“枸橼特”论坛（3）：肾结石蛋白质组学：更新和展望

肾结石病的主要问题是其患病率的增加和全球几乎所有地区去除结石后的高复发率。尽管过去做出了巨大努力，但其致病机制仍不清楚，需要进一步阐明。因此，蛋白质组学已成为在细胞，亚细胞，分子，组织和整个生物体水平上揭示这种复杂疾病机制的重要工具。

覆盖领域

本综述简要概述了肾结石疾病，然后更新了蛋白质组学，用于研究尿结石调节剂、基质蛋白、细胞对不同类型/剂量的草酸钙 （CaOx） 晶体的反应、性激素和其他刺激、晶体-细胞相互作用、晶体受体、分泌组和细胞外囊泡 （EV），所有这些都有助于更好地了解疾病机制。最后，讨论了未来的挑战以及将这些获得的数据转化为临床。

专家意见

尿液蛋白质组学知识有助于探索重要的结石调节剂（抑制剂或启动剂），有助于早期发现无症状病例，及时预防症状、并发症和新结石形成。此外，这些调节剂可能在未来作为新的治疗靶点，通过药物或其他干预手段成功治疗和预防肾结石疾病。

1. 简介

肾结石病（肾结石或尿石症）是由主要由草酸钙 （CaOx） 晶体组成的固体块沉积在肾脏或泌尿道内引起的。随着患病率和发病率的增加，它仍然是全球几个国家的医疗保健负担[引文1–4].这种疾病的另一个主要问题是结石切除后复发率高[引文5].因此，以前的几项研究试图解决这种疾病的病理生理机制，旨在改善治疗和预防。尿和肾结石是研究组合物及其在肾结石病中相关病理和病因作用的重要标本[引文6,引文7].一些分子，无论是小化合物还是大分子（即蛋白质、糖胺聚糖（GAGs）），已在尿液和结石基质中鉴定出来，并被认为参与结石形成过程[引文6,引文7].已经进行了几项使用各种细胞系的体外细胞研究，以探索潜在的细胞机制[引文8,引文9].此外，还引入了体外晶体测定法，以进一步确定可能与肾结石形成相关的那些分子的晶体调节活性[引文10–13].然而，这些早期研究的规模和范围仅限于少数具有一些先前信息的特定化合物或感兴趣的分子。

在过去的几十年中，蛋白质组学已被引入用于研究各种疾病的发病机制[引文14–16].蛋白质组学是一种强大的高通量技术，可以同时检测生物样品中大量蛋白质。它已被广泛用于研究肾组织、细胞和尿液中蛋白质在几种肾脏疾病中的功能相关性，例如糖尿病肾病[引文17]，狼疮性肾炎[引文18]，肾小球肾炎[引文19]和慢性肾脏病 （CKD） [引文20].此外，尿蛋白质组学已被应用于多种肾脏疾病的生物标志物发现，而肾活检蛋白质组学已用于许多肾脏疾病的区分和分类，包括淀粉样变性[引文21,引文22].毫无疑问，蛋白质组学技术在肾结石研究中产生了很大的影响，以研究参与肾结石形成的蛋白质和相关途径。与其他领域一样，预计应用于肾结石研究的基于蛋白质组学的方法得出的数据可以转化为临床[引文23,引文24].

在PubMed上使用关键词（“蛋白质组学”或“蛋白质组”或“蛋白质组”）和（“肾结石”或“肾结石”或“钙结石”或“肾结石”或“尿石症”或“草酸钙”或“肾结石”或“肾结石”）的初始文献检索中，共发现了290篇文章（截至2021年50月）。在排除非原创文章、删除冗余条目、排除不相关的出版物以及无法全文访问或以英语以外语言发表的出版物后，本综述共纳入了1篇原创文章（ 图2 ）。它提供了尿液调节剂、结石基质蛋白、晶体-细胞相互作用、晶体受体、分泌组和细胞外囊泡 （EV） 的蛋白质组学研究的最新信息，所有这些都有助于更好地了解疾病机制（ 图 <> ）。最后，讨论了将这些获得的数据转化为临床。

图1. 检索本综述文献的纳入和排除标准流程图

图2. 与本综述内容相关的肾结石形成机制示意图摘要

二、肾结石病概述

肾结石病在男性中比在女性中更常见[引文1–4].然而，在过去十年中，性别差距变得更加缩小[引文2,引文25].病程可以从偶然发现或无症状到严重症状和并发症（例如肾绞痛、血尿、肾盂肾炎、尿路梗阻）。肾结石病也是众所周知的 CKD 危险因素，最终可能导致终末期肾病 （ESKD） [引文26,引文27].这种疾病的诊断通常依赖于影像学检查（例如计算机断层扫描），以及来自病史和血液/泌尿特征的额外信息[引文28].

