使用拉曼光谱原位鉴定急性肾损伤中的未知晶体

拉曼光谱是原位生物分子评估的成熟而强大的工具。2型晶体性肾病的特征是结晶物质沉积在肾小管腔内，导致急性肾损伤快速发作，无特异性症状。及时的晶体鉴定对于其诊断、机制探索和治疗至关重要，但仍然具有挑战性。本研究旨在开发一种基于拉曼光谱的方法，以辅助2型晶体肾病的病理诊断。通过拉曼光谱法检测了来自遭受广泛烧伤的受害者的肾组织载玻片中的未知晶体，并通过将拉曼数据与已建立的数据库进行比较来确定晶体的包含。扫描多个晶体以验证晶体的原位重现性。获得了20个随机晶体的拉曼数据，并通过拉曼成像研究了晶体中物质的分布和均匀性。建立小鼠模型模拟晶体肾病，以验证拉曼光谱在冷冻活检中的可用性。人体载玻片上的所有晶体均被鉴定为草酸钙二水合物，草酸钙二水合物在单晶上的分布和含量不均匀。进一步验证拉曼光谱可用于鉴定活检标本中的草酸钙二水合物晶体。本文建立了基于拉曼光谱的石蜡包埋组织和活检标本中未知晶体的原位鉴定方法，为分析组织中未知晶体提供了一种有效且有前景的方法，并有助于临床和法医学的精确病理诊断。

关键词： 拉曼光谱， 结晶肾病， 急性肾损伤， 烧伤， 病理诊断

1. 简介

拉曼光谱是一种成熟而强大的生物分子评估工具，可提供体外和体内样品的生化信息（分子指纹图谱），无需复杂的样品制备和染色程序[1，2，3]。目前，拉曼光谱已成为一种早期诊断工具，已广泛应用于临床体外和体内研究，用于不同器官炎症性疾病和癌症的诊断，以及未标记的组织病理学和细胞学[4，5，6，7]。例如，已经建立了表面增强拉曼光谱方法来原位监测内源性硫化氢和催化过程[8，9，10]。拉曼技术在生物样品的诊断检测方面具有多种优势[11，12，13，14，15，16，17]。拉曼光谱依赖于光子与振动分子相互作用后的非弹性光散射，这些分子提供有关细胞和组织环境中重要生物成分的敏感定量和化学特异性信息。入射光子和非弹性散射光子之间的能量差与激发分子特定振动所需的能量有关。因此，具有不同化学和分子特征的生物分子（如脂质、DNA和晶体化合物）可以很容易地鉴定和定量，而无需外源性标记。这些分子指纹的变化可以提供疾病特异性信息。拉曼散射与近红外激发源兼容，可用于实时测量，这使得该技术对生物医学应用非常有益，特别是在省时的诊断方面。无需样品预处理过程，样品检测简单方便，这意味着诊断成本低，几分钟内即可获得结果。此外，对拉曼光谱条件的控制确保了无损检测，可以在不损坏生物样品的情况下获得准确的结果。因此，拉曼光谱在组织中未知成分鉴定中的应用可以成为辅助准确病理诊断的新方法，并为疾病的发病机制提供新的见解。

急性肾损伤是重度烧伤后的常见并发症，并发症发生率和死亡率分别高达30%和80%[18]。AKI易导致肾衰竭，也是MODS的早期表现[19]，导致预后不良。临床上，AKI基础病因的逆转通常是首次干预[18]。然而，由于对危险因素的认识不足，AKI的治疗在许多情况下被认为不足[20]。AKI的病因很复杂，因直接损伤肾脏或导致肾功能急性损害的因素而异[21]。晶体性肾病是由结晶物质沉积在肾血管系统、肾单位或引流尿路引起的，是AKI的病因之一[22]。晶体肾病可按肾前、肾内和肾后肾损伤的经典概念分为22个亚组[2]。在这些亚组中，23型晶体肾病起源于肾小管内快速弥漫性结晶，引起肾小管阻塞、间质炎症和肾小管细胞损伤，导致肾小管细胞坏死或凋亡[<>]。及时诊断和探索晶体肾病的机制可能有助于制定晶体引发的AKI的治疗策略。晶体材料可以通过病理检查来观察，但晶体类型的鉴定主要依靠形态学观察，这需要有经验的病理学家，并可能导致误诊。因此，开发一种快速准确的晶体鉴定方法至关重要。拉曼光谱是一种强大的工具，在靶向和监测活检方面具有巨大潜力，可以快速、无损地获得有关原位未知物体的信息。

