银杏内酯和白果内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF的表达影响

本研究采用线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注模型，从血管新生角度观察了银杏内酯ABC和白果内酯的神经保护作用。结果显示，银杏内酯ABC和白果内酯能明显改善缺血/再灌注后大鼠神经功能缺损症状，减小脑梗死范围，减轻组织形态学改变。

方法

制备Wistar大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）模型。将实验动物随机分为4 组：假手术组（Sham组）、MCAO+盐水对照组（Saline组）、MCAO+银杏内酯ABC组（10 mg/kg，GK组）和MCAO+白果内酯组（10 mg/kg，BB组）。每组动物于脑缺血再灌注前30 min腹腔给药，Sham组和Saline组给予等量生理盐水。缺血2 h再灌注12 h后，对大鼠神经功能缺损进行评分。通过TTC染色观察脑梗死体积变化，应用免疫组化及Western blot检测各组大鼠缺血侧脑皮质区VEGF及其受体VEGFR-1的表达。

结果

1. 脑梗死范围及神经功能缺损

TTC染色结果显示，Sham组脑组织未见梗死灶，Saline组脑组织梗死面积百分比为（41.09±1.33）；与Saline组相比，GK组和BB组脑梗死范围减小（梗死面积百分比分别为23.8±0.58和26.97±0.73）（P＜0.01），提示银杏内酯ABC和白果内酯对缺血/再灌注脑损伤有确切的保护作用。

在神经功能损伤方面，Sham组无神经系统损害症状，Saline组均出现明显的神经功能缺陷表现，GK组和BB组则明显改善大鼠神经症状（P＜0.01，P＜0.05），提示银杏内酯ABC和白果内酯对大鼠神经功能损伤有明显的改善作用（见表1、图1）。

2. 血管内皮生长因子（VEGF）及血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）蛋白的表达变化

与Sham组相比，Saline组VEGF蛋白含量明显下降，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。与Saline组相比，GK组和BB组的VEGF蛋白表达显著增多，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。VEGFR-1蛋白的表达在各组间表达量基本相同，各组间差异无统计学意义（见图2）。

3. 组织形态学表现

组织切片经HE染色，于400×光镜下观察。Sham组未见明显病理改变，各种神经细胞层次清晰，细胞数量、形态多样化，胞核界限清晰，胞质均匀，可清晰见到细胞核。Saline组见大鼠脑缺血中心区大量神经元变性坏死，细胞排列紊乱，形态不规则，可见部分神经元胞质浓缩， 胞核固缩、碎裂或溶解。GK组和BB组与Saline组相比，梗死区缩小，神经元损伤程度减轻，细胞排列尚规则，残存的细胞形态相对正常，GK组残留的神经元细胞数较BB组稍多（见图3）。

4. VEGF及VEGFＲ-1阳性细胞的表达变化

组织切片经免疫组化染色，于400×光镜下观察。Sham组可见少量VEGF及VEGFR-1表达阳性细胞，分布在脉络丛及软膜等处。缺血2 h/再灌注12 h后，基底节处缺血病灶区可见VEGF及VEGFR-1免疫阳性神经细胞数量明显增加，主要分布在缺血病灶周边的神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等。阳性细胞胞浆内呈明显棕黄色着色。GK组和BB组较Saline组阳性表达部位相似，阳性表达率较Saline组显著增高（见图4）。

讨论

此前的研究证明，受损的脑组织可出现再塑性。神经元发生的机制均与血管再通有重要的相关性，所以血管生成可以为大脑修复提供新的思路。VEGF是内皮细胞的有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖、加速新生血管形成、提高血管通透性等生物学特性，有类似于血管源性的神经保护和神经营养作用。在脑缺血发生后，VEGF能诱导新生血管形成，并使新生血管从正常组织向半暗带及缺血中心区延伸，增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减轻脑缺血损伤。

有研究发现，VEGF参与了局部梗死周边区的微血管形成作用和血液供应的改善。VEGF还可间接地促进神经细胞再生并抑制细胞凋亡。目前己经证实，缺血及移植损伤能显著上调神经元及星状细胞VEGF的表达。在多种生理和病理情况下以旁分泌的形式作用于血管内皮细胞上的受体，产生不同的生物作用，包括：①诱导内皮细胞增殖、分化和迁移，以及体内血管的生成；②增加血管通透性；③促进血管支持物的生成等。

VEGFR-1主要位于血管内皮细胞上，其胞外部分对VEGF具有很高的亲和力，能以可溶形式存在。VEGF主要通过VEGFR-1在内皮细胞上发挥作用，促进内皮细胞增殖、迁移、微血管管型结构形成及成熟血管生成。

本研究免疫组化及Western blot结果证明，大鼠缺血再灌注损伤后，缺血侧皮质区VEGF的表达明显提高，这可能是机体对抗缺血缺氧所致脑组织损害的一种自身保护方式。而银杏内酯ABC和白果内酯能刺激机体VEGF分子表达上调，从而增强其诱导血管生成的功能，促进了新生血管的形成和侧支循环的重建，进而增加局部脑血流量，提高脑组织对葡萄糖和氧的摄取，加快神经功能缺损的恢复并有效缩小脑梗死的最终体积。

免疫组化结果显示，在GK组和BB组中，VEGFR-1的阳性细胞数较Saline组明显增多，表明银杏内酯ABC和白果内酯在促进VEGF表达的同时，还能通过促进其受体的表达，进一步增强缺血区血管生成。

综上所述，本研究选用了单一成分的银杏内酯ABC和白果内酯进行研究，并比较了两者的作用差异。从血管新生的角度，两者可有效促进血管生成，且银杏内酯ABC组具有更显著的变化趋势。本研究证实，银杏内酯ABC和白果内酯可以通过刺激血管内皮生长因子表达上调，进而促进新生血管形成，在脑梗死再灌注损伤中发挥神经保护作用，这可能为脑梗死患者的治疗和预防提供新的靶点。

文献来源：

1. 刘秀萍，邓方. 银杏内酯和白果内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF的表达的影响[J]. 中风与神经疾病杂志，2015，32（2）：108-111.