已经建立了几种结石消除方法，从药物治疗（例如使用药物促进结石自发排出的药物排出疗法）到手术切除（例如体外冲击波碎石术、输尿管镜取石术、经皮肾镜取石术）[引文29,引文30].手术切除方法的类型取决于疾病的严重程度，并取决于结石类型、位置、大小和相关并发症（如果有的话）[引文29,引文30].然而，结石复发率相当高，并且在随后的发作中增加，在第四次或更高发作后从大约 3% 增加到 >17% [引文31].由于这些原因，这种疾病在直接（例如诊断和管理）和间接（例如收入损失和收入能力下降）成本方面的经济负担并不微妙[引文32,引文33].

CaOx是最主要的肾结石类型，见于约80%的结石形成者（携带肾结石的患者）[引文7,引文34,引文35].CaOx结石的晶体组成包括CaOx一水合物（COM）和/或CaOx二水合物（COD）晶体[引文7,引文34,引文35].CaOx肾结石主要在肾小管腔内或肾间质外（肾间质处）启动。在肾小管内，结晶成分由于肾小管液中离子的过饱和而结晶[引文36,引文37].微小的晶体可以粘附在肾上皮细胞的顶端表面，这一过程由细胞损伤促进[引文36–38].此外，游离晶体可以进一步生长和自我聚集[引文36,引文39,引文40].当它们的大小足够大时，它们不能通过肾小管腔，然后卡在肾小管段内[引文36].然后，沉积的晶体充当进一步扩大的病灶，宝石开始形成。对于间质机制，磷酸钙（CaP）的过饱和度在间质隔室内很常见，导致斑块的形成，即兰德尔鼠疫[引文41,引文42].与炎症反应一起，一些斑块侵蚀到尿腔或骨盆，在那里它们暴露于过饱和钙和草酸根离子[引文41,引文42].然后，兰德尔的斑块作为CaOx晶体沉积和形成石头的病灶[引文42–44].

3. 尿蛋白质组学识别肾结石调节剂

根据蛋白质组学数据，正常尿蛋白的原始来源主要来源于肾细胞（~70%）和血浆滤液（~30%）[引文45–47].来自健康个体的一些尿蛋白被归类为肾结石形成的抑制剂[引文48].在之前使用基于质谱 （MS） 的分析的研究中，基质辅助激光解吸/电离飞行时间 （MALDI-TOF） MS 和电喷雾电离-四极杆飞行时间串联 MS （ESI-Q-TOF MS/MS），以及 CaOx 晶体生长测定，阴离子尿蛋白尿三叶因子 1 （TFF1） 被鉴定为一种新型有效的肾结石抑制蛋白 [引文49].使用DEAE（二乙氨基乙基）吸附从健康个体的尿液中分离该抑制剂，然后进行HiLoad 16/60 Superdex 75凝胶过滤[引文49].尽管纯化的蛋白质组分中的蛋白质浓度最低，但TFF1对CaOx晶体生长表现出最高的抑制活性[引文49].随后的一项功能研究还发现，TFF1除了作为晶体生长抑制剂外，还具有抑制CaOx晶体聚集的能力[引文50].由于GAG（例如肝素）具有结石抑制活性，因此使用亲和纯化方法从正常尿液中纯化肝素结合蛋白[引文51].MS/MS 分析>从纯化的部分 [引文51].这组肝素结合蛋白也被提出来调节CaOx肾结石的形成。在正常尿液中发现肾结石抑制剂可以解释为什么结石不会在正常肾脏中发展。

另一方面，被困在结石基质内的尿蛋白被认为主要作为结石促进剂。液相色谱（LC）与MS/MS偶联用于鉴定掺入CaOx晶格中的尿蛋白[引文52].有趣的是，COM晶体掺入蛋白的身份与COD晶体掺入的蛋白质的身份略有不同，只有少数常见蛋白[引文52].此外，将结石形成者的尿液和结石基质的蛋白质组谱与正常尿液蛋白质组谱进行比较，发现S100A8和纤连蛋白仅在患者的尿液和结石基质中发现，而在健康尿液中未发现，这表明它们在肾结石形成中的关键作用[引文52].

在使用无标记定量蛋白质组学的另一种方法中，先前的一项研究表明，与正常尿液相比，铜蓝蛋白在结石形成者的尿液中增加了 >2 倍 [引文53].体外结晶测定结果表明，铜蓝蛋白以剂量依赖性方式促进CaOx结晶的活性[引文53].然而，高丰度调节蛋白（例如白蛋白、比孔蛋白和尿调蛋白）的丰度水平没有显著差异[引文54].亚集分析表明，两组样品之间阴离子和阳离子蛋白的相对数量不同。与正常尿液相比，结石形成者尿液中等电点（pI）>6.5的阳离子蛋白数量显著增加[引文54].这一发现表明尿蛋白的离子移位可能与蛋白质聚集和晶体聚集的风险增加有关[引文54].