本研究采用拉曼光谱法医病理检查，成功鉴定出一例年轻男性重度烧伤后晶体触发AKI病例肾组织载玻片原位未知晶体为草酸钙二水合物，从而揭示了AKI的潜在病因。此外，我们建立了草酸钙二水合物晶体肾病小鼠模型，该模型模拟活检以验证拉曼光谱在病理活检中的可用性。本文首次报道了拉曼光谱在组织载玻片中未知结晶物质原位鉴定中的法医应用，进一步证实了拉曼光谱也是分析活检组织中未知物质的有效方法，为临床诊断和死因尸检鉴定提供了可靠的方法和指导。

2. 材料和方法

2.1. 案例信息

补充数据中提供了临床信息（表S1）。简而言之，一名体重18.57公斤的0岁男性在遭受大面积火焰烧伤7天后因多器官衰竭（MOF）死亡。死后一天进行尸检和病理检查。

2.2. 鼠标模型

小鼠实验是根据南京医科大学实验动物研究所的指导意见设计的。所有方案均已获得南京医科大学动物护理与伦理委员会（IACUC-2107029）的批准。在南京医科大学动物研究中心以8-57g体重（BW）在恒定的环境条件下保持6只20周雄性C25 / BL23小鼠（中国上海），温度为2±55°C，湿度5±12%，12：10小时光照/黑暗循环，实验前可自由获取食物和水。小鼠用25mg / 1gBW草酸（BBI，中国上海）管饲一次，并在3小时（n = 6），3小时（n = 12），3小时（n = 24）或3小时（n = 5）后处死，其他<>只小鼠用于评估管饲后的死亡时间。

2.3. 组织处理和玻片制备

将患者的肾组织固定在10%福尔马林中，嵌入石蜡中并切成5μm载玻片。在处死小鼠并冷冻在液氮中后，小鼠的肾脏组织直接嵌入30%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）（上贡生物技术，中国上海）。然后，将冷冻块切成10μm载玻片。人和小鼠载玻片均用常规苏木精和伊红（HE）染色。在光学显微镜下观察载玻片（奥林巴斯，东京，日本）。对于拉曼成像，将石蜡和冷冻载玻片切成20μm并放置在CaF上2光盘。将石蜡载玻片用氧炔再水化20分钟3次，100%乙醇15分钟95次，15%乙醇80分钟，15%乙醇70分钟，15%乙醇<>分钟和ddH2O 15 分钟

2.4. 拉曼光谱和成像

拉曼光谱和成像在拉曼光谱仪-共聚焦拉曼显微镜（HORIBA，XploRA™ PLUS，日本京都）上进行。将包埋介质、最佳切割温度化合物（OCT）和CMC-Na置于洁净硅芯片上（中国浙江丽晶光电科技有限公司），检测参数为：激光波长785 nm，激光功率100 mW，积分时间（激光动作时间）1 s。将肾组织样品置于拉曼底材料—CaF2光盘和 CaF2光盘安装在XY载物台上。通过明场图像选择感兴趣的区域，并使用仪器控制软件自动采集组织的拉曼光谱。为了避免高荧光，我们选择了785nm的激发波长，30 mW的激光功率和5 s的光谱采集时间，以达到足够的信噪比而不会造成任何明显的组织损伤。使用1000 nm步长和每个像素1 s积分时间进行快速拉曼成像。使用Labspec 6软件进行拉曼数据分析，并根据多项式拟合减去基线以产生平坦的背景。

