障碍综合征。维生素C作为一种高效抗氧化剂较其他抗氧化剂更具优势，既往研究已证实血液循环中足量的维生素C可中和100%的氧自由基可以有效降低氧化应激反应减轻组织损伤并促进组织修复。国内学者研究发现其在缺血再灌注损伤及严重感染后心肌保护方面具有显著作用。但维生素C在脓毒症心肌损伤保护作用方面的研究报道罕见。综合以上，维生素C对脓毒症后早期心肌损伤具有一定的保护作用这种作用的机制可能与其减轻脓毒症后氧化应激反应相关。后续可以深入研究此类机制，为患者创造更大的福音。 

翻译：杨丹平

校对/润色：陈霞霞/木塔里甫

评述：肖东

原始文献：Ayed A. Shati,   Mohamed Samir A. Zaki   ,   Youssef‍ ‍A.Alqahtani   .et.   Antioxidant Activity of Vitamin C against LPS-Induced Septic Cardiomyopathy by Down-Regulation of Oxidative Stress and Inflammation.Curr Issues Mol Biol.2022 May 23;44(5):2387-2400.doi: 10.3390/cimb44050163.  

（仅供医学专业人士参考）

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