尿蛋白质组的改变也用于研究抗成石剂的保护机制。接受石灰粉方案的个体尿结石危险因素降低，体外检查显示石灰粉的COM晶体生长抑制活性[引文55].采用基于MS/MS的无标记定量分析，研究接受石灰粉6个月与接受安慰剂的结石形成者的尿蛋白组成[引文56].石灰粉处理诱导的蛋白质有17种显著改变（16种减少，只有<>种蛋白质增加）。减少的蛋白质主要参与免疫，炎症和纤维化，这意味着石灰粉在免疫反应，抗炎和抗纤维化过程中发挥作用[引文56].有趣的是，治疗后唯一一种水平升高的蛋白质是尿调蛋白，它之前已被报道为结石抑制剂[引文57].因此，石灰粉可能会触发尿路中的防御机制，以防止COM结晶和生长。

此外，还利用蛋白质组学方法研究了常见尿微生物在肾结石形成中的致病作用。Tavichakorntrakool et al.[引文58]表征从结石形成者的导尿尿液样本以及结石基质的皮质和病灶中分离的细菌，以研究尿路感染（UTI）与肾结石形成之间关联的机制。此后，使用2D-PAGE然后使用nanoLC-MS / MS [ 引文59].与尿液来源的细菌相比，病灶来源的细菌有五种水平较低的蛋白质参与碳水化合物和DNA/蛋白质代谢，而两种水平较高的蛋白质参与应激反应。有趣的是，大肠杆菌的差异细胞蛋白质组伴随着一些表型差异[引文59].此外，将从结石形成者尿液中分离的大肠杆菌与从无结石的UTI患者中分离的大肠杆菌进行比较[引文60].基于凝胶的蛋白质组学鉴定了九种差异表达的蛋白质。其中，伸长因子-Tu（EF-Tu）是最丰富的蛋白质，从结石形成者尿液中分离的大肠杆菌中的水平高出2倍[引文60].本研究还证明了细菌EF-Tu对肾结石形成的促进作用。无细胞透化的免疫荧光染色显示，与未结石的UTI患者相比，从结石形成者尿液中分离的大肠杆菌表面EF-Tu表达水平更高。此外，取自结石形成者尿液的细菌外膜囊泡（OMV）对CaOx结晶、生长和聚集的促进活性显著大于从无结石UTI患者中分离的细菌OMV。有趣的是，这些促进作用可以通过使用特异性抗EF-Tu抗体中和来改善，从而加强大肠杆菌EF-Tu对CaOx肾结石形成过程的促进作用[引文60].

4. 结石基质的蛋白质组学

以前，结石基质蛋白的分析是使用 2D-PAGE [引文61]或SDS-PAGE，然后对已知尿蛋白进行免疫印迹[引文62].2008年，陈等.[引文63]应用蛋白质组学表征石头基质蛋白质组。研磨10例患者采集的CaOx结石，使用含有5%β巯基乙醇和2%SDS的提取缓冲液从石粉中提取结石基质蛋白[引文63].提取的蛋白质的SDS-PAGE仅发现分子大小约为10，14和27 kDa的三个蛋白质条带。基于 MS 的分析共鉴定出 11 种蛋白质（10 种来自 14 kDa 条带，27 种来自 <> kDa 条带，<> 种来自 <> kDa 条带）[引文63].这些低分子量蛋白主要是钙结合蛋白（如S100蛋白和钙粒蛋白）和免疫细胞相关蛋白（如白细胞弹性蛋白前体和中性粒细胞防御素3前体）[引文63].

基于蛋白质组学的结石基质蛋白鉴定以及使用生物信息学工具的基因本体分类表明，大多数结石基质蛋白参与炎症过程[引文64,引文65].Witzmann等人在2016年报道了一组非常大的CaOx结石基质蛋白。[引文66].无标记定量蛋白质组学揭示了总共1，059种被鉴定和定量的蛋白质。这些蛋白质参与多种病理过程，包括免疫反应、炎症、损伤和组织修复[引文66].另一项研究采用自上而下和自下而上的方法鉴定来自不同结石类型的结石基质蛋白[引文67].鉴定出142种蛋白质，其中21种来自自上而下，133种来自自下而上的方法（请注意，12种是重叠的）。主要组成包括中性粒细胞防御素1、蛋白S100-A8和S100-A9，它们与炎症反应有关[引文67].此外，使用强阳离子交换柱[引文68]或强阴离子交换柱[引文69]随后的CaOx晶体测定以及基于蛋白质组学的蛋白质鉴定揭示了表现出抗成石活性的结石基质蛋白。该方法还揭示了七种新型结石基质蛋白，它们在结晶抑制中起作用[引文70].

最近，使用无标记光谱计数MS / MS对CaOx结石基质蛋白进行了另一种蛋白质组分析[引文71].将相对蛋白质丰度与之前报道的结石形成者尿蛋白质组的蛋白质丰度进行比较[引文54].数据显示，高丰度尿蛋白（如白蛋白和尿调蛋白）在结石基质中的丰度相对较低，这意味着它们被非选择性地掺入结石基质中[引文71].有趣的是，五种蛋白质（包括血红蛋白β链、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2、骨桥蛋白、凝血酶原和维生素K依赖性蛋白Z）在结石基质中显示出高度相对丰度或富集。此外，数据还表明，高阴离子（pI < 5）和高阳离子（pI > 9）蛋白质在结石基质中富集[引文71].这些数据表明这些蛋白质选择性地掺入结石基质中。它们可能在肾结石形成中起主要作用。请注意，蛋白质组成的种类和数量被认为在单个结石之间变化很大[引文72].