3. 结果

3.1. 病理发现

患者的显微镜检查显示，肾小管腔中出现具有“马耳他十字”双重折射的圆形棕色晶体和同心条纹（图1这些晶体成簇聚集或在肾小管中排列（图1B，C），特别是在远端小管和集合管中。肾小管上皮细胞肿胀坏死。尸检结果提示晶体肾病，支持MOF的临床诊断。

图1(A）患者肾实质中晶体的多种分布（HE，放大倍数100×）;（B）肾小管中的晶簇（HE，放大倍数400×）;（C）晶体在肾小管中排列（HE，放大倍数400×）。

3.2. 未知晶体的拉曼检测

肾组织拉曼检测示意图见图2A.在显微镜下发现晶体并收集拉曼光谱。通过将拉曼光谱与HORIBA数据库进行比较，确定该晶体为草酸钙二水合物（图2B），拉曼波段为 506、897、1464、1490 和 1633 cm−1，分别归因于O-C-O面内弯曲、C-C拉伸、C=O振荡、C-O对称拉伸和C-O不对称拉伸[24，25，26，27]。

图2(A） 晶体拉曼检测示意图。（B）将测量数据与HORIBA数据库进行比较，晶体为草酸钙二水合物。（C）组织切片、部分肾组织（I）、部分石蜡（II）和草酸钙二水合物晶体（III）的明场图像（放大倍数500×）。（D）与（C）对应的拉曼光谱数据。

在同一肾组织区域的不同位置进行拉曼光谱，如图2C.从定义明确的晶体（III）中观察到草酸钙二水合物的典型光谱。在晶体旁边的其他结构上发现了不同的光谱。显示肾组织的拉曼光谱图图2D（I）。还检测到石蜡的拉曼峰（图2D（II）），表明组织切片未完全脱蜡。这些结果表明，当对石蜡包埋组织进行拉曼光谱时，可能会记录残留石蜡的光谱并干扰拉曼检测。

3.3. 草酸钙二水合物晶体的重现性和拉曼成像

为了避免晶体组成的复杂性和从单个晶体获得的检测结果的误差，有必要检测肾组织中的多个晶体。为了测试所有这些晶体是否都是二水草酸钙，收集了20个随意选择的晶体的光谱。根据拉曼光谱数据，虽然20种晶体的强度不同，但均表现出草酸钙二水合物的特征拉曼光谱，而晶体的响应拉曼光谱没有明显变化（图3晶体是在生物体的代谢过程中自然形成的，因此每种晶体的含量和纯度可能不一样。

图3(A） 患者组织切片中 20 个随机晶体的拉曼光谱。（B）草酸钙二水合物晶体的拉曼映射（放大倍数1000×）。（C）草酸钙二水合物晶体的拉曼映射（放大倍数600×）。BF = 明场。

通过不同位置的成像验证了单个晶体的组成和纯度。根据成像数据，单晶中草酸钙二水合物的含量分布不均匀。一些晶体的拉曼强度在外围高于中心，而另一些则相反（图3B，C），这应与草酸钙二水合物晶体的成晶机理和条件有关。此外，结合明场图像，我们可以得出结论，明场图像可能表明晶体的位置和分布，但具体物质鉴定和含量评估需要拉曼光谱的辅助。拉曼成像可以清楚地确定晶体所含物质、位置分布和浓度变化。如图3B、C、草酸钙二水合物各晶体的含量和分布均不同且不均匀。

3.4. 拉曼光谱在活检中的应用

由于我们已经证明石蜡包埋组织中的草酸钙二水合物晶体可以通过拉曼光谱鉴定，我们想知道拉曼光谱是否可以进一步应用于临床活检样品。因此，通过口服草酸盐建立晶体肾病小鼠模型，以获得新鲜的活检标本。为了避免包埋介质可能产生的干扰，我们首先通过拉曼光谱扫描了两种常用的包埋介质OCT和CMC-Na。在相同的检测条件下，CMC-Na的拉曼峰均低于OCT（图S1），表明CMC-Na的含量物质和化学物质较少，可能对组织检测造成干扰。因此，选择CMC-Na进行后续测试。