5. 肾细胞蛋白质组学，以确定肾结石形成的潜在机制

5.1. 不同类型和剂量的CaOx晶体对各种肾小管细胞的影响

细胞蛋白质组改变的信息有利于研究可能导致发现治疗或保护策略的疾病病理学机制。在肾结石研究中，报道了COM晶体暴露对远端肾小管上皮细胞（MDCK细胞）细胞蛋白质组的影响[引文73,引文74].在无毒剂量（100μg晶体/ ml培养基）下，细胞在暴露于晶体48小时后没有细胞毒性或死亡的迹象[引文73].2D-PAGE随后的Sypro Ruby荧光染色显示20种蛋白质发生显着改变（15种增加的蛋白质和5种减少的蛋白质）响应于COM晶体暴露。Q-TOF MS 和 MS/MS 鉴定表明，COM 晶体诱导载体蛋白、伴侣、代谢酶、结构蛋白、RNA 结合蛋白以及参与 DNA 复制、转录、信号转导、蛋白质生物合成和生长调节的蛋白质的改变 [引文73].在较高剂量（1，000μg/ml）下，显示出明显的细胞毒性作用[引文74].通过 Q-TOF MS 和 MS/MS 分析共鉴定出 50 种显著改变的蛋白质。有趣的是，受COM诱导的细胞毒性影响的改变蛋白中最常见的类别是代谢酶和细胞结构蛋白[引文74].这些差异表达的蛋白质进一步放入蛋白质-蛋白质相互作用网络分析[引文75].结果表明，细胞毒性剂量的COM晶体诱导蛋白质的改变，这些蛋白质主要参与细胞完整性，连接复合物，细胞增殖，伤口愈合，氧化应激和线粒体功能[引文75].功能验证发现，COM诱导的细胞毒性伴有细胞内ATP产生的增强，紧密连接完整性缺陷和伤口愈合活性缺陷[引文75].

蛋白质组学还用于研究2 mM草酸盐和2 μg/ml COM晶体对损伤近端肾小管上皮细胞（HK-200细胞）的蛋白质组变化[引文76].2D-PAGE随后进行LC-ESI MS/MS显示<>种增加和<>种减少的蛋白质，它们在能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质合成、细胞运动和钙中发挥作用。2+通道调节 [引文76].最近，采用基于串联质量标签（TMT）的定量蛋白质组学结合生物信息学分析，获得了暴露于肾结石粉碎的粉末状COM晶体的HK-2细胞的蛋白质组变化[引文77].数据显示，1，141 种差异表达的蛋白质通常在调节肌动蛋白细胞骨架组装、紧密连接和粘附中发挥作用 [引文77].有趣的是，人肾结石基质蛋白可以预防COM晶体暴露引起的肾细胞损伤[引文70].用COM晶体处理的肾细胞的相对和绝对定量（iTRAQ）分析的同量异位标签显示12种上调蛋白，主要参与细胞粘附，41种下调蛋白，其中大多数参与炎症反应[引文70].然而，这些蛋白质的改变水平受到与结石基质蛋白共处理的影响[引文70].结石基质蛋白保护作用的机制仍然未知，值得进一步阐明。

除细胞蛋白质组外，还研究了受COM晶体影响的亚细胞蛋白质组。Chaiyarit等人研究了暴露于非细胞毒性剂量COM晶体的MDCK细胞线粒体蛋白质组的变化。[引文78].在这项研究中，使用差速离心技术分离线粒体。通过2D-PAGE鉴定了<>种显著改变的线粒体蛋白，然后进行Q-TOF MS和MS / MS分析，包括有助于代谢，细胞结构，细胞周期调节，离子转运和信号转导的线粒体蛋白。此外，功能分析证实COM晶体增强了线粒体蛋白的氧化修饰[引文78].

对于COD晶体的反应，来自暴露于2μg/ ml晶体的肾上皮细胞的细胞蛋白的100D-PAGE显示11种显着改变的蛋白质（5种减少的蛋白质和6种增加的蛋白质）[引文79].Q-TOF MS和MS / MS鉴定了这些与代谢和细胞结构调节相关的改变蛋白[引文79].除了这些改变的蛋白质外，还表征了COD晶体诱导的糖蛋白水平的变化[引文80].在后一项研究中，细胞蛋白被2D-PAGE分离。SYPRO Ruby荧光染料用于总蛋白染色，而Pro-Q祖母绿荧光染料用于糖蛋白染色[引文80].有16种差异表达的糖蛋白参与了几个生物学过程。有趣的是，在维持细胞完整性方面起作用的肌动蛋白相关蛋白3（ARP3）的糖型降低，而其他三种在调节细胞间解离中起作用的蛋白质的糖型增加，表明COD晶体引起的细胞解离和削弱细胞完整性[Citation80].

随后进行了综合分析，比较了由COM与COD晶体以及低剂量（100μg/ ml）与高剂量（1000μg/ ml）引起的MDCK细胞细胞蛋白质组数据集的变化[引文81].数据显示，COM晶体比COD晶体引起更大的变化，高剂量改变的蛋白质数量比相同晶型的低剂量[引文81].有趣的是，组间差异表达有一些重叠，但在所有条件下都没有发现共同的改变蛋白，表明对晶体种类和剂量的特异性反应[引文81].

5.2. 高钙尿症和高草酸尿症对CaOx肾结石形成的影响

高钙尿症和高草酸尿症被认为是CaOx肾结石病的危险因素。研究了MDCK细胞因高钙条件而改变的细胞蛋白质组谱[引文82].基于 2D-PAGE 的比较蛋白质组学研究，随后对细胞蛋白进行 MS/MS 鉴定，发现 20 mM CaCl 诱导的 20 种蛋白质显著改变2治疗72小时[引文82].这些改变的蛋白质参与了各种生物过程，包括钙结合。其中，膜联蛋白A1（一种已知的钙结合蛋白）的增加与COM晶体细胞粘附的增加有关[引文82].类似地，来源于MDCK细胞的细胞蛋白的2D-PAGE在20mM Na中孵育2C2O4-含培养基72小时，与对照相比，显示14种差异表达的蛋白质[引文83].其中，α-烯醇化酶表达的增加有助于COM晶体细胞粘附的增加。此外，这些显著改变的蛋白质与对压力的反应、能量产生以及代谢和转录的调节有关[引文83].

5.3. 高尿酸尿症与CaOx肾结石病之间的关联

通过研究肾上皮细胞蛋白质组对高剂量尿酸的改变来研究高尿酸与CaOx肾结石形成的关联[引文84].将细胞在22.3mM含尿酸的培养基中孵育后，5种蛋白质的水平发生变化。尿酸处理引起的蛋白质改变伴随着COM晶体细胞粘附，细胞迁移活性和细胞内ATP产生的增加[引文84].有趣的是，尿酸诱导的热休克蛋白（HSP）70 kDa（HSP70）和HSP90在顶膜部分的上调导致细胞COM晶体结合能力的增加，该细胞可能被HSP70和HSP90的特异性抗体阻断[引文84].这些数据加强了高尿酸尿症与CaOx肾结石形成之间的关系，并可能解释此类相关疾病的潜在机制。

5.4. 性激素对肾结石疾病的影响

此外，蛋白质组学被用于研究细胞对可能影响肾结石形成的激素的反应。基于男性肾结石发病率和患病率高于女性的事实，研究了肾上皮细胞对性激素反应的蛋白质组谱。来自 2 nM 睾酮处理的 MDCK 细胞的细胞蛋白的 20D-PAGE 与对照组相比，揭示了 <> 种差异表达的蛋白质 [引文85].在nanoLC-ESI-QQ-TOF MS/MS蛋白鉴定后的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析的指导下，数据表明上调的α-烯醇化酶在该模型中具有重要作用。使用晶体细胞粘附测定的功能分析表明，随着睾酮诱导的α烯醇化酶上调，细胞的COM晶体粘附能力增加，表明睾酮具有促进活性以诱导男性肾结石形成[引文85].为了证实这一机制，广泛用于睾酮相关疾病的药物非那雄胺通过减少表面α烯醇化酶的表达并最终降低COM晶体细胞粘附来改善MDCK细胞中睾酮的结石促进作用[引文86].

此外，还研究了女性性激素雌激素对MDCK细胞的影响[引文87].共观察到58种差异表达的蛋白质由20nM 17β-雌二醇处理引起一周。从蛋白质-蛋白质相互作用网络分析中检索到的数据表明，这些差异表达的蛋白质有助于结合和受体活性、代谢过程、细胞迁移和愈合。雌激素处理导致表面膜联蛋白A1和α-烯醇化酶表达降低，导致COM晶体-细胞粘附降低。此外，功能分析表明，雌激素可减少细胞内ATP的产生，促进细胞迁移和愈合，这可能是肾结石形成过程中的保护机制[引文87].

6. 晶体结合蛋白的蛋白质组学表征COM晶体受体

CaOx晶体粘附在上皮细胞表面是肾结石形成的基本步骤之一。位于肾小管上皮细胞顶端表面的与COM晶体具有结合能力的蛋白质可作为晶体受体。方恩等.[引文88]建立了剥离法，这是从上皮细胞中分离纯化顶膜的简单有效的方法。该方法导致进一步大规模鉴定潜在的COM晶体受体[引文89].将用这种剥离方法纯化的顶膜蛋白与COM晶体孵育过夜。去除未结合的蛋白后，洗脱剩余的COM晶体结合蛋白，并通过Q-TOF MS和MS / MS分析进行鉴定。在这个初始阶段，有96种蛋白质被鉴定为潜在的COM晶体受体[引文89].这些发现为随后对COM晶体受体表征的研究提供了巨大的益处。