用草酸管饲后1 h、6 h、12 h或24 h处死小鼠，其他5只小鼠在24~48 h后全部死亡。收集肾脏并加工成冷冻切片并用HE染色。在光学显微镜下，在1小时处死的小鼠中可以发现很少且微小的晶体。此后，晶体的数量和直径逐渐增加。在24小时后死亡的小鼠肾小管腔中可以发现并阻塞大块晶体（图4).与检测石蜡包埋组织中草酸钙二水合物晶体的方法相同，我们在新鲜活检标本（20小时）上随机选择12个晶体并收集拉曼光谱（图S2）。结果表明，无论晶体的序列号如何，所有光谱的一般光谱特征与二水草酸钙的特征拉曼光谱相同。拉曼光谱强度出现一些变化是正常的，因为不同晶体中草酸钙二水合物的含量不同。然而，拉曼光谱法测定草酸钙二水合物晶体的可行性、准确性和稳定性均不受影响。此外，通过拉曼成像（图4).晶体的组成为草酸钙二水合物，晶体中草酸钙二水合物含量分布不均匀。单晶的拉曼强度呈从最强中心向弱向外逐渐减小的规律。随着时间的推移，草酸钙二水合物含量和晶体直径逐渐增加，结果与HE染色相似。通过拉曼成像获得的草酸钙二水合物晶体的位置和分布比明场图像更直观、更清晰，没有主观判断或遗漏。与人类样品相比，口服草酸盐给药诱导肾小管中形成草酸钙二水合物含量较纯的晶体，这可能是由于晶体形成的单一机制。此外，除了活检样品中未使用石蜡外，在晶体检测过程中未发现包埋介质CMC-Na或其他干扰物质的干扰。

图4小鼠肾小管中形状不规则晶体的多重分布（HE，400×）和新鲜活检标本（放大倍数1000×）草酸钙二水合物晶体在不同时间点（1 h，6 h，12 h，24 h和死亡时间）的拉曼映射。

4. 讨论

本研究首次建立了基于拉曼光谱的石蜡包埋组织和活检标本中草酸钙二水合物晶体的原位鉴定方法，并成功应用于烧伤患者肾脏中未知晶体的鉴定。

拉曼光谱通过保持组织的完整性，在鉴定组织中的晶体方面显示出很大的优势，不仅可以获得更全面、更完整的有用信息，还可以让组织复用于其他检测方法，减少所需组织样本量，从而限制对患者的损害， 以及样品制备的成本。拉曼光谱为晶体鉴定提供了一种即时、方便和快速的方法。从组织中获取的拉曼数据与数据库中的标准图形进行比较，这极大地确保了准确性和可靠性。此外，通过拉曼映射可以获得清晰直接的晶体边界，使其适用于确定活检样品中晶体的位置和分布。因此，拉曼光谱在临床应用中具有重要的现实意义。在我们的研究中，拉曼光谱被成功验证可用于石蜡切片的晶体鉴定，并可用于临床病理学和法医病理学。

活检标本以及死后病理检查中石蜡包埋组织中晶体的鉴定主要依赖于形态学观察。草酸钙二水合物晶体在偏振光显微镜下显示折射率，这被认为是草酸钙二水合物的特征[22，28]。然而，形态学鉴定需要病理学家的经验，如果晶体看起来不典型，可能会与其他晶体混淆，特别是在活检标本中，这需要病理学家在相当有限的显微镜视野下进行诊断。此外，及时鉴定活检标本中的晶体可以帮助临床医生了解肾功能不全的机制，并进一步指导治疗策略。因此，为了建立一种快速准确的晶体鉴定方法，引入了拉曼光谱，并被验证为我们研究中的一种有价值的方法。一方面，使用我们的方法，活检样本的制备与临床病理学中使用的制备相同。因此，一旦患者需要进行活检，我们就可以通过拉曼检测方法使用相同的活检标本进行晶体鉴定，而不会延长活检伤口或给患者带来更多痛苦。另一方面，我们的方法不会占用太多时间或增加病理学家的工作量，因此他们仍然可以有效地进行病理诊断。拉曼光谱在临床病理学中的优势如下：（1）共聚焦拉面光谱的分辨率足够高，可以识别病理学家需要解析的微观结构;（2）与MS设备相比，拉曼光谱便宜得多，分辨率更高，似乎不可能用任何MS方法识别出我们报道的那么小的晶体;（3）拉曼光谱法速度快，数据库建立后可以准确;（4）拉曼光谱法不会破坏样品，因此，样品可以进一步用于其他检测。