膜联蛋白A2是被鉴定为潜在COM晶体受体的蛋白质之一[引文89].使用针对膜联蛋白A2的特异性抗体阻断细胞表面的膜联蛋白A2，通过蛋白质中和验证蛋白质组学数据，导致晶体-细胞粘附明显降低[引文89].有趣的是，膜联蛋白A1的表达在高钙条件下得到增强[引文82]但被咖啡因减少[引文90]，咖啡中的主要生物活性化合物，越来越多的证据表明可以预防肾结石的形成[引文91].随后的功能研究证实的另一种潜在的COM晶体受体是α烯醇化酶。如上所述，基于凝胶的定量蛋白质组学显示草酸盐增强α烯醇化酶表达高[引文83].通过免疫荧光染色和蛋白质印迹分析成功证实了高草酸盐诱导的细胞表面α烯醇化酶表达的增加。此外，晶体-细胞粘附测定以及使用针对α烯醇化酶的特异性抗体进行中和表明，表面α烯醇化酶的中和显着降低了肾上皮细胞的高草酸盐增强COM晶体结合能力[引文83].表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）可降低肾上皮细胞表面α烯醇化酶表达和COM晶体粘附能力[引文92]，一种常见于绿茶叶中的植物多酚，预防肾结石的证据越来越多[引文93,引文94].进一步的研究证实了α-烯醇化酶与COM的选择性结合，而不是其他类型的晶体，特别是在{121}、{100}和{010}晶体表面[引文95].

除膜联蛋白A2和α-烯醇化酶外，HSP90作为COM晶体受体的作用通过使用针对HSP90的特异性抗体进行蛋白质印迹证实[引文96].表面HSP90的中和显着降低了晶体细胞粘附以及晶体内化到肾细胞中[引文96].HSP90及其相互作用的蛋白质伴侣的表征是通过串联亲和纯化（TAP）进行，然后进行QQ-TOOF MS/MS鉴定[引文97].在该复合物中共鉴定出33种蛋白质，包括四种形式的HSP90和先前鉴定的COM晶体受体（即α-微管蛋白，β-肌动蛋白，钙蛋白酶-1，HSP70和vimentin）。使用小干扰RNA（siRNA）敲低HSP90导致这些鉴定蛋白的表达水平发生变化，并显着降低晶体细胞粘附[引文97].

此外，质膜Caa2+-ATP酶（PMCA），一种位于质膜的钙调节蛋白依赖性钙ATP酶，用于调节Ca。2+转运，已被大规模蛋白质组学研究确定为COM晶体受体[引文89].使用针对PMCA2的特异性抗体进行免疫荧光染色，在晶体与顶膜蛋白孵育后，在COM晶体表面上显示PMCA2蛋白的荧光信号，然后剧烈洗涤[引文98].此外，晶体-细胞粘附测定和晶体内化测定表明，单克隆抗PMCA2抗体阻断表面PMCA2导致粘附和内化晶体数量减少[引文98].这些数据加强了PMCA2作为肾小管细胞表面COM晶体受体的作用。

7. 各种COM晶体尺寸上结合蛋白的蛋白质组学

使用各种大小的COM晶体进行晶体-蛋白质结合测定，然后通过MS / MS分析进行蛋白质鉴定，显示COM结合蛋白的大小特异性[引文99].数据显示，晶体结合蛋白与较大的COM晶体结合时具有更多的正净电荷，相比之下，当与较小的COM晶体结合时，它们具有更多的负净电荷[引文99].与其他尺寸相比，从最大的COM晶体（长度>80μm）洗脱的晶体结合蛋白具有从先前的大规模蛋白质组学研究中鉴定出的最大数量的潜在COM晶体受体[引文89].此外，从先前的另一项大规模蛋白质组学研究中鉴定出的草酸盐结合蛋白的数量[引文100]在结合到最大COM晶体上的蛋白质集合中最大[引文99].已知COM晶体受体和草酸盐结合蛋白的最大数量可以解释大COM晶体粘附在肾小管细胞上的最大能力。此外，这些数据表明沿肾单位在不同肾小管段的细胞表面上优先或选择性地结合具有不同大小的COM晶体。

8. 分泌组和EVs的蛋白质组学用于解决肾结石疾病的炎症反应

为了解决炎症反应与肾结石疾病之间的关联，蛋白质组学被用于研究免疫细胞的蛋白质组。采用凝胶蛋白质组学检测100 μg/ml COM晶体处理后单核细胞的细胞蛋白质组变化[引文101].Q-TOF MS 和 MS/MS 分析鉴定了 22 种差异表达的蛋白质，这些蛋白质参与各种细胞过程并可能导致随后的炎症反应 [引文101].此外，相同的方法用于研究暴露于100μg/ ml COM晶体的巨噬细胞，其中鉴定出18种差异表达的蛋白质[引文102].蛋白质网络分析发现了一组上调蛋白质的相互作用，包括HSP90和β-肌动蛋白。免疫荧光染色成功证实了两种蛋白质的共定位，特别是在COM晶体周围的吞噬体膜上，表明它们在吞噬体形成中的重要作用[引文102].验证研究表明，siRNA降低HSP90的表达导致吞噬体标志物Rab5下降，同时吞噬活性降低[引文102].

随后，ELISA揭示了转化生长因子β（TGF-β）的水平升高，这是一种多效性细胞因子，在COM处理的巨噬细胞的分泌产物中[引文103].此外，使用蛋白质组学方法研究了在无血清培养基中用100μg/ ml COM晶体处理的单核细胞中分泌组的变化16 h[引文104].通过 Q-TOF MS 和 MS/MS 分析共鉴定出 18 种水平显著改变的分泌蛋白，其中 14 种增加和 4 种减少，它们在细胞结构、DNA/RNA 结合、信号转导、代谢、运输、应激反应和炎症反应中起作用[引文104].

外泌体是从细胞中释放的纳米级EV，含有各种细胞内容（例如蛋白质，RNA和DNA）[引文105,引文106].外泌体在细胞通讯、免疫反应和炎症中的作用已在几种疾病中得到广泛研究[引文105–107].辛格托等.[引文108]从COM暴露的巨噬细胞的培养上清液中分离出外泌体。基于凝胶的蛋白质组学发现六种显着改变的外泌体蛋白主要参与免疫反应，包括增加的炎性小体活化标志物，白细胞介素-1β（IL-1β）[引文108].这些COM处理的外泌体可以触发单核细胞活化，迁移和炎性细胞因子（IL-8）的产生。此外，COM处理的外泌体还刺激T细胞迁移和巨噬细胞吞噬活性[引文108].随后，应用无凝胶、无标记的定量蛋白质组学来确定暴露于COM晶体的巨噬细胞衍生的改变的外泌体蛋白[引文109].在COM处理的外泌体中检测到参与多种生物过程（包括免疫应答和细胞外基质拆解）的8种显着改变的蛋白质。功能分析证实，这些COM处理的外泌体通过增强肾细胞IL-<>的产生和激活中性粒细胞迁移而参与炎症反应。COM处理的外泌体也可能在触发COM晶体侵入肾间质中发挥作用，因为涂有来自COM暴露巨噬细胞的外泌体的COM晶体通过细胞外基质（ECM）迁移室显示晶体侵袭增加[引文109].

最近报道了来源于结石形成者和正常受试者尿液的外泌体的定量蛋白质组学[引文110].结果显示正常尿外泌体中有831种蛋白质，来自结石形成的蛋白质中有879种蛋白质。其中，两组间有67种蛋白质差异显著。使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov）数据库进行的功能富集分析发现，不同的尿外泌体蛋白主要参与先天免疫应答、对细菌的防御机制和钙结合特性[引文110].这些数据可能暗示了肾结石通过尿外泌体货物发病过程中的免疫机制和致病事件。

还研究了肾上皮细胞的分泌组。肾细胞在Transwell系统中培养成为极化上皮细胞。在无血清培养基中用100μg/ ml COM晶体孵育20小时后，收集下腔室中的上清液（定义为基底外侧分泌组）并分析[引文111].2D-PAGE随后进行Q-TOF MS/MS分析显示，六种显著改变的蛋白质被鉴定为14-3-3 ε、α-烯醇化酶、α-微管蛋白2、肌动蛋白、磷酸甘油酸变位酶-1和泛素激活酶E1。得益于先前建立的晶体侵袭测定 [引文12]，对改变的分泌蛋白，特别是通过COM处理增加的α烯醇化酶的功能验证显示，从极化肾上皮细胞的基底外侧区室分泌的改变蛋白增强了COM晶体通过ECM迁移室的侵袭和单核细胞迁移[引文111].综上所述，所有这些数据都强调了肾细胞和单核细胞/巨噬细胞分泌组和EV在肾结石病炎症反应中的重要作用。

9. 结论

据PubMed称，自2008年以来，蛋白质组学已被引入肾结石研究。此后，蛋白质组学方法已应用于肾结石疾病的几个方面（ 图2 ）。结石形成者与健康个体的尿蛋白质组谱的比较提供了肾结石形成的潜在调节剂的鉴定（见 第3节 ）。随后，已经开发并用于确认所鉴定蛋白质在结石形成过程中的调节活性。此外，还检查了治疗后尿蛋白质组谱的改变。此外，从导尿尿液中分离的细菌的蛋白质组分析已经解决了UTI在肾结石发病机制中的致病作用（见 第3节 ）。使用蛋白质组学方法结合生物信息学分析对结石基质蛋白进行表征提供了结石形成过程中细胞和细胞外过程的提示，特别是晶体调节和炎症反应（见 第4节 ）。

事实上，蛋白质组学主要用于表征模拟CaOx肾结石/尿石症条件的干预后细胞蛋白质组的改变，包括暴露于不同剂量的COM和COD晶体，高钙，高草酸盐或高尿酸环境。此外，已经检查了亚细胞蛋白质组的改变（见 第5节 ）。COM晶体结合蛋白的大规模鉴定导致了几项亚序列研究，这些亚序列研究证实了肾小管上皮细胞顶膜上的几种表面蛋白作为COM晶体受体的作用。已经做了很多努力来研究影响这些蛋白质表达的因素（见 第6 节和第 7 节）。最后，蛋白质组学方法已被应用于研究来自免疫细胞的细胞蛋白质组、分泌组和EV的改变，以解决肾结石疾病的炎症反应（见 第8节 ）。