肾小管晶体病被定义为2型晶体肾病，是肾小管腔内矿物质、蛋白质或药物沉淀的结果[29]。AKI相关的2型晶体肾病有一些常见原因，例如药物、饮食和肿瘤[23]。尚未报道大面积烧伤后由 2 型晶体肾病引起的 AKI 的发生。据报道，草酸钙晶体主要存在于饮食诱导的晶体肾病中，这些晶体肾病是草酸盐或富含维生素C的食物和饮料的代谢产物[22]。短肠综合征和遗传性疾病或草酸盐和乙二醇中毒等疾病也可能导致2型结晶肾病和AKI[22，28，30]。肾脏内微环境的变化（如pH值）可能是草酸钙晶体形成的主要原因[31]。虽然肝和肾功能受损被认为是烧伤患者的常见并发症，但在我们的病例中，由草酸钙二水合物晶体引发的AKI是加重因素，这是烧伤后AKI的新机制。在这种情况下，我们还想强调活检在AKI患者病因学发现中的可能价值。

草酸钙也是肉眼肾结石最常见的化学成分，通过肾间质中的结晶、晶体生长、晶体聚集、晶体-细胞粘附和晶体侵入来启动结石形成[32]。拉曼光谱已成功应用于分析通过手术获得的肉眼可见肾结石的矿物成分[24，25，26，27]。在我们对2型晶体肾病的研究中，小管中的晶体直径小至10-20μm，只能在显微镜下观察，不能以任何方式直接从组织中分离出来。因此，我们利用共聚焦拉曼显微镜在组织载玻片内晶体的原位鉴定中具有高分辨率和快速性的优势。此外，我们基于拉曼光谱的方法有望协助诊断由其他种类的晶体引起的2型晶体肾病，以及由阻塞肾血管系统的微晶体引起的1型晶体肾病。为了将我们的方法应用于临床和法医病理学，下一步是建立包含晶体肾病中常见晶体的拉曼光谱和不同类型晶体肾病典型样本的数据库。

但应注意消除石蜡的干扰，避免结果不准确。尽管通过拉曼光谱对组织中未知晶体的创新鉴定可以为临床诊断带来进步，但需要克服一些缺点，以使其成为更广泛应用的可靠和通用诊断技术。首先，标准拉曼光谱取决于自发过程中发生的非弹性光散射。自发拉曼信号相对较弱，经常被弹性光（瑞利）散射信号和组织荧光所淹没[33，34]。由于信号效率低，自发拉曼光谱通常需要高功率激光器，如果在错误的条件下使用，可能会对生物样品造成损坏、烧焦和其他不可逆转的后果[1]。其次，拉曼光谱可能无法准确识别和区分复杂的蛋白质结构，代谢物的检测可能会受到某些蛋白质成分或包埋剂的干扰。因此有必要引入特定的探头或其他诊断装置，以提高诊断的准确性和敏感性[11，13]。

5. 结论

总之，我们验证了拉曼光谱作为一种快速准确的组织晶体鉴定方法，有望在不久的将来应用于临床和法医实践。鉴于草酸钙二水合物晶体拉曼检测方法的成功开发，我们将继续开发基于拉曼光谱的方法，用于组织切片中其他类型的晶体的鉴定，以辅助法医学中临床活检的病理诊断和死因的尸检鉴定。

Yu Y, Jiang Q, Wan H, Li R, Sun Y, Zhang Z, Mao Z, Cao Y, Chen F. In Situ Identification of Unknown Crystals in Acute Kidney Injury Using Raman Spectroscopy. Nanomaterials (Basel). 2022 Jul 13;12(14):2395. doi: 10.3390/nano12142395. PMID: 35889619; PMCID: PMC9323692.

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