10. 专家意见

根据本综述中总结的证据，无论方法和标本的类型如何，几组蛋白质组学数据都表明应激（特别是氧化应激）和炎症反应与肾结石疾病有关。结合细胞、亚细胞和细胞外研究的其他发现，这些数据有助于更好地了解肾结石的发病机制，并提供可能有助于将数据进一步转化为临床的教训。

与其他领域类似，蛋白质的分离和纯化方法对于后续的表达和功能分析非常重要。由于高丰度蛋白质可能会掩盖低丰度但重要蛋白质的鉴定，因此与使用整个或未分级样品相比，泌尿、结石基质和细胞蛋白的分离肯定提供更多的信息。在鉴定或表征蛋白质之前选择适当的方法来分离目标级分将有助于获得有价值和可靠的结果。迄今为止，大多数基于蛋白质组学的肾结石研究主要产生已鉴定蛋白质的表达数据，而不是它们的功能参与。因此，需要进一步的功能分析以确定其在肾结石发病机制中的作用[引文112].

生物信息学门户的最新发展和改进使研究人员能够分析肾结石蛋白质组学数据（特别是过去5年获得的数据），以便在生物信息学分析的指导下进行后续功能研究，以确定已鉴定的蛋白质在肾结石病致病机制中的可能作用[引文112].通过使用各种技术（如抗体中和、siRNA 或 shRNA 敲低以及蛋白质过表达）对蛋白质进行操作，可以进一步研究特定蛋白质的确切作用。此外，最近还建立了基于网络的肾结石调节剂集合，即StoneMod（肾结石调节器数据库）[引文113].该工具为所有寻求一站式资源的研究人员提供了一个用户友好且免费访问的数据库，以获取肾结石调节蛋白的所有必要信息[引文113].

肾结石蛋白质组学数据不断为更好地了解疾病的致病机制提供重要信息。因此，将从肾结石蛋白质组学研究中获得的这些基础研究数据转化为临床实践将是一项难以置信的挑战。成功的翻译可以改善医疗护理，特别是早期疾病诊断、肾结石分型、新发和/或复发性结石的风险评估以及预防策略。然而，仍然存在许多研究空白，需要进一步阐明才能将知识转化为临床。

根据迄今为止的可用数据，最可行的应用似乎是尿液蛋白质组学，用于探索重要的结石调节剂（抑制剂或启动剂）。获得的信息将有助于早期发现无症状病例，及时预防症状、并发症和新结石形成。此外，这些调节剂可能作为未来通过药物成功治疗和预防肾结石疾病的新治疗靶点。了解结石调节剂将有助于监测药物或膳食补充剂，以提高抑制剂的水平，同时降低启动子的水平。例如，在体外研究中观察到石灰粉的抗成石作用[引文55].随后使用基于蛋白质组学的人尿液分析的临床试验提供了支持性证据，证明接受石灰粉补充剂的患者结石抑制蛋白水平升高[引文56].

此外，基于蛋白质组学的COM晶体受体表征为药物发现提供了宝贵的信息（即阻断晶体-细胞粘附和相互作用，从而在结石开始形成之前的早期阶段消除结石病灶）。最近，蛋白质组学和其他技术已被应用于研究物质（合成化学品或纯化的天然产物）对预防肾结石的影响[引文90–94,引文114–116].与其他领域一样，肾结石疾病的体外蛋白质组学研究对于理解疾病可能具有一些有限的相关性，因为有几个混杂因素会影响人体的疾病发病机制。此外，大多数体外研究仅关注少数细胞类型，例如上皮细胞和单核细胞/巨噬细胞。然而，位于肾脏中的其他细胞类型也可以参与肾结石的发病机制。尽管这些研究大多是在体外进行的，但获得的数据非常有说服力。蛋白质组学、生物信息学和功能验证的结合将缩小实验室和临床之间的转化差距。

文章亮点

提供了肾结石病（肾结石/尿石症）的简要背景。

提供了以下方面的更新和最新进展：

尿液蛋白质组学鉴定肾结石调节剂。

石头基质的蛋白质组学。

肾细胞蛋白质组学，以确定肾结石形成的潜在机制。

晶体结合蛋白的蛋白质组学，以表征COM晶体受体。

各种COM晶体尺寸上的晶体结合蛋白的蛋白质组学。

分泌组和EV的蛋白质组学，用于解决肾结石疾病的炎症反应。

讨论了肾结石蛋白质组学的前景和未来挑战，特别是临床转化。

Peerapen P, Thongboonkerd V. Kidney stone proteomics: an update and perspectives. Expert Rev Proteomics. 2021 Jul;18(7):557-569. doi: 10.1080/14789450.2021.1962301. Epub 2021 Aug 6. PMID: 34320328.

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